CC BY
126
УДК 619:576.858:57.086.83 И.Я. Строганова, Т.И. Глотова, А.Г. Глотов
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР К РАЗЛИЧНЫМ ШТАММАМ РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОГО ВИРУСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
В статье представлены обобщенные результаты исследований по изучению чувствительности разных культур клеток к двум штаммам респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота. Ключевые слова: респираторно-синцитиальный вирус, крупный рогатый скот, культура клеток.
I.Ya. Stroganova, T.I. Glotova, A.G. Glotov
CELLULAR CULTURE SENSITIVITY TO VARIOUS STRAINS OF RESPIRATORY AND CYNCYTIAL CATTLE VIRUS
The generalized research results on study of different culture cell sensitivity to two strains of respiratory and cyncytial cattle virus are given in the article.
Key words: respiratory and syncytial virus, cattle, cell culture.
Респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота (КРС) наносят огромный экономический ущерб животноводству [1]. В хозяйствах мясо-молочного направления они чаще протекают по типу энзоотической бронхопневмании. В связи с тем, что многие их возбудители убиквитарны, а взрослые животные часто имеют иммунитет, респираторные болезни чаще возникают у телят в период снижения пассивного иммунитета и выработки активного [2].
Одним из возбудителей, вызывающих болезни органов дыхания у КРС, является вирус респираторносинцитиальной инфекции (РСИ), РНК-содержащий, относящийся к семейству паромиксовирусов, роду пневмовирусов. Клинически болезнь проявляется в основном поражением нижних отделов респираторного тракта, повышением температуры, затруднённым дыханием, выделениями из носа, сильным кашлем с последующим развитием бронхопневмонии и интерстициальных эмфизем [3-5].
Вирус впервые был выделен в 1970 г. от крупного рогатого скота с симптомами острого респираторного заболевания. В настоящее время РС-инфекция крупного рогатого скота зарегистрирована во всех странах мира с развитием животноводства, а с 1975 г. и в нашей стране [3-8].
В отличие от других вирусных респираторных инфекций это заболевание остаётся недостаточно изученным. Ее изучение длительное время сдерживалось трудностями, связанными с чрезвычайной лабильностью вируса и очень слабой его способностью к размножению в культурах клеток.
Сложности выделения и культивирования вируса, в свою очередь, затрудняют получение вирусного сырья в достаточном количестве и с высокой инфекционной активностью для изготовления диагностических препаратов и средств специфической профилактики.
Сообщения ряда авторов свидетельствуют о возможности накопления РС-вируса крупного рогатого скота в различных культурах клеток:
- органных культурах клеток трахеи и легких плода крупного рогатого скота [9];
- первично-трипсинизированных культурах легкого, тимуса эмбриона крупного рогатого скота, тестикул бычка [10-12];
- диплоидной культуре клеток щитовидной железы ягненка [13];
- перевиваемых линиях клеток: носовых раковин крупного рогатого скота, двенадцатиперстной кишки и прямой кишки теленка, Не1_а, почки зеленой мартышки, почки эмбриона овцы, А11ВЕК [11; 14-15]. Инфекционный титр различных штаммов РСВ в разных культурах клеток при этом составляет 1,0-4,0 1д ТЦД5о/мл.
Однако эти же литературные данные указывают и на то, что не все клетки одинаково чувствительны к РС-вирусу КРС и то, что степень чувствительности клеточных культур зависит от используемого штамма вируса [9-15].
Цель исследований. Изучение чувствительности разных культур клеток к двум штаммам РС-вируса крупного рогатого скота.
Материалы и методы исследований. В опытах использовали штамм «РС-Б» и штамм «К-18,У-406» респираторно-синцитиального вируса КРС.
В работе использовалась органная культура клеток эксплантантов легкого эмбриона коровы (ЭЛЭК); монослойные первично-трипсинизированные культуры клеток: почки, легкие, тимус эмбриона коровы (ПЭК, ЛЭК, ТЭК), тестикулы бычков (ТБ) и их субкультуры; диплоидные культуры клеток селезенки эмбриона коровы (СзЭ), тимуса эмбриона коровы (ТзЭ), легких эмбриона коровы (ЛзЭ), почки эмбриона коровы (ПзЭ) и легкие эмбриона коровы (ДЛЭК); перевиваемые линии слизистой носа эмбриона коровы (FBN), слизистой прямой кишки эмбриона коровы (FBG), слизистой трахеи эмбриона коровы (FBTR), почки теленка (Т-1), почки коровы (МДВК), почки теленка (Taurus), коронарных сосудов теленка (КСТ), почки теленка (ПТ), тестикулы эмбриона бычка (ТЭБ), легкие эмбриона коровы (ПЛЭК), почки эмбриона овцы (FLK), почки зеленой мартышки (46/47), почки обезьян макаки-резуса (МА-104), почки зеленой мартышки (Vero), фибробластов куриных эмбрионов (CEF), почки хомячка (ВНК-21), карциномы человека (He La).
Для культивирования клеток и вируса использовали питательные среды ГЛА, 199, Игла (с добавлением 3 % глютамина), Игла МЕМ, 10хИгла МЕМ, RPMI-1640 с добавлением 10,5 и 2 % сыворотки крови КРС, телят, северных оленей, фетальной КРС, цыплят. Для отмывания монослойных культур клеток использовали раствор Хенкса. В среды и растворы добавляли антибиотики в общепринятой концентрации. При выращивании культур клеток и для культивирования вируса использовали 0,25 % раствор трипсина, 0,01 % раствор химопсина в 0,02 % растворе версена, 7,5 % раствор бикарбоната натрия.
Инфекционную активность РС-вируса в культуре клеток определяли титрованием в соответствующей или чувствительной культуре клеток по цитопатическому действию (ЦПД): пробирочным и микрометодом, расчет инфекционного титра вируса проводили по методу [16] и выражали в ТЦД 50/мл (50 % тканевая цито-патическая доза).
Для штамма « К-18, V-406» при выделении и определении инфекционной активности использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР).
Выделение РНК вируса, обратную транскрипцию (ОТ) и амплификацию (ОТ-ПЦР) проводили согласно наставлению по применению тест-системы для выделения РСИ КРС методом ПЦР, разработанной сотрудниками ГНУ ИЭВС и ДВ Россельхозакадемии. Авторы использовали праймеры на высококонсервативный ген протеина F РВС КРС. В лабораторных испытаниях чувствительность ПЦР составила 10 ТЦД 50/мл [17].
Чувствительность культур клеток к РС-вирусу штамма «РС-Б» определяли с учетом времени проявления ЦПД и инфекционной активности вируса в пяти серийных пассажах. Адаптировали вирус в чувствительной культуре клеток в 15-20 серийных пассажах. Исходный титр вируса при заражении составлял 1,53,0 lg ТЦД 50/мл. Культивировали вирус при температуре 37 0С в стационарных условиях. Штамм РСВ «К-18, V-406» культивировали при 37 0С в условиях 5 % СО2.
Результаты исследований и их обсуждение. При выборе чувствительной системы для РС-вируса КРС штамма «РС-Б» исследовали 27 видов культур клеток.
В результате проведенных исследований оказалось, что штамм «РС-Б» РС-вируса крупного рогатого скота репродуцировался во всех используемых в опытах культурах клеток: ТЭК, ПЭК, ЛЭК, ТБ и их субкультурах. В большем инфекционном титре вирус накапливался в культуре клеток ЛЭК (3,36±0,17), затем в ПЭК (3,20±0,15) и в ТБ (3,04±0,04). Наименьшее накопление вируса было отмечено в органной культуре клеток ЭЛЭК. Дальнейшее изучение индивидуальной чувствительности первичных культур клеток ЛЭК, ТБ, ПЭК показало, что из 27 серий зараженных клеточных культур ЛЭК, 30 серий ТБ и 26 серий ПЭК, ЦПД не проявилось в 3 (11,1 %), 5 (16,7%), 5 (19,2 %) сериях соответственно. Все взятые в опыт диплоидные культуры клеток были чувствительны к штамму «РС-Б», но большей чувствительностью обладали культуры клеток Л5Э (3,98±0,38) и П5Э (3,96±0,33), в которых проявлялось характерное для РС-вируса ЦПД на 2-4 сутки после заражения на протяжении пяти пассажей. В данных культурах клеток был отмечен максимальный титр вируса. Культуры клеток ТзЭ и СзЭ и особенно ДЛЭК способствовали слабой репродуктивной активности вируса.
Из перевиваемых линий клеток крупного рогатого скота оказались не чувствительными к штамму FBG, FBN, FBTR. Низкочувствительными к штамму были МДВК, ПЛЭК и КСТ.
Чувствительной к РС-вирусу оказалась линия Т-1 (3,63±0,11), в которой на протяжении пяти пассажей было выражено ЦПД и ПТ, титр вируса в которой составил 3,43±0,09 lg ТЦД 50/мл.
Из двух клеточных линий обезьяньего происхождения слабую чувствительность к штамму «РС-Б» проявила культура МА-104, чувствительной оказалась линия 46/47/(3,40±0,11).
Наиболее чувствительной к штамму «РС-Б» оказалась клеточная линия овечьего происхождения FLK, титр вируса в которой составил 3,74±0,12 lg ТЦД 50/мл. В перевиваемой линии CEF вирус выявляли лишь в первых трех пассажах.
Линии клеток ВНК21 и HeLa были слабо чувствительными к штамму и накопление вируса в этих культурах снижалось при дальнейшем пассировании.
В дальнейшей работе со штаммом «РС-Б» не было возможности использования первично-трипсинизированных и диплоидных культур клеток.
Поэтому после адаптации штамма на протяжении 15-20 пассажей к перевиваемым линиям клеток FLK, Т-1, ПТ данные линии использовали для культивирования РС-вируса. Титр вируса в них в среднем составил 3,0-3,5 lg ТЦДбо/мл. При выделении и культивировании штамма «К-18, V-406» РС-вируса КРС были испытаны 9 культур клеток: первично-трипсинизированная ТБ и перевиваемые линии клеток Т-1, КСТ, Taurus, FBN, FBTR, МДВК, FLK, Vero.
Изолят К-18 выделили из легких 3-месячного теленка с признаками интерстициальной бронхопневмонии в первично-трипсинизированной культуре клеток ТБ. В связи с невозможностью получения культуры клеток ТБ для культивирования изолята вируса использовали перевиваемые линии клеток.
Наиболее чувствительной к вирусу оказалась перевиваемая линия клеток ТЭБ. В ней видимое ЦПД регистрировали после восьми «слепых» пассажей. Оно проявилось на 4-е сутки девятого пассажа в виде характерных для РСВ синцитиев. Результаты ОТ-ПЦР были положительными на протяжении всех пассажей. Инфекционный титр вируса на уровне девятого пассажа составил 3,5 lg ТЦД5о/мл. Выделение и культивирование вируса в других перевиваелых линиях клеток положительных результатов не принесло. Однако чувствительность их к вирусу оказалась различной. Так, результаты ПЦР были положительными на протяжении двух «слепых» пассажей в культурах клеток FLK, МДВК, КСТ и Vero, после чего вирус не выявляли. Линии клеток Taurus, T-1, FBN и FBTR оказались нечувствительными к вирусу. Вирус в них не выявили в ПЦР с первого пассажа.
В дальнейшем изолят К-18 был нами депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУ Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под наименованием «Штамм вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота К-18, V-406».
Выводы
1. Наиболее чувствительными к штамму «РС-Б» РС-вируса крупного рогатого скота оказались диплоидные культуры клеток легкого (Л5Э) и почки (П5Э) эмбриона коровы, перевиваемые линии почки эмбриона овцы (FLK), почки теленка (Т-1), почки теленка (ПТ) и первично-трипсинизированная культура клеток легкого эмбриона коровы (ЛЭК). Титр вируса в культурах составил 3,98+0,38; 3,96+0,33; 3,74+0,12; 3,63+0,11; 3,43+0,09; 3,3б+0,17 lg ТДЦ 50/мл соответственно.
2. Для штамма «К-18, V-406» эффективным оказалось выделение на первично-трипсинизированной культуре клеток ТБ. Для адаптации и культивирования чувствительность проявила перевиваемая линия клеток ТЭБ, обеспечивающая накопление вируса в титре 3,5 lg ТЦД5о/мл.
Литература
1. Гулюкин М.И., Юров К.П., Караваев Ю.Д. Система ветеринарно-санитарных, профилактических и лечебных мероприятий против инфекционных болезней рогатого скота в хозяйствах Российской Федерации. - М., 2007. - C. 14.
2. Крюков Н.Н., Зудилина З.Ф., Евдокимов С.И. Вирусные респираторные болезни крупного рогатого скота // Ветеринария. - 1976. - № 6. - С. 111-113.
3. Baker J.С. Bovine respiratory syncytial virus // Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice. -1997. - Vol. 13. - P. 425-454.
4. Larsen G.E. Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV): Areview // Acta vet.scand. - 2000. - Vol. 41. - P. 1-24
5. Valarcher J.F., Taylor I.G. Bovine respiratory syncytial virus infection // Vet.Res. - 2007. - Vol. 8 - P. 153180.
6. Гуненков В.В., Халенев Г.А., Сюрин В.Н. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция // Животноводство и ветеринария. - М., 1975. - Т. 8. - C. 70-76.
7. РНГА в серодиагностике респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота / А.В. Васильев, Н.Г. Осидзе, Н.В. Сюрин [и др.] // Ветеринария. - 1988. - № 10. - С. 33-34.
8. Строганова И.Я., Глотов А.Г. Распространение респираторно-синцитииальной инфекции крупного рогатого скота // Сиб. вестн. с.-х. науки. - 2009. - № 12. - С. 87-91.
9. Œalal V.D., Elazhary V. The pathogenesis of bovine respiratory syncytial virus infection in lung organ cultures // Abstrs79thAnnu. Mett. Amer. Soc. Microbiol. -Los.Angeles Calif. - 1979.
10. Westenbrink F., Brinkhof M.A., Stroser P.J. Comporaisonof a nevily developed enzyme-linked immunosor-bentassay with complement tixation and neutralization test for serology of bovine respiratory syncytial virus infections // Res.in veter Sc. - 1985. - Vol. 38. - № 3. - P. 334-340.
11. Bovine Respiratory syncytial Virus: Host Range in Laboratory Animals and Cell Cultures / М. Matumoto, Y. Inaba, H. Kurogi [et al.] //Arch.ges.virusforsch. - 1974. - Vol. 44. - P. 280-290.
12. Propagation of bovine respiratory syncytial virus in calftesticle microcarrier culture / Lj. Earlier,
G. Wellwmans, A. Lale [et al.] // Arch. exp. Veterinarmed. - 1984. - Vol. 38. - № 6. - P. 894-899.
13. Изоляция на респираторно-синцитиальния вирус от телят с репираторни заболевания / Х.Е. Харалам-биев, Р.М. Бостанжиева, Г.К. Георгиев [и др.] // Вет. мед. науки. - София, 1984. - T. 2. - C. 3-7.
14. Odegaard О.А., Krogsrud J. А field outbreak cauoed by bovine respiratory syncytial virus // Acta vet.scand. -1977. - Vol. 18. - P. 429-431.
15. Haralambiev H.E., Bostandjieva R.M., Georgiev Lj.K. Cultivation of bovine respiratory syncytial virus on cell line FLK and other cell cultures of sheep origin // Comptes rendus de 1 Akademie bulgare des Sciences. -1982. - Vol. 35/ 11. - P. 1611-1613.
16. Reed L.J., Muench H.A. A simple method of estimating 50 percent endpoints // Am.J. Hug. - 1938. - Vol. 27.
- P. 131-159.
17. Особенности диагностики респираторных болезней крупного рогатого скота, вызываемых РНК-
содержащими вирусами / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, И.Я. Строгонова [и др.] // Актуальные вопросы
ветеринарной медицины Сибири: мат-лы междунар. конф., посв. 70-летию ИЭВС и ДВ (п. Краснообск, 28-29 окт. 2010 г.). - Новосибирск, 2010. - С. 33-39.
УДК 619:616-091.8:636.52/58 Н.В. Донкова, Е.Г. Турицына
ЦИТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОНТАМИНАЦИИ ПТИЦЕВОДЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ ОСТАТКАМИ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
Авторами статьи изучено влияние лекарственных ксенобиотиков на органы гомеостатического обеспечения и контаминацию птицеводческой продукции остатками ветеринарных препаратов с использованием методов цитоморфологического анализа.
Ключевые слова: цитоморфология, лекарственные ксенобиотики, птицеводческая продукция.
N.V. Donkova, E.G. Turitsyna CYTOLOGICAL AND MORPHOLOGICAL FUNDAMENTALS OF THE POULTRY PRODUCTCONTAMINATION BY THE MEDICINAL PRODUCTRESTS
Medicinal xenobioticinfluenceon the homeostatic support organs and poultry productcontaminationby the veterinary preparationrests by means of the cytological and morphological analysis techniques is studied by the authors of the article.
Key words: cytomorphology, medicinal xenobiotics, poultry products.
Проблема загрязнения продуктов питания и продовольственного сырья остаточными количествами ветеринарных препаратов, в частности, антибиотиками, которые обнаруживаются в 15-26 % животноводческой и птицеводческой продукции, становится все более актуальной [1]. В связи с широким применением антибиотиков на птицефабриках Красноярского края в лечебно-профилактических целях, возникает необходимость оценки остаточных их количеств в мясе, субпродуктах и яйцах. Анализ лабораторных исследований подтверждает высокий уровень загрязненности антибактериальными препаратами птицеводческой продукции, поступающей из различных районов Красноярского края. Среди исследуемых антибактериальных препаратов наиболее часто выявляется тетрациклин. Он обнаруживается во всех видах пищевых продуктах, но наиболее часто в мясе и яйцах птицы, а также в продуктах их переработки.
