CC BY
99
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ и ммунология ♦
УДК 619: 616.98: 578.835.2: 57.082.26
Влияние концентрации клеток ВНК-21/2-17 на количество иммуногенных компонентов вируса ящура
М.Н. Гусева1, кандидат биологических наук ([email protected]), Б.Л. Манин1, кандидат биологических наук, Е.Г. Кузнецова2, кандидат биологических наук, Д.В. Михалишин1, кандидат ветеринарных наук, М.А. Шевченко1, аспирант
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных (ВНИИЗЖ)» (Владимир).
2 ОАО «Покровский завод биопрепаратов» (Покров).
В статье приведены данные о возможности повышения выхода иммуногенных компонентов вируса ящура в зависимости от концентрации клеток ВНК-21/2-17 и ИП в последнем пассаже перед заражением клеточной суспензии. При разных концентрациях клеток ВНК-21/2-17 концентрация ОВБ, количество иммуногенных компонентов и их процентное содержание не различались, однако, при концентрации клеток более 4,5 млн/мл объем полученного антигена увеличивался на 10...30 % по сравнению с образцами, где концентрация клеток была от 3,5 до 4,0 млн/мл (различия статистически значимые, р<0,001). Отмечено отсутствие корреляции между накоплением иммуногенных компонентов вируса ящура и ИП ВНК-21/2-17 в последнем пассаже перед заражением клеточной суспензии вирусом. При изучении репродукции вируса ящура в клетках, находящихся на разных стадиях цикла культивирования, было установлено, что количество иммуногенных компонентов с 1 млн клеток через 24 ч культивирования в 1,75 раза выше, чем с клеток через 48 чкультивирования (различия статистически значимые, р<0,05).
Ключевые слова: вирус ящура, иммуногенные компоненты, концентрация клеток ВНК-21/2-17, цикл культивирования
Сокращения: ИП — интенсивность пролиферации, КМ — культиваторы металлические, КС — культиваторы стеклянные, ОВБ — общий вирусный белок, РСК—реакция связывания комплемента, ТЦД—тканевая цитопатическая доза, ЦПД — цитопатическое действие, FAO — Food and Agriculture Organization (Продовольственная и сельскохозяйственная организация)
Введение
В 1962 г. И.А. Макферсон и М. Стокер сообщили о получении ими перевиваемой линии клеток ВНК-21 из почек новорожденных сирийских хомячков (Baby Hamster Kidney). Клетки хорошо выращивались в стационарных и вращающихся сосудах в виде монослойных и суспензионных культур [8]. Была установлена высокая чувствительность этих клеток к вирусу ящура. ИП клеток равнялся 5...6, титр инфекционности вируса достигал 107,9 ТЦД50/мл. Таким образом, эти работы послужили основой для разработки технологии крупномасштабного культивирования ВНК-21 и вируса ящура с целью изготовления культу-ральной инактивированной противоящурной вакцины [7].
Постоянный технический комитет экспертов Европейской комиссии по борьбе с ящуром FAO рекомендовал клетки ВНК-21 для изготовления вакцины, признав их безопасными для сельскохозяйственных животных. Многолетняя практика применения ВНК-вакцины против ящура подтвердила правильность этой рекомендации [5].
При изучении чувствительности клеток ВНК-21/13 к вирусу ящура было замечено, что нахождение их в различных фазах роста, в том числе и в стационарной, не отражается на репродукции вируса. Так, в клетках, выращенных в течение 6.12, 18 и 72 ч, вирус накапливался в титре 9,5lg ТЦД50/мл [7].
По данным французских исследователей, увеличение концентрации клеток ВНК в суспензии свыше 2x106 мл
не приводило к повышению титра инфекционности вируса. Инактивированные вакцины, приготовленные из вируса ящура, выращенного в суспензии клеток ВНК-21 (концентрация 2,5 млн/мл) и по методу Френкеля, оказались аналогичными по иммуногенности [5].
Для широкого распространения суспензионного метода имеются биологические ограничения. Цикл пролиферации клеток длится до тех пор, пока не будет получен сигнал, что окружающая среда стала неоптимальной для дальнейшего роста. Это может быть вызвано дефицитом питательных веществ, ограничением пространства, наличием лекарственных препаратов и т. д. [1].
На нашем предприятии более 30 лет для крупномасштабного культивирования вируса ящура используется трофофариант ВНК-21 — ВНК-21/2-17 [3], который обладает высокой толерантностью к условиям культивирования [4]. Как правило, условия для производства какого-то продукта подбираются опытным путем и поэтому являются в своем роде единственными и справедливыми лишь для конкретных клеток и систем культивирования конкретных биологических продук-
0 12 21 36 48 60 72 34 96 108 Время культивирования, ч Рис. 1. Динамика роста клеток в усредненном цикле культивирования линии ВНК-21/2-17
М.Н. Гусева, Б.Л. Манин, Е.Г. Кузнецова, Д.В. Михалишин, М.А. Шевченко
Время выращивания клеточной суспензии, ч Рис. 2. Количество иммуногенных компонентов с 1 млн клеток ВНК-21/2-17 при репродукции вируса ящура в клеточной суспензии на разных стадиях цикла культивирования
Цель исследования
Изучить возможность повышения выхода иммуногенных компонентов вируса ящура в зависимости от концентрации клеток ВНК-21/2-17 и ИП.
Материалы и методы
В работе использовали суспензионную культуру клеток ВНК-21/2-17 [1]; КС рабочим объемом до 30 л (Россия); КМ рабочим объемом до 1800 л (Россия).
Клетки выращивали и заражали вирусом ящура согласно «Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов». Для заражения использовали культуральный вирус ящура типов А, О, Азия-1.
Концентрацию клеток ВНК-21/2-17 в суспензии учитывали с помощью камеры Горяева для подсчета форменных элементов крови, модель 851, которая соответствует ТУ 64-1-816-84.
Жизнеспособность определяли путем учета количества живых клеток, используя 1%-й водный раствор трипанового синего.
ИП рассчитывали как отношение конечной концентрации клеток к исходной в одном пассаже. Минимальный прирост для данной культуры в цикле культивирования — не менее 4.
Количество ОВБ и компонентный состав определяли по «Методике определения содержания вирусспеци-фического белка и компонентного состава вируса ящура с помощью количественной РСК», утвержденной директором ВНИЯИ в 1987 г.
Известно, что корреляция — это статистическая взаимосвязь двух или нескольких случайных величин. Коэффициент корреляции (К) может принимать значение от +1 до -1, в зависимости от тесноты связи. При полной прямой корреляции К равен «+1», при полной обратной — «-1». Когда корреляция отсутствует, коэффициент близок к 0. Обычно считают, величина К в интервале 0,20...0,30 свидетельствует о наличии слабой, в интер-
24 48
Время выращивания клеточной суспензии, ч Рис. 4. Время репродукции вируса ящура в клетках ВНК-21 в зависимости от времени культивирования клеточной суспензии
вале 0,50...0,60 — средней, а в интервале 0,80...0,90 — сильной (тесной) корреляции между признаками [2].
Для обработки результатов исследований использовали статистические методы в биологии [2]. Цифровой материал статистически обрабатывали на персональном компьютере общепринятыми методами вариационной статистики с вычислением средней арифметической (М), стандартной ошибки (±m), и коэффициента корреляции (R) с использованием программы Microsoft Excel.
Результаты и обсуждение
Каждый цикл культивирования клеток ВНК-21/2-17 проходит две основные фазы — логарифмического роста и стационарную (рис. 1).
Стационарная фаза роста наступает после 48 ч из-за истощения питательной среды и накопления метаболитов, поэтому повторную загрузку на следующий цикл культивирования стараются осуществлять в конце фазы логарифмического роста [6].
На начальных этапах работы была исследована зависимость выхода иммуногенных компонентов вируса ящура от концентрации клеток ВНК-21/2-17. В связи с этим все концентрации клеток в последнем пассаже разделили на пять групп: 1 — до 3,5 млн/мл; 2 — 3,5.4,0 млн/мл; 3 — 4,0.4,5 млн/мл; 4—4,5 — 5,0 млн/мл; 5 — выше 5,0 млн/мл.
Из представленных в таблице данных видно, что при различных концентрациях клеток количество 146S+75S компонентов было в пределах 2,03.2,29 мкг/мл, а их процентное содержание (от количества ОВБ) — 84,56...88,34. Таким образом, при разных концентрациях клеток ВНК-21/2-17 концентрация ОВБ, количество иммуногенных компонентов и их процентное содержание не различались. При смене среды на среду для репродукции вируса ящура изменялась концентрация клеток, млн/мл, до 3,75±0,05...4,04±0,07 (разница статистически недостоверна). Таким образом, отсутствие существенной разницы в количестве иммуногенных компонентов можно объяснить выравниванием концентрации клеток после смены среды.
Отмечено, что при концентрации клеток более 4,5 млн/мл (группы 4 и 5) объем (л) полученного антигена увеличивался на 10.30 % по сравнению с группами 1, 2, 3, где была более низкая концентрациях клеток (различия статистически значимы, р<0,001), что важно при крупномасштабном производстве противовирусных вакцин.
При изучении корреляции между ИП и иммуно-генными компонентами отмечено, что коэффициент корреляции R был равен 0,09 при N=54. Таким образом, не существовало связи между накоплением иммуно-генных компонентов вируса и ИП клеток в последнем пассаже перед заражением суспензии.
Влияние концентрации клеток ВНК-21/2-17 на количество иммуногенных компонентов вируса ящура
S &
50 мкм Ж i G1 4
У i \ 7 4
G i ■ * v-,
5а G2 +M
5б
Рис. 5. Нативная морфология клеток ВНК-21/2-17 на разных стадия цикла культивирования (а — 24 ч, б — 48 ч)
Количественная характеристика компонентов антигена вируса ящура в зависимости от концентрации клеток
Группы по концентрации клеток Показатели и число пассажей (^
1 2 3 4 5
Концентрация клеток перед охлаждением, млн/мл 3,09±0,07 N =94 3,83±0,03 N =107 4,33±0,03 N =124 4,76±0,04 N =63 5,17±0,08 N =13
Полученный объем антигена, л 1327±24,2 N =96 1609±18,4 N =107 1778±16,1 N =124 1891±16,5 N =63 1900±0 N =13
Концентрация клеток после смены среды на среду для репродукции вируса ящура, млн/мл 3,83±0,34 N =95 3,75±0,05 N =105 3,9±0,36 N =121 4,04±0,07 N =61 4,01±0,14 N =13
ОВБ после инактивации и очистки, мкг/мл 2,35±0,11 N =85 2,64±0,12 N =106 2,46±0,13 N =124 2,53±0,35 N =63 2,65±0,16 N =13
1468+758, мкг/мл 2,03±0,09 N =95 2,25±0,10 N =106 2,29±0,09 N =123 2,14±0,14 N =63 2,29±0,18 N =14
1468+758, % к ОВБ 84,56±1,88 N =96 87,05±0,88 N =108 84,78±1,14 N =124 85,37±1,51 N =63 88,34±2,15 N =13
На следующем этапе работы изучали репродукцию вируса ящура в клетках, находящихся на разных стадиях цикла культивирования. Считается, что нахождение клеток в различных фазах роста, в том числе и стационарной, не отражается на репродукции вируса и накоплении его антигена [7]. Мы изучали репродукцию вируса ящура в клетках ВНК-21/2-17, культивировавшихся 24 ч (опыт) и 48 ч (контроль). Перед инфицированием их уравнивали по концентрации до 1,0.1,3 млн/мл. Для заражения использовали куль-туральный вирус ящура штаммов: «Азия-1 Shamir 3/89» и «О1 1618». Результаты опытов приведены на рисунках 2.4.
В результате проведенных исследований было установлено, что количество иммуногенных компонентов с 1 млн опытных клеток составило 0,70±0,09 мкг/мл, контрольных — 0,40±0,02 мкг/мл, что в 1,75 раза ниже (различия статистически значимы, р?0,05) (см. рис. 2). В то же время не отмечено существенной разницы как в цитопатическом действии вируса (90,4 % и 89,7 %, соответственно) (см. рис. 3), так и во времени его репродукции (9,3 ч и 10,4 ч) (см. рис. 4).
В процессе крупномасштабного культивирования клеток ВНК-21/2-17 выполнена морфологическая оценка популяций клеток на разных стадиях цикла культивирования — 24 и 48 ч. В стандартной ситуации в логарифмической фазе роста (24 ч) до 25 % клеток находилось в синтетической стадии (S) и стадии деления (M+G2). Морфологически они выглядели более крупными (до15 мкм) или в виде «гантелек», соответственно (рис. 5а).
Клетки, находящиеся на стадии G1 (диплоидная фаза), не превышали в диаметре 10 мкм и, при появлении лимитирующих факторов культивирования, могли перейти в фазу G0 (диплоидная фаза покоя), которая переходит в апоптоз. В конце фазы логарифмического роста (48 ч) количество клеток в фазе G1 увеличивалось (рис. 5б).
В конце каждого цикла культивирования количество делящихся клеток уменьшалось, основная популяция клеток имела размеры около 10 мкм. При люминесцентной микроскопии ядра живых клеток в фазе G1 занимали более 80 % объема. Как известно, репродукция вируса ящура происходит в цитоплазме клеток [7] и, вероятно, от ее объема также может зависеть количество вирусного белка.
Из изложенного выше можно сделать вывод, что высокий пролиферативный потенциал клеточной линии ВНК-21/2-17 еще не до конца реализован для увеличения выхода компонентов вируса ящура в процессе его репродукции. Как видно из представленных рисунков, суточные клетки при репродукции вируса ящура давали в 1,75 раза больше иммуногенных компонентов с 1млн клеток, чем двухсуточные. Вероятно, это связано с тем, что популяция через 24 ч находится в самой интенсивной фазе цикла культивирования (в синтетической стадии — S и стадии деления — M+G2), когда объем цитоплазмы клеток, где происходит репликация вируса ящура, достаточно большой.
Заключение
В ходе проведенных исследований была изучена возможность повышения выхода иммуногенных компонентов вируса ящура в зависимости от концентрации клеток ВНК-21/2-17, ИП и циклов суспензионного культивирования.
Было определено, что при разных концентрациях клеток ВНК-21/2-17 концентрация ОВБ, количество иммуногенных компонентов и их процентное содержание не различались.
Отмечено, что при концентрации клеток более 4,5 млн/мл объем полученного антигена увеличивался на 10.30 % по сравнению с образцами, где была концентрациях клеток от 3,5 до 4,0 млн/мл (различия статистически значимы, р<0,001), что важно при крупномасштабном производстве противовирусных вакцин. Не была найдена корреляция между накоплением иммуногенных компонентов вируса ящура и ИП клеток в последнем пассаже перед заражением клеточной суспензии вирусом.
При изучении репродукции вируса ящура в клетках, находящихся на разных стадиях цикла культивирования, было установлено, что количество иммуногенных компонентов с 1млн клеток через 24 ч культивирования в 1,75 раза выше, чем с клеток ВНК-21 через 48 ч культивирования, различия существенны (р<0,05).
Таким образом, при крупномасштабном производстве противоящурных вакцин более высокие концентрации клеток ВНК-21/2-17 в последнем пассаже создают предпосылки для увеличения объема полученного антигена. Библиография
1. Биотехнология клеток животных / Под ред. Р.Е. Спиера, Дж. Гриффитса. Т.1. — М.: Агропромиздат, 1989. — 365 с.
2. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. — М.: Практика, 1999. — 459 с.
3. Российская коллекция клеточных культур (РККК): каталог. / Под ред. Г.П. Пинаева [и др.]. — СПб., 2004. — 315 с.
4. Параметры биологической толерантности производственной клеточной культуры ВНК-21/01 / Б.Л. Манин, В.В. Михалишин, Т.И. Корпусова [и др.] // Ветеринарна медицина. — Харкв, 2002. — Вип.80. — С.404-408.
5. Сергеев, В.А. Вирусы и вирусные вакцины / В.А. Сергеев, Е.А. Непоклонов, Т.И. Алипер. — М.: Библионика, 2007. — 523 с.
6. Фрешни, Р.Я. Культура животных клеток: практическое руководство / Р.Я. Фрешни. — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. — 691 с.
7. Ящур / А.Н. Бурдов, А.И. Дудников, П.В. Малярец [и др.]. — М.: Агропромиздат, 1990. — 320 с.
8. Macpherson, I.A. Polyoma transformation of hamster cell clones — an Investigation of genetic factors affecting cell competence / I.A. Macpherson, M. Stoker // Virology. — 1962. — Vol.16. — P. 147-151.
SUMMARY
M.N. Guseva1, B.L. Manin1, Ye.G Kuznetsova2, D.V. Mikhalishin1, М.А. Shevchenko1
1 FGBI «ARRIAH» (Vladimir).
2 ОАО «Pokrov Plant of Biopreparations» (Pokrov).
Effect ofВНК-21/2-17 Cell Concentration on Amount of FMD Virus Immunogenic Components.
Data on capability to increase the yield of FMD virus immunogenic components in terms of ВНК-21/2-17 cell concentration and proliferation rate (PR) in the last passage before cell suspension infection are demonstrated in the paper. It was shown that the concentration of the whole virus protein, amount of immunogenic components and their percentage composition did not differ at different ВНК-21/2-17 cell concentrations but at the cell concentration higher than 4,5 mn/cm3the volume of produced antigen increased by 10-30 % as compared with samples with cell concentrations from 3.5 to 4.0 mn/cm3 (differences are significant, p<0.001). The correlation between PR and immunogenic components demonstrated no relationship between accumulation of FMD virus immunogenic components and ВНК-21/2-17 cell proliferation rate in the last passage before cell culture infection by virus. The study of FMD virus reproduction in cells at different stages of the cultivation cycle showed that in 24 hours of cultivation the amount of immunogenic components from 1 mn of cells was 1.75-fold higher than from cells in 48 hours of cultivation; differences were significant (p<0.05). Key words: ВНК-21/2-17 cell concentration, FMD virus, immunogenic components, cultivation cycle.
