CC BY
28
УДК 619:578.825.1:636.592:57.082.26
Ключевые слова: болезнь Марека, вирус герпеса индеек, дезагрегация монослоя, фибробласты эмбрионов кур (ФЭК)
Key words: Marek's disease, turkey herpesvirus, monolayer disaggregation, chicken embryo fibroblasts (CEF)
Шустова М. А., Ханюкова Е. Ю., Пяткина А. А.
ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБОВ ДЕЗАГРЕГАЦИИ КЛЕТОЧНОГО МОНОСЛОЯ, ИНФИЦИРОВАННОГО ВИРУСОМ ГЕРПЕСА ИНДЕЕК
study of methods for desaggregation of cell monolayer inoculated with turkey herpesvirus
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец
FGBI "Federal Centre for Animal Health" Address: 600901, Russia, Vladimir, Yurevets
Шустова Мария Алексеевна, вед. биолог, аспирант. E-mail: shustova@arriah.ru
Shustova Maria A., Leading Biologist, Postgraduate. E-mail: shustova@arriah.ru Ханюкова Елена Юрьевна, вед. биолог, аспирант Khanyukova Elena Ju., Leading Biologist, Postgraduate Пяткина Алла Александровна, к. б. н., ст. научн. сотрудник Pyatkina Alla A., Ph.D. in Biological Sciences, Senior Research Scientist
Аннотация. Приведены результаты исследований влияния различных способов дезагрегации монослоя культуры клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), инфицированного герпесом индеек, на инфекционную активность вируса. Выявлено, что диспергирование монослоя ФЭК, зараженного герпесом индеек, при помощи трипсина обеспечивает максимальное сохранение инфекционной активности вируса.
Summary. The results of the study of the effect caused by different techniques of disaggregation of HVT-infected CEF cell monolayer on virus infectivity are presented in the paper. It was established that disintegration of HVT-infected CEF monolayer using trypsin ensures the maintenance of the maximum virus infectivity.
Введение
При монослойном культивировании вирусов важным этапом является отделение инфицированных клеток от субстрата. В настоящее время для дезагрегации инфицированных культур клеток (КК) применяют физический, химический, энзиматический (ферментативный) и биологический методы. К физическим методам относят механическое соскабливание клеток с рабочей поверхности специальным скребком, крио-деструкцию и другие способы. Клетки, растущие в монослое на стекле или пластике, агрегируются между собой и прикрепляются к субстрату с помощью внеклеточного матрикса - мукопротеидов или коллагена. В связи с этим для отделения клеток с поверхности носителя (стекла) энзиматическим способом используют растворы различных протеаз, таких как трипсин, химотрипсин, проназа, коллагеназа и другие ферменты. К химическому методу можно отнести дезагрегирующее воздействие детергентов
(версен), а также различных солей, кислот, щелочей и хелатирующих агентов [1, 4]. Биологическая дезагрегация может быть результатом воздействия на монослой КК лимитирующих факторов культивирования клеток и вирусов (истощение питательной среды, снижение рН, изменение ионной силы среды, воздействие латентной инфекции и т. д.).
Результатом дезагрегации монослоя КК любым способом может быть не только разрушение межклеточных связей, но и повреждение клеточных оболочек и внутриклеточных структур, следствием которого становится гибель клеток [3, 4].
Источником получения вируса герпеса индеек (ВГИ) в производстве вакцин против болезни Марека (БМ) является инфицированная культура клеток фибробластов SPF-эмбрионов кур (ФЭК). Процедура отделения инфицированных клеток от субстрата является технологическим этапом, на котором происходят потери инфекционной активности вируссодержащего материала, что нега-
тивно сказывается на эффективности вакцин. Следовательно, выбор метода дезагрегации монослоя клеток, обеспечивающего минимальное снижение титра вируса, представляется актуальным.
Целью настоящих исследований было изучение зависимости инфекционного титра ВГИ от способа дезагрегации инфицированного клеточного монослоя.
Материалы и методы
Вирус. Вакцинный производственный штамм «Владимир № 124-Деп» ВГИ культивировали в первичной культуре клеток фи-бробластов SPF-эмбрионов кур.
Культура клеток. Первичную культуру клеток ФЭК получали путем трипсиниза-ции 11-суточных SPF-эмбрионов кур фирмы Lohmann (Германия). Культуру клеток выращивали в пластиковых флаконах фирмы Corning (25 см2) и роллерных сосудах (V = 3 дм3) при температуре (38,5±1) °С. Средняя посевная концентрация клеток была (1,0±0,3) млн/см3, объем засеваемой суспензии на сосуд - (270±30) см3, на культураль-ный пластиковый флакон - 10 см3. Образование монослоя происходило в течение 48-72 ч.
Получение вирусного материала. Инфицирующая доза вируса составляла 105 ФОЕ/см3 на сосуд. Для энзиматического и физического способов дезагрегации монослоя процесс считали завершенным через 48 ч., когда ци-топатическое действие вируса охватывало не менее 75 % площади монослоя. Для биологической дезагрегации клеточного монослоя культивирование продолжали до проявления ЦПД вируса более чем на 90 % площади монослоя.
Способы дезагрегации инфицированного монослоя клеток. Для дезагрегации монослоя энзиматическим методом использовали трипсин. Дезагрегацию физическим способом проводили путем замораживания с последующим оттаиванием. Для этого роллер-ные сосуды с инфицированным монослоем помещали на 1 час в холодильную камеру (минус 50 °С), после чего размораживали при комнатной температуре. Сущность биологического способа заключалась в длительном культивировании ВГИ до появления призна-
ков естественной дегенерации монослоя (лимитирующих факторов культивирования), в результате чего клетки отделялись от стекла путем интенсивного встряхивания. После дезагрегации инфицированного клеточного монослоя образцы вируссодержащего материала, полученные различными способами, концентрировали центрифугированием с последующим ресуспендированием осадков в равных объемах питательной среды.
Определение инфекционной активности вируса. Инфекционный титр вируса определяли по числу фокусообразующих единиц (ФОЕ) в монослое клеток КФ, выращенных во флаконах для культивирования КК. Использовали метод последовательных разведений вируссодержащей суспензии. Для оценки титра вируса устанавливали наименьшее разведение, при котором число ФОЕ было максимальным, без слияния фокусов. Величину титра определяли по следующей формуле:
Т = {[(Ь1 + Ь2 + ... + Ьп) / п] х 10а} / V,
где Т - титр вируса, ФОЕ/см3;
Ь1, Ь2, ... Ьп - количество фокусов во флаконе;
п - количество используемых флаконов;
V - объем суспензии вируса, внесенный во флакон, см3;
а - показатель степени разведения вирус-содержащего материала.
Растворы и реактивы. Использовали питательную среду, состоящую из равных частей сред 199, Игла и гидролизата лакталь-бумина на солевом растворе Хенкса (ГЛАХ). Для дезагрегации монослоя применяли 0,25 % раствор трипсина на солевом растворе Хенкса. К ростовой среде добавляли 10 % сыворотки крови крупного рогатого скота, а для поддерживающей среды концентрация сыворотки составляла 2-5 %. Величина рН ростовой и поддерживающей сред составляла 6,9-7,2.
Обработка результатов экспериментов. Использовали общепринятые методы вычисления средних значений и стандартных ошибок (±т) выборок варьирующих переменных [2].
Таблица.
Установление существенности контраста между инфекционными титрами ВГИ в соответствии со способом дезагрегации инфицированного монослоя КК ФЭК
Сравнение инфекционной активности ВГИ (lgT, ФОЕ/см3) в опытных группах
Группа № 1 Группа № 2 А = lgT - lgT2 Группа № 3 А = lgT - lgT3
5,48 4,94 0,54 4,51 0,97
5,34 5,05 0,29 4,72 0,62
5,28 4,40 0,68 4,38 0,90
5,53 4,78 0,75 4,49 1,04
5,73 4,99 0,74 4,72 1,01
Среднее значение A±m - 0,60±0,09 - 0,91±0,08
Значимость среднего контраста* - t = 6,67 > tp<0,Q5 = 2,31 - t = 11,4 > tp<0,05 = 2,31
Примечание: * - существенность среднего контраста определяли проверкой выполнимости неравенства, имеющего вид t > tp, где t = "Д/тд; 1р - табличное значение коэффициента Стьюдента, для избранного уровня значимости (р) и данного числа степеней свободы (V = п - 1).
Для вычислительных операций применяли программу Microsoft Excel.
Результаты исследований
Дезагрегацию клеточного монослоя проводили тремя способами. Для этого рол-лерные сосуды с культурой клеток ФЭК, инфицированной ВГИ, были поделены на 3 равные группы. В группе № 1 вируссо-держащие клетки отделяли от поверхности стекла ферментативным способом при помощи раствора трипсина; в группе № 2 -криодеструктивным (физическом) способом при температуре минус 50 °С; в группе № 3 - биологическим способом. За оценочный критерий способа дезагрегации инфицированного клеточного монослоя приняли показатель инфекционной активности вируса в собранных пробах материала. Результаты титрования представлены в таблице.
Обсуждение результатов
Из представленных в таблице результатов следует, что вируссодержащий материал с максимальной инфекционной активностью может быть получен путем отделения клеток от поверхности сосудов ферментативным способом. В биологическом смысле это означает, что трипсин действует на межклеточные связи в монослойной культуре, при этом повреждающее действие трипсина на вирус,
находящийся внутри клеток, оказывается минимальным.
Инфекционные титры вируссодержащего материала в группах № 2 и № 3 достоверно отличались (р < 0,05) от аналогичного показателя в группе № 1 и оказались в среднем в 4 и 8 раз ниже. Снижение титра в процессе дезагрегации путем замораживания-оттаивания без криопротектора можно объяснить повреждением не только межклеточных связей, но и самих клеток, что негативно влияет на биологическую активность ВГИ, тесно связанного с внутриклеточными структурами. Снижение инфекционного титра при биологическом способе дезагрегации, вероятно, можно объяснить особенностями ци-топатического действия ВГИ и воздействием лимитирующих факторов культивирования, при котором клетки теряют адгезивную способность, разрушаются, отделяются от рабочей поверхности, и вирус выходит в куль-туральную среду, где теряет инфекционные свойства.
Выводы
Ферментативный способ дезагрегации клеточного монослоя, инфицированного вирусом герпеса индеек, является оптимальным для сохранения инфекционной активности вируссодержащего материала.
При криодеструктивном (физическом) и биологическом способах отделения инфи-
цированного монослоя от поверхности куль-туральных сосудов наблюдали снижение инфекционного титра ВГИ от 4 до 8 раз соответственно.
Список литературы
1. Адамс, Р. Методы культуры клеток для биохимиков [Текст] / Р. Адамс. - М. : Мир, 1983. -С. 52-56.
2. Мисюк, Н. С. Корреляционно-регрессионный анализ [Текст] / Н. С. Мисюк, А. С. Мастыкин, Г. П. Кузнецов. - М. : Медицина, 1975. - С. 192.
3. Тихоненко, Т. И. Методические основы биохимии вирусов [Текст] / Т. И. Тихоненко. - М. : Медицина, 1973. - С. 219-222.
4. Шапхаев, Э. Г. Основы биотехнологии [Текст] / Э. Г. Шапхаев, В. Ж. Цыренов, Е. И. Чебунина // Дезинтеграция микробных клеток. - Улан-Уде, 2005. -С. 53-55.
Ветеринарное Дерматологическое Общество стран СНГ Российский ветеринарный журнал Журнал JSAP /Российское издание
Уважаемые коллеги!
Представляем вашему вниманию Российскую версию официального издания Европейского Общества Ветеринарной Дерматологии, Американской Академии Ветеринарной Дерматологии, Всемирной Ассоциации Ветеринарной Дерматологии -журнал «Veterinary Dermatology».
Главный редактор российского издания - Дипломант Европейского колледжа Ветеринарной Дерматологии, Президент Ветеринарного Дерматологического Общества стран СНГ, Заведующая дерматологическим отделением сети клиник «Белый клык» Кузнецова Е. С.
E-mail: info@logospress.ru Тел/факс: (495) 220-4816, 689-0575
Veterinary Dermatology
