CC BY
33
Биология к
Таблица 3
Биохимические показатели и их корреляция с сохранностью птицы (n = 10), X ± ¡J
Возраст птицы, сут гАсАТ гАлАТ гОБ rAlb гМочевина
1 0,95 ± 0,11* 0,84 ± 0,19* 0,86 ± 0,18* 0,88 ± 0,17* 0,95 ± 0,11*
7 0,95 ± 0,11* 0,93 ± 0,13* 0,91 ± 0,15* 0,85 ± 0,18* 0,91 ± 0,15*
23 0,77 ± 0,22 0,65 ± 0,27 0,91 ± 0,14* 0,89 ± 0,17* 0,78 ± 0,22*
42 0,91 ± 0,15* 0,82 ± 0,20* 0,88 ± 0,17* 0,83 ± 0,20* 0,88 ± 0,17*
Примечание: г — коэффициент корреляции между сохранностью цыплят и уровнем: гАсАТ — аспартат аминотрансферазы, гАлАТ — аланин аминотрансферазы; гОБ — общего белка; гА1Ь — альбуминов; гМочевина — мочевины; г* — достоверный.
Таблица 4
Корреляция абсолютного прироста бройлеров с сохранностью цыплят кросса ^А-15 (п = 10),
X ± р
на 7 и 23 сутки онтогенеза. Следовательно, данный возрастной интервал можно считать «критическим» в развитии птицы, что, вероятно, обусловлено конституциональными изменениями в их организме, разобщенностью и дискретностью обменных процессов, когда ювенальный метаболизм переключается на механизмы, свойственные постювенальным бройлерам с полным израсходованием эмбрионального трофического запаса и одновременно с формированием собственной полноценной иммунной системы.
Выводы.
Результаты наших исследований показали, что в условиях промышленной технологии выращивания мясных бройлеров «критическим» для сохранения здоровья птицы является возрастной период с 7-х по 23-е сутки, в который наблюдается снижение значений корреляции между биохимическими показателями крови и сохранностью птицы, уровнем приростов живой массы. В качестве диагностического критерия можно использовать концентрацию в крови АсАТ, АлАТ и мочевину, а также значения их корреляции.
Литература
1. Basilioa de V. [et а1.] Does early thermal conditioning sometimes fail to improve the resistance of broilers to heat stress? // Animal Research. 2002. № 5. Vol. 51. P. 407-420.
2. Joseph N. S., Moran E. T Increased hatcher temperature adversely affects chick quality and survival during production whereas final body weights and processing yields are unaffected [Text] // Poultry Science Assoc. Mtg. Jr. 2003. P. 5.
3. Faria Filho de D. E. [et а!.] Protein Levels for Heat-Exposed Broilers: Performance, Nutrients Digestibility, and Energy and Protein Metabolism // Poultry Science. 2007. № 6 (3). P. 187-194.
4. Колесник Е. А., Дерхо М. А. Сопряженность между приростом живой массы и биохимическими параметрами крови у бройлеров кросса ISA-15 [Текст] // Труды ВСМУиС. 2010. Т. 3. С. 56-64.
5. Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTIC A [Текст]. М. : Медиа Сфера, 2002. 312 с.
6. Уша Б. В., Беляков И. М., Пушкарёв Р П. Клиническая диагностика внутренних незаразных болезней животных: учебник. М. : КолосС, 2004. 487 с.
Возраст птицы, сут Абсолютный прирост, % Сохранность, % r
1 100 ± 0,05 99,2 ± 0,01 0,93 ± 0,13*
7 77,58 ± 0,00*** 98,7 ± 0,01*** 0,91 ± 0,15*
23 93,67 ± 0,01*** 96,0 ± 0,01*** 0,92 ± 0,14*
42 98,16 ± 0,00*** 96,1 ± 0,02*** 0,98 ± 0,07*
Примечание: *** — р < 0,001 по отношению к суточным цыплятам; г — коэффициент корреляции между абсолютным приростом живой массы бройлеров и сохранностью цыплят; г* — достоверный.
цитоморфологический метод
ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ КОНТРОЛЯ
размножения респираторносинцитиального рс-вируса крупного рогатого скота в культуре клеток
и. я. Строганова,
кандидат ветеринарных наук, доцент, Красноярский ГАУ
660049, г. Красноярск, пр. Мира, д. 88
Ключевые слова: крупный рогатый скот, респираторно-синцитиальный вирус. Keywords: cattle, respiratory syncytial virus.
Респираторные болезни крупного рогатого скота (КРС) наносят огромный экономический ущерб животноводству [1]. В хозяйствах мясомолочного направления они чаще протекают по типу энзоотической бронхопневмонии. В связи с тем, что многие их возбудители убиквитарны, а взрослые животные часто имеют иммунитет, респираторные болезни чаще возникают у телят в период снижения пассивного иммунитета и выработки активного [2].
Одним из возбудителей, вызывающих болезни органов дыхания у КРС, является вирус респираторно-синцитиальной инфекции (РСИ), РНК-содержащий, относящийся к семейству паромиксовирусов, роду пневмовирусов. Клинически болезнь проявляется в основном поражением нижних отделов респираторного тракта, повышением
температуры, затрудненным дыханием, одышкой, выделениями из носа, сильным кашлем с последующим развитием бронхопневмоний и интерстициальных эмфизем [3-5].
Вирус впервые был выделен М. F. Paccand с соавторами в 1970 году от крупного рогатого скота с симптомами острого респираторного заболевания. В настоящее время РС-инфекция крупного рогатого скота зарегистрирована во всех странах мира с развитым животноводством, в с 1975 г. и в нашей стране [3-8].
В отличие от других вирусных респираторных инфекций, это заболевание остается недостаточно изученным. Его изучение длительное время сдерживалось трудностями, связанными с чрезвычайной лабильностью вируса и очень слабой его
способностью к размножению в культурах клеток.
Сложности выделения и культивирования вируса, в свою очередь, затрудняют получение вирусного сырья в достаточном количестве и с высокой инфекционной активностью для изготовления диагностических препаратов и средств специфической профилактики.
Цель и методика исследований.
Целью настоящего исследования являлась отработка цитоморфологического метода исследования для обнаружения респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культурах клеток и для контроля размножения респираторносинцитиального РС-вируса крупного рогатого скота в культуре клеток.
Исследования проводились на кафедре
Биология
эпизоотологии и паразитологии института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского государственного аграрного университета и в ГНУ институте экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии.
В работе использовали два штамма РС-вируса крупного рогатого скота: отечественный «РС-Б» и японский штамм «^оті»,а также перевиваемые линии клеток: почки эмбриона коровы (МДВК) и почки эмбриона овцы ^К).
Для культивирования культур клеток и вируса среду Игла и Игла МЭМ с добавлением 10 %-ной сыворотки крови крупного рогатого скота или телят, а для культивирования вируса 2 %-ной фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота. Перед заражением отмывали монослойные культуры клеток раствором Хенкса. В среды и растворы добавляли антибиотики в общепринятой концентрации по 100 ЕД/ мл.
Препараты для цитоморфологического исследования готовили из культур клеток, выращенных на предметных стеклах во флаконах из-под антибиотиков, окрашивали гематоксилин-эозином по методу
О. В. Волковой, Ю. К. Елецкого (1971), подсушивали, монтировали на предметное стекло, заключая в канадский бальзам. Также готовили препараты из пробирочных культур клеток целлоидиновым методом, окрашивали гематоксилин-эозином по методу О. В. Волковой, Ю. К. Елецкого (1971), подсушивали и монтировали покровное стекло с культурой клеток на предметном стекле на канадском бальзаме. Изучали и фотографировали под световым микроскопом при увеличении х 70 и х 90.
Результаты исследований.
Для контроля размножения РС-вируса крупного рогатого скота в культуре клеток отрабатывали метод цитоморфологического исследования.
Первый из методов подготовки препаратов для цитоморфологического исследования с использованием культуры клеток МДВК проводили путем выращивания клеточных культур на покрывных стеклах в пробирках, а затем во флаконах из-под антибиотиков. После заражения культуры клеток вирусом наблюдали за проявлением ЦПД путем светового микроскопирования, а затем окрашивали препараты гемоксилин-эозином. Размещали высушенные препараты на предметных стеклах и заключали в канадский бальзам. Метод был достаточно трудоемок и сложен для учета ЦПД в процессе культивирования вируса.
Второй метод с использованием целлоидина в «чулке», любезно предложенный болгарскими исследователями,
впоследствии освоили и использовали в своей дальнейшей работе.
Пробирки с монослойной культурой клеток FLK на 3-5 день после заражения отмывали физиологическим раствором, затем фиксировали ацетоном. Ацетон сливали и заливали пробирки 10 %-ным раствором целлоидина на ацетоне. Целлоидин сливали при вращении перевернутой пробирки, заливали холодной водой и извлекали целлоидиновый «чулок». На предметное стекло с гипертоническим раствором глюкозы наклеивали препарат клетками к стеклу. Препарат подсушивали и помещали в ацетон на 10-15 минут для децел-лоидирования, после отмывали в воде 1-2 мин., окрашивали препарат гематоксилин-эозином, подсушивали и монтировали покрывное стекло на канадском бальзаме. В дальнейшем препараты изучали под световым микроскопом, сравнивая с контролем (незараженной культурой клеток).
Изучение морфологических изменений зараженной вирусом культуры клеток FLK проводили на примере двух штаммов «РС-Б» и <^оті» РС-вируса крупного рогатого скота.
Результаты изучения цитоморфологии показали, что размножение штаммов «РС-Б» и «^оті» РС-вируса крупного рогатого скота сопровождалось образованием ацидофильных цитоплазматических телец-включений, а также симпластов различного размера (рис. 1, 2, 3).
При этом у штамма «^оті» РС-вируса крупного рогатого скота процесс симпласто-образования в данной культуре клеток был выражен ярче, от 10-20 ядер, чем у штамма «РС-Б» (до 5 ядер).
Поражения ядер клеток или ядерные включения не наблюдали. В контрольных препаратах из незараженной культуры клеток обнаруживали только мононуклеарные клетки, в которых не находили цитоплазматических или ядерных включений.
Цитоморфологический метод позволил обнаруживать размножение РС-вируса крупного рогатого скота в культуре клеток и подтверждать специфичность вызванного им ЦПД. А также определять штаммы РС-вируса крупного рогатого скота, обладающие лучшей способностью репродуцироваться в культурах клеток и проявлять ЦПД.
Выводы.
Из двух методов подготовки препаратов для цитоморфологических исследований более приемлем пробирочный метод с использованием целлоидина и последующей окраской гематоксилин-эозином, который и использовали в дальнейшей работе.
Цитоморфологический метод исследования позволил обнаруживать
Рисунок 1
Культура клеток FLK на 6 сутки после заражения штаммом «РС-Б». Клетка с ярко выраженными цитоплазматическими включениями (х 1200).
©
W
Рисунок 2
Культура клеток FLK на 6 сутки после заражения штаммом «РС-Б». На фоне пораженного монослоя виден небольшой симпласт, состоящий из 5 ядер, расположенных по периферии цитоплазмы (х 1200).
Рисунок 3
Культура клеток FLK на 6 сутки после заражения штаммом «Nomi». Сипмласт с большим количеством ядер и включениями в цитоплазме (х 1200).
размножения РС-вируса крупного рогатого скота в культуре клеток и определять его наличие по специфичности вызванных им морфологических изменений клеток, образования цитоплазматических телец-включений и симпластов.
В процессе изучения цитоморфологии штамм «^оті» РС-вируса крупного рогатого скота проявил более ярко выраженное симпластообразование (от 10 до 20 ядер), чем штамм «РС-Б» (до 5 ядер).
Литература
1. Гулюкин М. И., Юров К. П., Караваев Ю. Д. [и др.] Система ветеринарно-санитарных, профилактических и лечебных мероприятий против инфекционных болезней крупного рогатого скота в хозяйствах Российской Федерации. М., 2007. С. 14.
2. Крюков Н. Н., Зудилина З. Ф., Евдокимов С. И. Вирусные респираторные болезни крупного рогатого скота // Ветеринария.
1976. № 6. С. 111-113.
3. Baker J. С. Bovine respiratory syncytial virus // Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice. 1997. Vol. 13. Р. 425-454.
4. Larsen L. E. Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV): A review // Acta vet. scand. 2000. Vol. 41. Р. 1-24.
5. Valarcher J. F., Taylor G. Bovine respiratory syncytial virus infection // Vet. Res. 2007. Vol. 8. Р. 153-180.
6. Гуненков В. В., Халенев А. Г., Сюрин В. Н. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция // Животноводство и ветеринария. М., 1975. Т. 8. С. 70-76.
7. Васильев А. В., Осидзе Н. Г, Сюрин В. Н. РНГА в серодиагностике респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота // Ветеринария. 1988. № 10. С. 33-34.
8. Строганова И. Я., Глотов А. Г. Распространение респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2009. № 12. С. 87-91.
9. Волкова О. В., Елецкий Ю. К. Основы гистологии с гистологической техникой. М. : Медицина, 1971. С. 201-205.
