CC BY
80
ВестникКрасГАУ. 2012. №6
УДК: 619:616.988:75:636.22/28 И.Я. Строганова
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ГИПЕРИММУННЫХ СЫВОРОТОК К РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОМУ ВИРУСУ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Представлены результаты исследований по подбору биологической системы для получения специфических гипериммунных сывороток к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота.
Ключевые слова: респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота, гипериммунные сыворотки, белые мыши, морские свинки, бараны, кролики.
I.Ya. Stroganova
BIOLOGICAL SYSTEMS FOR PRODUCTION OF THE SPECIFIC HYPERIMMUNE SERUM TO THE CATTLE RESPIRATORY-SYNCYTIAL VIRUS
The research results on the biological system selection in order to produce the specific hyperimmune serum to the cattle respiratory - syncytial virus are given.
Key words: cattle respiratory - syncytial virus, hyperimmune serum, white mice, guinea pigs, sheep, rabbits.
Введение. В настоящее время в России возрастает удельный вес хозяйств по производству молока. Высокая молочная продуктивность коров часто сопровождается нарушением обмена веществ, что приводит к активизации различных инфекционных агентов [1,2].
Широкое распространение в молочных хозяйствах получили респираторные болезни животных [3,4].
Одним из этиологических агентов данной патологии является респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (РСВ КРС), относящийся к семейству Paramyxoviridae рода Pneumovirus. Во многих зарубежных странах его относят к числу наиболее важных патогенов молочного скота [5,6].
Первые сообщения о РСИ КРС в нашей стране относятся к 1975 году [7].
Изучение этой инфекции длительное время сдерживалось из-за высокой лабильности вируса и слабой его способности к размножению в культурах клеток, что, в свою очередь препятствовало разработке диагностических препаратов.
При разработке и применении диагностических тест-систем РНГА и РН необходимо наличие положительного контроля, то есть специфических сывороток к РС-вирусу крупного рогатого скота.
Цель исследований. Подбор биологической системы для получения специфических гипериммунных сывороток к РСВ крупного рогатого скота.
Материалы и методы исследований. Для получения специфических сывороток использовали биологические системы: белых мышей линии ВА1_В/С; морских свинок; баранов и кроликов.
Гипериммунизацию проводили культуральной вируссодержащей суспензией и концентрированным очищенным вирусом штамма «РС-Б» РС-вируса крупного рогатого скота.
Вирус культивировали в перевиваемых линиях клеток: почки эмбриона овцы (ПК); почки теленка (Т-1); почки зеленой мартышки (46/47); почки теленка (ПТ).
Для культивирования вируса применяли питательные среды Игла, Игла МЕМ с добавлением 2%-й фетальной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков по 100 ЕД/мл.
Инфекционную активность вируса определяли титрованием в чувствительной культуре клеток по ци-топатическому действию. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча (1937). Концентрировали и очищали РС-вирус по методу М.Тги^е! э1 а1.[8]. Электронную микроскопию осуществляли методом негативного контрастирования. Иммунизировали белых мышей линии ВМВ/е и морских свинок с учетом схемы, предложенной Л.Н. Астахавой и М.Г. Брайнингер [9].
Ветеринария
Активность полученных гипериммунных сывороток определяли в реакции нейтрализации (РН) и реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). РН ставили по общепринятой методике, РНГА в соответствии с наставлением.
Результаты исследований и их обсуждение. Гипериммунизация белых мышей линии BALB/с ви-руссодержащей культуральной суспензией РСВ с титром инфекционности 4,0 1д ТЦД 50/мл желаемых результатов не принесла. Поэтому в дальнейшем с этой целью использовали концентрированный и очищенный препарат РС-вируса по методу М. Тп^е! et а1. [8].
Вирус концентрировали полиэтиленгликолем (ПЭГ-6000) с последующим ультрацентрифугированием в 20-60%-м градиенте плотности сахарозы и хранили при минус 70°С. Контроль препарата осуществляли электронной микроскопией (рис.).
Препарат концентрированного и очищенного вируса. Негативное контрастирование. Увеличение 30000
Иммунизировали морских свинок с учетом схемы, предложенной Л.Н. Астаховой и М.Г. Брайнингер [9].
Полученный PC-вирусный антиген вводили интраназально четыре раза по 0,2 мл в каждый носовой ход с интервалом в 7 дней. Сыворотку от животных получали через 14 дней после последней иммунизации.
В сыворотках крови морских свинок до иммунизации антител к PC-вирусу крупного рогатого скота в РНГА не обнаруживали.
Из полученных данных следует, что концентрированный и очищенный препарат вируса «РС-Б» не обладал ярко выраженной антигенной активностью для морских свинок при указанном способе иммунизации. На его введение у животных синтезировались вируснейтрализующие антитела в разведениях 1:4 - 1:16 и средний титр составил 2,22±0,11 lg2.
Учитывая недостаточный титр антител в полученных сыворотках на мышах и морских свинках, необходимо было подобрать другую биологическую систему для получения специфических сывороток к РСВ КРС. По имеющимся данным Г.Д. Метревели [10], для получения гипериммунных сывороток к штамму «М-82» РСВ КРС автор использовала телят, овец, коз, кроликов и морских свинок.
В наших исследованиях для получения гипериммунных сывороток мы использовали баранов и кроликов (табл.).
Перед введением вируса штамма «РС-Б» РСВ КРС исследовали сыворотки крови баранов и кроликов в РНГА на наличие антител к РСВ и получили отрицательные результаты.
Первый раз барана иммунизировали культуральной вируссодержащей суспензией с титром вируса 3,0-4,0 lg ТЦД 50/мл, что желаемых результатов не принесло. Затем использовали концентрированный препарат РСВ КРС с 5%-м полиэтиленгликолем с последующим центрифугированием при 6,5 тыс. об/мин в тече-
Вестник^КрасТЯУ. 2012. №6
ние 40 мин, который вводили с адъювантом Фрейнда 1/1. Иммунизировали дважды, вводили препарат по 20 мл внутримышечно с интервалом 14 дней. В дальнейшем иммунизировали трижды с интервалом в 14 дней. Через две недели после последней иммунизации брали кровь для получения сыворотки, которую исследовали в РНГА и РН. Титр антител к РСВ КРС составил 11,02±0,05 lg2 и 6,08±0,09 lg2 соответственно.
Титры антител в сыворотках крови баранов и кроликов, гипериммунизированных РС-вирусом
крупного рогатого скота (п=3)
Биологические системы Количество Титры антител lg2 M±m; Р<0,05
РНГА РН
Бараны: до иммунизации осле иммунизации 3 3 11,02±0,05 0 6,08±0,09
Кролики:
до иммунизации 3 - 0
после иммунизации 3 10,05±0,07 5,38±0,16
Примечание: - - не выявлены антитела; 0 - не исследовали.
Кроликов гипериммунизировали трижды: с интервалом 14 дней вводили препарат концентрированного вируса, обработанного ультразвуком с адъювантом Фрейнда 1/1 по 2 мл внутримышечно. Через две недели после последней иммунизации брали кровь, получали сыворотку и исследовали в РНГА и РН, титр антител составил 10,05±0,07 lg2 и 5,38±0,16 lg2 соответственно.
Выводы. Были подобраны биологические системы для получения специфических гипериммунных сывороток к РСВ КРС - бараны и кролики, на них получали сыворотки с титром антител в реакции нейтрализации 6,08±0,09 lg2 и 5,38±0,16 lg2, которые и использовали в дальнейшей работе.
Литература
1. Шахов А.Г., Самохин В.Т. Нарушение обмена веществ у стельных коров // Мат-лы круглого стола отд. вет. медицины РАСХН. - М., 2000. - С. 10-14.
2. Федоров Ю.Н. Иммунный статус и инфекционные болезни новорожденных телят и поросят // Ветеринария. - 2006. - № 11. - С. 3-5.
3. Глотова Т.И. Инфекционный ринотрахеит и вирусная диарея крупного рогатого скота (диагностика, молекулярно-биологические свойства возбудителей, эффективность противовирусных препаратов): автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - Новосибирск, 2006. - 39 с.
4. Глотов А.Г., Глотова Т.И. Респираторные болезни телят вирусно-бактериальной этиологии // РАСХН, Сиб. отд-ние, ИЭВСиДВ. - Новосибирск: Агрос, 2008. - 258 с.
5. Larsen L.E., Tjornehoj K., Viuff B. Extensive sequence divergence among bovine respiratory syncytial viruses isolated during recurrent outbreaks in closed herds // Journal of Clinical Microbiology. - 2000. - Vol. 38. -P. 4222-4227.
6. Brodersen B.W. Bovine respiratory syncytial virus // Vet Clin North Am Food Anim. Pract. - 2010. - Vol. 26. - Р. 323-333.
7. Гуненков В.В., Халенев Г.А., Сюрин В.Н. Респираторно-синцитиальная инфекция // Животноводство и ветеринария. - М., 1975. - Т.8. - С. 70-76.
8. Comparison of caprine, human and bovine strains of respiratory syncytial virus / M. Trudel [et al.] // Arch. Virol. - 1989. - Vol. 107. - P. 141-149.
9. Астахова Л.Н., Брайнингер М.Г. О методах иммунизации пригодных для серийного приготовления диагностических сывороток к РС-вирусу // Вопр. этиологии, эпидемиологии, патогенеза и диагностики вирусных заболеваний: сб. - Свердловск, 1976. - С. 3-9.
10. Метревели Г.Д. Биологические свойства вируса и серологическая диагностика PC-инфекции крупного рогатого скота: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 1989. - 19 с.
