CC BY
30
УДК 619:613.98:578.825.1:615.371
Ключевые слова: вирус герпеса индеек, вирусвакцина, инфекционная активность, коэффициент регрессии, инактивация вируса
Key words: turkey herpesvirus, vaccine, infectivity, regression coefficient, virus inactivation
Абдуллоева Е. Ю., Долгова М. А., Камалова Н. Е.
ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ ВИРУСА ГЕРПЕСА ИНДЕЕК В КЛЕТОЧНО-АССОЦИИРОВАННОЙ ВИРУСВАКЦИНЕ, РЕСУСПЕНДИРОВАННОЙ В РАЗБАВИТЕЛЕ
THERMAL STABILITY oF TuRKEYHERPESviRuS
in diluted cell-associated vaccine
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец
federal Centre for Animal health, federal Governmental Budgetary institution Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur'evets
Абдуллоева Елена Юрьевна, ведущий биолог. E-mail: [email protected]
Abdulloeva Elena U., Leading Biologist. E-mail: [email protected] Долгова Мария Алексеевна, ведущий биолог / Dolgova Maria A., Leading Biologist Камалова Наталья Евгеньевна, д. в. н., гл. научн. сотрудник ОБТК
Kamalova Natalja E., Doctor of Veterinary Sciences, Chief Research Scientist of the Laboratory for Biological and Technological Control
Аннотация. Исследовано влияние температуры на инфекционную активность вируса герпеса индеек при экспозиции клеточно-ассоциированной вирусвакцины, ресуспендированной в разбавителе. Было установлено, что зависимость между инфекционным титром вируса в ресуспендированной клеточно-ассоциированной вирусвак-цине и временем экспозиции может быть описана линейными регрессионными уравнениями, где коэффициентом регрессии является скорость инактивации агента, значения которой составили (-0,0009) и (-0,0015) и (-0,0026) ^ФОЕ/см3/мин для 4, 22 и 37 °С, соответственно. Обнаружено, что через 30 минут после ресуспендирования вирусвакцины происходят существенные потери инфекционной активности вируса в среднем на 0,04, 0,05, 0,08lg для температурных режимов 4, 22 и 37 °С, соответственно.
Summary. Effect of temperature on the infectivity of cell-associated turkey herpesvirus during the exposure of vaccine to diluent was studied. It was determined that the relationship between the titre of virus in cell-associated vaccine resuspended in diluent and the time of exposure can be described using linear regression equation, where the regression coefficient is the speed of agent inactivation which was (-0.009) and (-0.0015) and (-0.0026)lg FFU/cm3/min for 4, 22 and 37 °C, respectively. A significant loss of infectious virus activity by an average of 0.04, 0.05, 0.08lg for the temperature regimes of 4, 22 and 37 °C, respectively, were detected as early as 30 minutes after vaccine resuspension.
Введение
Качество вакцинации во многом зависит от инфекционной активности вирусов, входящих в состав вакцины [3, 4]. Клеточ-но-ассоциированные вирусвакцины против болезни Марека (БМ) хранят в глубоко замороженном состоянии в жидком азоте при температуре минус 196 °С. Перед применением вирусвакцину размораживают и разводят в рекомендуемом объеме разбавителя, который зависит от количества иммунизирующих доз в вакцинном препарате [2]. Одним из недостатков живых вирусвакцин против БМ является их лабильность к факторам окружающей среды, особенно к температурному фактору, что крайне важно учитывать
в процессе проведения профилактических мероприятий.
Целью настоящей работы было изучение влияния температуры на инфекционную активность вируса герпеса индеек (ВГИ) при экспозиции клеточно-ассоциированной ви-русакцины в разбавителе.
Материалы и методы
Вирусный материал. Исследования проводили на образцах вирусвакцины против БМ «Марек-3», изготовленной на основе вакцинного производственного штамма «Владимир-124 ДЕП» ВГИ.
Разбавитель. Использовали разбавитель для жидких вирусвакцин против БМ про-
изводства ФГБУ «ВНИИЗЖ», представляющий собой 2%-й забуференный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ), который перед использованием выдерживали при температуре от 20 °С до 22 °С в течение 8-12 часов.
Культура клеток. Первичную культуру клеток фибробластов эмбрионов кур получали путем трипсинизации 9-суточных SPF-эмбрионов кур фирмы Valo Biomedia (Германия) и выращивали в пластиковых флаконах фирмы Corning (25 см2) при температуре (38,5±1,0) °С. Образование монослоя происходило в течение 24 ч.
Определение инфекционной активности вируса. Инфекционный титр вируса определяли по числу фокусообразующих единиц (ФОЕ) в монослое клеток фибробластов эмбрионов кур, выращенных в пластиковых флаконах. Использовали метод последовательных разведений вируссодержащей суспензии. Для оценки титра вируса устанавливали наименьшее разведение, при котором число ФОЕ было максимальным, без слияния фокусов. Величину титра определяли по следующей формуле:
Т = {[(bj + b2 + ... + bn) / n] x 10а} / V, где Т - титр вируса, ФОЕ/см3; bp b2,... bn - количество фокусов во флаконе;
n - количество используемых флаконов; V - объем суспензии вируса, внесенный во флакон, см3;
а - показатель степени разведения вирус-содержащего материала.
Растворы и реактивы. Для культивирования клеток ФЭК и ВГИ использовали питательную среду, состоящую из равных частей сред 199, Игла и гидролизата лактальбумина на солевом растворе Хенкса. К ростовой среде добавляли 10 % сыворотки крови крупного рогатого скота, а для поддерживающей среды концентрация сыворотки составляла 2 %. Величина рН ростовой и поддерживающей сред составляла 6,9-7,2.
Обработка результатов экспериментов. Использовали общепринятые методы статистической обработки варьирующих переменных [1]. Вычислительные операции и построение графиков производили с помощью приложения Microsoft Excel.
Результаты исследований
Для достижения поставленной цели кле-точно-ассоциированную вирусвакцину из ВГИ штамма «Владимир» ресуспендиро-вали в разбавителе. Определяли исходную величину инфекционной активности вируса (^Т0) путем титрования в культуре клеток ФЭК. Затем образовывали 3 опытных образца, которые выдерживали при температурных режимах 4, 22 и 37 °С. В течение 180 минут через заданные интервалы времени отбирали пробы и проводили их повторное титрование. Для каждого испытанного температурного режима исследовали связь между продолжительностью временного интервала экспозиции ресуспендированной вирусвакцины (]) и оценкой контраста по отношению к исходному титру, вычисленной по формуле:
^ = Щ - ^
где dJ - интервальная оценка инфекционного титра вируса (контраст); Т0 - исходная величина инфекционной активности вируса; Т. - значение инфекционной активности, установленное через заданный временной интервал (]).
В результате соответственно изученных температурных режимов были построены регрессионные модели инактивации вируса во времени, которые представлены на рисунке.
Отмечены средние значения оценок контраста инфекционного титра вируса для испытанных температур соответственно времени экспозиции (., мин.). Представлены линейные регрессионные модели (коэффициент детерминации К > 0,95), где: ^ - ожидаемая величина относительного снижения титра соответственно времени экспозиции в разбавителе (]).
Рис. Инактивация клеточно-ассоциированного ВГИ в разбавителе при температурных режимах (4±2), (22±2), (37±2) °С.
Обсуждение результатов
Рисунок демонстрирует динамику инактивации ВГИ в вирусвакцине, ресуспендиро-ванной в разбавителе. Наглядно видно, что в процессе экспозиции происходило возрастание оценок титра в отрицательном диапазоне для испытанных температурных режимов. Сопоставление средних оценок контраста dJ показало следующее: в течение первых 30 минут динамика инактивации вируса для испытанных температур была схожей; затем на протяжении всего периода наблюдений происходило более интенсивное снижение инфекционного титра агента при температуре 37 °С, которое имело статистически достоверное отличие (р < 0,001) от результатов, полученных для других двух температур. При экспозиции ресуспендированной вирус-вакцины при температуре 4 °С инактивация вируса была минимальной. Тем не менее, при сопоставлении средних оценок контраста, полученных для 4 °С и 22 °С, существенность отличий (р < 0,05) была обнаружена спустя 180 минут экспозиции вирусного материала. Полученные нами результаты согласуются с выводами, сделанными Geerligs Н. J., et а1. (2007) [5].
Таким образом было установлено, что зависимость между инфекционным титром ВГИ в вирусвакцине, ресуспендированной в разбавителе производства ФГБУ «ВНИ-ИЗЖ», и временем экспозиции может быть описана линейными регрессионными уравнениями, где коэффициентом регрессии является скорость инактивации агента, значения которой составили (-0,0009), (-0,0015) и (-0,0026)^ ФОЕ/см3/мин. для температурных режимов 4, 22 и 37 °С, соответственно. Построенные таким образом модели инактивации ВГИ позволяли прогнозировать величину остаточной инфекционности агента в ресуспендированной вирусвакцине для заданного временного интервала соответственно температуры экспозиции.
В то же время сопоставление оценок контраста, полученных для испытанных трех температурных режимов, относительно исходного значения инфекционного титра ви-
руса, находящегося в диапазоне значений (5,52-6,18)lg ФОЕ/см3, существенность различий установили уже спустя 30 минут после начала экспозиции вируссодержащих образцов. Снижение титра произошло в среднем на 0,04lg, 0,05lg и 0,08lg ФОЕ/см3 для температур 4, 22 и 37 °С, соответственно.
Заключение
Зависимость между инфекционным титром вируса в клеточно-ассоциированной вакцине, ресуспендированной в разбавителе, и временем экспозиции может быть описана линейными регрессионными уравнениями, где коэффициентом регрессии является скорость инактивации агента, значения которой составили (-0,0009), (-0,0015) и (-0,0026) lg ФОЕ/см3/мин. для 4, 22 и 37 °С соответственно. Построенные таким образом модели инактивации клеточно-ассоциированного вируса в разбавителе позволяют прогнозировать величину остаточной инфекционности агента для заданного временного интервала соответственно температурного режима.
Инфекционный титр вируса в вирус-вакцине, ресуспендированной в разбавителе производства ФГБУ «ВНИИЗЖ», при температурных режимах 4, 22 и 37 °С спустя 30 минут снижается на 0,04, 0,05 и 0,08lg ФОЕ/см3, соответственно.
Список литературы
1. Закс, Л. Статистическое оценивание [Текст] / Л. Закс.- М. : Статистика, 1976. -598 с.
2. Куляшбекова, Ш. К. Меры борьбы с болезнью Марека с помощью вакцинопрофилактики. [Текст] / Ш. К. Куляшбекова, А. В. Борисов // Сб. науч. тр. «III международный ветеринарный конгресс по птицеводству». - Москва, 2007. - С. 126-131.
3. Сергеев, В. А. Вирусы и вирусные вакцины [Текст] / В. А. Сергеев, Е. А. Непоклонов, Т. И. Алипер. - М. : Библионика, 2007. - 523 с.
4. Таточенко, В. К. Вакцинопрофилактика: справочник для врачей [Текст] / В. К. Таточенко, Н. А. Озерецковский. - М., 1994. - 179 с.
5. Geerligs, H. J. Determination of Optimal Conditions for Thawing and Diluting Cell-Bound CVI 988 Marek's Disease Vaccine and Stability of the Diluted Vaccine [Текст] / H. J. Geerligs, A. Hoogendam // Avian Dis., 2007. - P. 969-73.
