CC BY
92
УДК 619:576.858:57.086.83
ОБНАРУЖЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОМ АКТИВНОСТИ РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОГО ВИРУСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
И.Я.СТРОГАНОВА, кандидат ветеринарных наук, доцент
Красноярский ГАУ E-mail:[email protected]
Резюме. Представлены результаты изучения постановки методов бляшек и фокусов для обнаружения и определения инфекционной активности респираторносинцитиального вируса крупного рогатого скота в культурах клеток. Установлено, что методы бляшек и фокусов позволяют более точно определить инфекционную активность вируса в культуре клеток, чем титрование по цитопатическому действию. Метод бляшек более сложен в постановке, но лучше подходит для селекционной работы с вирусом. Метод фокусов проще, поэтому его можно использовать для определения инфекционной активности респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культуре клеток.
Ключевые слова: респираторно-синцитиальный вирус, крупный рогатый скот, культура клеток.
Респираторные болезни крупного рогатого скота (КРС) наносят огромный экономический ущерб животноводству [1]. В хозяйствах мясомолочного направления они чаще протекают по типу энзоотической бронхопневмонии.
В связи с тем, что многие их возбудители убиквитар-ны, а взрослые животные в основном имеют иммунитет, респираторные болезни чаще возникают у телят в период снижения пассивного иммунитета и выработки активного [2].
Один из возбудителей, вызывающих болезни органов дыхания у КРС, - вирус респираторно-синцитиальной инфекции (РСИ), РНК-содержащий, относящийся к семейству паромиксовирусов, роду пневмовирусов.
Клинически болезнь проявляется в основном поражением нижних отделов респираторного тракта, повышением температуры, затрудненным дыханием, одышкой, выделениями из носа, сильным кашлем с последующим развитием бронхопневмоний и интерстициальных эмфизем [3-5].
Вирус впервые выделен М.Е Рассапс1 с соавторами в 1970 г от крупного рогатого скота с симптомами острого респираторного заболевания. Сегодня РС-инфекция крупного рогатого скота зарегистрирована во всех странах мира с развитым животноводством [3-8].
В отличие от других вирусных респираторных инфекций это заболевание изученно мало. Длительное время ее изучение сдерживали трудности связанные с чрезвычайной лабильностью вируса и очень слабой его способностью к размножению в культурах клеток [4].
Сложности выделения и культивирования, в свою очередь, затрудняют получение достаточного количества вирусного сырья с высокой инфекционной активностью для изготовления диагностических препаратов и средств специфической профилактики.
Цель нашего исследования - изучение методов обнаружения и определения инфекционной активности РС-вируса крупного рогатого скота в культурах клеток.
Достижения науки и техники АПК, №02-2011
Условия, материалы и методы. В опытах использовали штамм «РС-Б» респираторно-синцитиального вируса (РСВ) крупного рогатого скота, диплоидную культуру клеток почки эмбриона коровы (П5Э) и перевиваемую линию клеток почки эмбриона овцы (FLK).
Для культивирования клеток и вируса использовали питательную среду Игла MEM с добавлением 10- и 2 %-ной фетальной сыворотки крови КРС, антибиотиков по 100 ЕД/мл.
Инфекционную активность PC-вируса в культуре клеток определяли титрованием в соответствующей культуре клеток по ЦПД (цитопатическому действию): пробирочным и микрометодом, расчет титра проводили по Reed L. и Muench H.[9] и выражали в ТЦД 50/мл (50%-ная тканевая цитопатическая доза); методом бляшек по Прингл К. [10] и окрашенных фокусов по Calnek B.et al. [11], титр вируса выражали в БОЕ/мл и ФОЕ/мл соответственно.
Возможность количественного определения вируса герпеса индеек (ВГИ) путем подсчета фокусов (ФОЕ) в инфицированных культурах клеток известна давно. Поскольку размножение ВГИ при этом сопровождается развитием цитопатологии синцитиального типа, характерного и для PC-вируса, мы изучили воспроизводимость и чувствительность этого метода для PC-вируса крупного рогатого скота.
Разработку классического метода постановки бляшек под агаровым покрытием также проводили с целью дальнейшей селекционной работы с PC-вирусом крупного рогатого скота.
Учет результатов осуществляли на 5.. .7 сутки культивирования вируса.
Результаты и обсуждение. Более точное определение инфекционной активности РСВ КРС в культуре клеток обеспечивает метод бляшек (по сравнению с титрованием по ЦПД). Так, титр вируса по бляшкам в П5Э составил 4,0±0,25х104 БОЕ/мл (р<0,01), в FLK - 4,1±0,49х104 (р<0,05), а по ЦПД - 3,93±0,04 (р<0,001) и 3,90±0,08 (р<0,001) lg ТЦД50/мл соответственно.
Однако метод бляшек трудоемок, требует тщательного подбора ингредиентов и определенного навыка в постановке. Поэтому его лучше использовать для селекционной работы с РС-вирусом КРС. Это подтверждается способностью вируса образовывать в культуре клеток бляшки мелкого и более крупного размера (рис. 1).
Фокусы цитопатического действия вируса в куль-
Рис.1. Бляшки в культуре клеток FLK, зараженной штаммом «РС-Б» РСВ КРС (x2QQ).
59
Рис.2. Фокусы в культуре клеток FLK, зараженной штаммом туре, различаемые микроскопически как скопления клеток, образовывались на 3.4 сутки после заражения культуры. На 5.8 день, вследствие увеличения размеров и лизиса клеток, они становились более видимыми. Однако, если деструкция в центре фокусов была слабо выражена, то их учет без предварительной окраски оказался затруднен. Поэтому для выявления фокусов визуально, инфицированные клеточные культуры окрашивали 0,5 %-ным раствором амидового черного на 0,5 % -ной уксусной кислоте (рис. 2).
В фиксированных и окрашенных клеточных культурах фокусы ЦПД PC-вируса отчетливо были видны и визуально. Окраска их не изменяется при длительном хранении, что значительно облегчает учет и анализ полученных результатов.
Определение оптимальной продолжительности инкубации РС-вируса при окраске инфицированных культур показало, что в случае окрашивания через 3.4 суток после заражения вирусом, различать и подсчитывать фокусы визуально было трудно. На 5.6 сутки размеры
фокусов и возможность их визуального подсчета увеличивались. Инкубирование и окрашивание на 7.8 сутки приводило к дальнейшему росту размеров фокусов. Однако при этом образовывались вторичные фокусы или сливались первичные. Поэтомунаиболее целесообразна окраска зараженной клеточной культуры на 5.6 сутки инкубирования. Кроме того, указанный срок оптимален для накопления РС-вируса в культуре, что было выяснено в предыдущих исследованиях [12].
Результаты сравнитель-РС-Б» РСВ КРС (х130). ного определения инфекционной активности вируса штамма «РС-Б» в культуре клеток FLK показали, что метод титрования по фокусам несколько чувствительнее, чем титрование по ЦПД, и прост в учете. Титр вируса по фокусам составил 4,40±0,06 х 1045 ФОЕ/мл (р<0,001), а по ЦПД 3,96±0,02 lg ТЦД50/мл (р<0,001).
Выводы. Самые точные результаты при определении инфекционной активности РС-вируса крупного рогатого скота в культуре клеток обеспечивает применение методов бляшек и окрашенных фокусов.
Отработанный метод бляшек пригоден для селекционной работы со штаммами PC-вируса крупного рогатого скота.
Наиболее прост в постановке и учете из изученных методов - метод подсчета окрашенных фокусов. Его можно использовать для определения инфекционной активности штамма «РС-Б» и других штаммов PC-вируса крупного рогатого скота в культуре клеток. При этом оптимальный срок окрашивания зараженной клеточной культуры 5.6 сутки инкубирования.
Литература.
1. Гулюкин М.И., Юров К.П., Караваев Ю.Д.и др. Система ветеринарно-санитарных, профилактических и лечебных мероприятий против инфекционных болезней крупного рогатого скота в хозяйствах Российской Федерации // ГНУ ВИЭВ, ФГУ «Центр ветеринарии». - М. - 2007. - С.14.
2. Крюков, Н.Н., Зудилина З.Ф., Евдокимов С.И. Вирусные респираторные болезни крупного рогатого скота//Ветеринария. - 1976. - №6. - СП 1-113.
3. Baker J.C. Bovine respiratory syncytial virus//Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice. - 1997. - Vol.13. - P. 425-454.
4. Larsen L.E. Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV): A review//Acta vet.scand. - 2000. - Vol41. - P. 1-24.
5. Valarcher J.F., Taylor G. Bovine respiratory syncytial virus infection // Vet.Res. - 2007. - V0I.8. - P. 153-180.
6. Гуненков В.В., Халенев А.Г., Сюрин В.Н. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция //Животноводство и ветеринария. - М., 1975. - Т.8. - С.70-76.
7. Васильев А.В., Осидзе Н.Г., Сюрин В.Н. РНГА в серодиагностике респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота//Ветеринария. - 1988. - №10. - С.33-34.
8. Строганова И.Я., Глотов А.Г. Распространение респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2009. - №12. - С.87-91.
9. Reed L.J.A, Muench H.A. simple method of estimating 50 percent endpoints // Am.J.Hug. - 1938. - V.27. - P.493-497.
10. Прингл К. Пневмовирусы//Вирусология. Методы: Пер. с англ.; Под.ред Б.Мейхи. - М.: Мир. - 1988. - с.131-159.
11. Calnec B.W., Ljarrido E., Okazaki W. In vitro methods for assay of turkey herpes virus, et. al. V Avian Dis. - 1972. - V.16. - P.52-56.
12. Строганова И.Я. Адаптация респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота к перевиваемым линиям клеток //Социально-экологические проблемы природопользования в Центральной Сибири: мат. международной школы-конференции, 7-9 окт. 2008г.-Красноярск: Сибирский федеральный университет, 2008.-С.307-308.
DETECTION AND DEFINITION OF INFECTIUS ACTIVITY RESPIRATORNO-SINTSITIALNOGO OF THE VIRUS OF THE HORNED CATTLE IN CULTURE OF CAGESI.
I.Ya. Stroganova
Summary. Results of studying of statement of methods of plaques and focuses ля detection and definitions of infectious activity respiratorno-sintsitialnogo a horned cattle virus in cultures of cages are presented.
Key words: respirator sincitial virus, cattle, cell cultures.
60 Достижения науки и техники АПК, №02-2011
