CC BY
35
УДК 619:616.98:578.835.2:616-079.4
Ключевые слова: серологический мониторинг, вспышки ящура, штаммы вируса, иммуноферментный анализ, реакция микронейтрализации, антигенное соответствие
Key words: serological monitoring, foot-and-mouth disease outbreaks, virus strains, enzyme-linked immunosorbent assay, microneutralization test, antigenic match
Кременчугская С. Р., Камалова Н. Е., Мищенко А. В., Майорова Т. К.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА О, ВЫЗВАВШИХ ВСПЫШКИ В ЗАБАЙКАЛЬСКОМ КРАЕ В 2010-2011 ГГ.
RESULTS OF STUDYING TYPE О FOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS ISOLATES THAT CAUSED OUTBREAKS IN THE ZABAIKALSKY KRAI IN 2010-2011
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец
FGBI "Federal Centre for Animal Health" (FGBI "ARRIAH"). Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur'evets
Кременчугская Светлана Ревдитовна, к. в. н., вед. научн. сотрудник. E-mail: kremenchugskaya@arriah.ru
Kremenchugskaya Svetlana R., Ph.D. in Veterinary Science, Leading Research Scientist. E-mail: kremenchugskaya@arriah.ru Камалова Наталья Евгеньевна, д. в. н., гл. научн. сотрудник. E-mail: kamalova@arriah.ru Kamalova Natalya E., Doctor of Veterinary Medicine, Chief Research Scientist. E-mail: kamalova@arriah.ru Мищенко Алексей Владимирович, к. в. н., зам. директора. E-mail: mischenko@arriah.ru Mischenko Aleksey V., Ph.D. in Veterinary Science, Deputy Director. E-mail: mischenko@arriah.ru Майорова Т. К., вед. вет. врач. E-mail: mayorova@arriah.ru Mayorova Tamara K., Leading Veterinarian. E-mail: mayorova@arriah.ru
Аннотация. В статье обобщены результаты изучения эпизоотической ситуации и серологического мониторинга в буферной зоне Забайкальского края до возникновения вспышек ящура в 2010 г. Результаты, полученные при вирусовыделении и репродукции изолятов, вызвавших вспышки ящура типа О, на культурах клеток и естественно-восприимчивых животных, а также при изучении их антигенного соответствия производственным штаммам вируса ящура, послужили основанием для их депонирования в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Summary. The paper gives summarized results of studying epidemic situation and carrying out serological monitoring in the buffer zone of the Zabaikalsky Krai before occurrence of FMD outbreaks in 2010. Results of virus isolation and reproduction of isolates, that caused type О FMD outbreaks, in cell cultures and naturally susceptible animals as well as results of studying their antigenic match with FMD virus production strains constituted а ground for their deposit into the FGBI "ARRIAH" Collection of microorganism strains.
Введение
Вспышки ящура типа О в 2010 г. отмечались в Гонконге, континентальном Китае, Южной Корее, Японии, в Восточном аймаке Монголии. Начавшийся в 2010 г. ящур продолжался в 2011 г. в Южной и Северной Корее, в Синьзян-Уйгурском автономном районе Китая.
В Российской Федерации ящур типа О регистрировался в Забайкальском крае трижды в июле и августе 2010 г. и марте 2011 г. По результатам филогенетического анализа, проведенного в ФГБУ «ВНИИЗЖ», изоляты, ответственные за вспышки, были отнесены к топотипу Юго-Восточная Азия и принадлежали к генетической линии Мьянма 98 (Муа 98) [2, 3, 4].
Целью данной работы было детальное изучение выделенных изолятов с применением вирусологических и серологических методов.
Материалы и методы
Эпизоотическую ситуацию по ящуру в Забайкальском крае изучали при командировании сотрудников референтной лаборатории диагностики ящура для оказания научно-консультативной помощи во время вспышек ящура в 2010-2011 гг.
Сыворотки крови вакцинированных против ящура животных отбирали в районах Забайкальского края, входящих в буферную зону РФ. Исследования проб сывороток крови на наличие антител к вирусу ящура проводили с помощью жидкофазного бло-
кирующего непрямого двойного сэндвич-варианта иммуноферментного анализа (ИФА). Для постановки реакции использовали «Набор для определения противоящурных антител в сыворотках крови животных в иммуно-ферментном анализе» производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» в соответствии с инструкцией по применению, утвержденной Россельхоз-надзором 16.09.2009 г.
Вирусный материал в виде стенок афт от крупного рогатого скота (КРС) и свиней поступал в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из Забайкальского края для проведения вирусологической экспертизы при подозрении на ящур.
Лабораторную диагностику и выделение вируса из проб афтозного материала проводили согласно «Методическим указаниям по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура», утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ 10.11.2002 г.
Культуры клеток. Для изучения адаптации вируса использовали первично трипси-низированную культуру клеток почки поросенка (СП) и перевиваемые линии клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сирийского хомячка (ВНК-21).
Животные. КРС массой 250-300 кг и подсвинков массой 35-40 кг использовали для выделения вируса и титрования.
Антигенные свойства штаммов изучали в реакции микронейтрализации (РМН) и ИФА согласно «Методическим рекомендациям по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изо-лятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации», утвержденным директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 16.11.2012 г. и «Методике для определения антигенного соответствия эпизоотических изолятов и производственных штаммов вируса ящура с помощью иммуноферментного анализа», утвержденной директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 01.06.2009 г.
Результаты и обсуждение
Эпизоотическая ситуация. Забайкальский край Российской Федерации, расположенный в восточном Забайкалье, име-
ет государственную границу с Монголией (5 районов) и Китаем (7 районов).
В Забайкальском крае обитают дикие животные: косули, изюбры, дикие кабаны и т. д., которые играют определенную роль в распространении ящура. В 2002, 2008, 2010 и 2011 гг. была отмечена массовая миграция диких антилоп-дзеренов с территории Монголии на территорию Забайкальского края [1].
До возникновения вспышки ящура в 2010 г. болезнь, вызванная вирусом типа Азия-1, была зарегистрирована в с. Средняя Борзя Калганского района Читинской области в 2006 г.
В июле 2010 г. вспышка ящура типа О была отмечена в п. Абагайтуй Забайкальского района Забайкальского края, расположенного в 12 км от границы с Китаем. Заболело 187 голов КРС из 2256 и 4 свиньи из 50, имеющихся в населенном пункте.
Вторая вспышка ящура была зарегистрирована в августе 2010 г. в с. Макарово Шилкинского района в 300 км от границы с Китаем. Заболело 95 голов КРС (100 %) и 52 свиньи из 182 голов, имеющихся в населенном пункте.
В марте 2011 г. была выявлена вспышка ящура в с. Усть-Ималка Ононского района Забайкальского края, в 12 км от границы с Восточным аймаком Монголии. Заболело 183 головы КРС из 1518 и 1 свинья из 73.
Серологический мониторинг. До вспышки ящура в июле 2010 г. 12 районов Забайкальского края входило в буферную зону РФ, где 2 раза в год осуществляется профилактическая вакцинация против ящура и проводится серомониторинг с исследованием сывороток крови вакцинированных животных на напряженность иммунитета к вирусу ящура типов А, О, Азия-1 в ИФА. Результаты серомонито-ринга, проведенного весной и осенью 2009 г. в 4 районах Забайкальского края, свидетельствовали, что высокий уровень иммунных животных к вирусу ящура типа О среди КРС наблюдался в Акшинском (81,2-86,3 %) и Кыринском (77,5-80,4 %) районах. В Калган-ском районе весной и осенью 2009 г. уровень иммунных животных к ящуру типа О составлял 53,1 % и 80 %, в Ононском районе -63,7 % и 83,7 % соответственно.
В Забайкальском районе сыворотки крови КРС для проведения серомониторинга отбирали только в 2008 г., при этом уровень иммунных животных к вирусу ящура типа О через 200 суток после вакцинации был 58,6 %.
По результатам серомониторинга, проведенного в июне 2010 г., среди взрослого КРС частного сектора населенных пунктов Большевик, Усть Ималка, Красная Ималка, Холуй База, Кубухай Ононского района был отмечен низкий уровень иммунных животных (12,5-37,5 %) к вирусу ящура типа О.
Шилкинский район до августа 2010 г. не входил в буферную зону по ящуру и вакцинация животных в этом районе не проводилась.
В пробах сывороток крови отстрелянных в 2010 г. 10 дзеренов антитела к вирусу ящура типов А, О, Азия-1 и антитела к неструктурным белкам вируса ящура установлены не были.
Лабораторная диагностика ящура и ви-русовыделение. Пробы афтозного эпителия, отобранные от КРС в п. Абагайтуй Забайкальского района Забайкальского края, были отрицательными в ИФА, РСК, ОТ-ПЦР и при заражении первично трипсинизирован-ной культуры клеток СП не вызывали ЦПД в течение 72 ч. на протяжении трех последовательных пассажей. В пробе афтозного эпителия от свиньи с помощью (реакции связывания комплемента) РСК и ИФА был установлен антиген вируса ящура типа О в разведениях 1 : 2 и 1 : 16 соответственно. Методом ОТ-ПЦР был обнаружен геном вируса ящура типа О.
В пробах афтозного эпителия от КРС, отобранных в с. Макарово Шилкинского района Забайкальского края, в ИФА в разведении 1 : 64, РСК - 1 : 4 и ОТ-ПЦР был установлен вирус ящура типа О.
В пробах патологического материала от КРС из с. Усть Ималка Ононского района также установлен вирус ящура типа О в ИФА, РСК и ОТ-ПЦР.
На первом этапе изоляты от свиньи и КРС из вспышек в Забайкальском и Шил-кинском районах были адаптированы к первично трипсинизированной культуре клеток СП на уровне 2-3 пассажей и имели ти-
тры инфекционной активности 6,33±0,1-7,0±0,25 ^ ТЦД50/мл. При инокуляции перевиваемых культур клеток IB-RS-2 и ПСГК-30 вирусом ящура, адаптированным к культуре клеток СП, выраженное ЦПД отмечали уже в 1-2 пассажах через 20-24 ч. после заражения. Вирус 2-3 пассажей накапливался при репродукции в перевиваемых линиях клеток IB-RS-2 и ПСГК-30 с титрами инфекционной активности 6,33±0,3-6,75±0,1 ^ ТЦД50/мл. Результаты этих исследований представлены в таблице 1.
Для заражения суспензионной культуры клеток ВНК-21 использовали вирус ящура О №2102/Забайкальский/2010, размноженный в культуре клеток ПСГК-30. Титр инфекционной активности суспензионного вируса, полученного через 18 ч. культивирования, при титровании в перевиваемой культуре клеток Ш-КЗ-2 составил 6,58±0,6 ТЦД50/50 мкл.
Из патологического материала от КРС, отобранного в с. Усть Ималка Ононского района Забайкальского края, выделить вирус не удалось.
Выделение вируса на естественно-восприимчивых животных. Для заражения подсвинка был использован культуральный вирус О №2102/Забайкальский/2010 с титром инфекционной активности 6,33 ^ ТЦД50/мл. В течение трех пассажей вирус вызывал образование первичных афт через 48 ч. после инокуляции, тогда как к 4-6 пассажам первичные афты наблюдали через 24 ч. после введения вируса. Титр инфекционной активности афтозного вируса 6 пассажа при титровании на свиньях составил 5,0 ^ ИД50/0,1мл, а в культуре клеток СП - 7,0 ^ ТЦД50/мл.
Для выделения вируса О №2108/Забай-кальский/2010 бычка заражали интрадермо-линвально культуральным вирусным материалом с титром инфекционной активности 6,5 ^ ТЦД50/мл. После проведения 3 последовательных пассажей титр инфекционной активности афтозного материала составил 4,0 ^ ИД50/0,1мл, а в культуре клеток СП -5,5 ^ ТЩумл.
Изучение антигенного соответствия изолятов производственным штаммам типа О в РМН и ИФА. Скрининговые исследования по определению антигенно-
Примечание: г1 - 0,4-1,0 - близкое антигенное родство между полевым изолятом и производственным штаммом; г1 - 0,2-0,39 - полевой изолят антигенно родственен производственному штамму, вакцина из производственного штамма может быть использована, если не будет найдено более родственного штамма и при условии, что животные будут иммунизированы более 1 раза; г1 < 0,2 - полевой изолят отличается от производственного штамма, вакцина из которого не приемлема для защиты от заражения полевым изолятом.
Таблица 3.
Результаты определения антигенного соответствия (г^ в РМН штаммов вируса ящура О №2102 Забайкальский/2010 и О №2108 Забайкальский/2010
производственным штаммам типа О
Таблица 1.
Показатели репродукция в культурах клеток изолятов вируса ящура, вызвавших вспышки в Забайкальском крае в 2010 г.
Наименование материала Культура клеток
СП ПСГК-30
пассаж титр 0£ГЦЦ>л) пассаж титр (^ТЦД>л) пассаж титр (^ТЦД>л)
О№2102/ Забайкальский/2010 3 7,0±0,25 3 6,63±0,0 3 6,75±0,1
О№2108/ Забайкальский/2010 (1) 3 6,5±0,17 2 6,5±0,23 2 6,33±0,3
О№2108/ Забайкальский/2010 (2) 3 6,33±0,2 2 6,66±0,2 2 6,5±0,2
Таблица 2.
Результаты определения антигенного соответствия (г1) в ИФА штаммов вируса ящура О №2102 Забайкальский/2010 и О №2108 Забайкальский/2010
производственным штаммам типа О
Изолят Сыворотки, г.
О, №1618 О/Приморский/2000 О PanAsia2
О №2102 Забайкальский/2010 0,22 0,35 0,23
О №2108/Забайкальский/2010 0,25 0,35 0,47
Изолят Сыворотки, г
О! Маниса О/Приморский/2000 О PanAsia2
О №2102 Забайкальский/2010 0,31 0,36 0,33
О №2108/Забайкальский/2010 0,33 0,62 0,42
Примечание: при значении г1 > 0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса; при значении г1 < 0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса.
го соответствия были проведены в жид-кофазном блокирующем варианте ИФА в диагностических системах О1 №1618, О/ Приморский/2000 (PanAsia) и О PanAsia2. Из результатов ИФА, представленных в таблице 2, следует, что близкое антигенное родство (г1 0,4-1,0) отмечено только между штаммом О PanAsia2 и вирусом ящура О №2108 Забайкальский/2010.
Штаммы О1 Маниса, О/Приморский/2000 и О PanAsia2 по данным РМН в антигеном отношении перекрывают изучаемые изоляты О №2102 Забайкальский/2010 и О №2108 Забайкальский/2010, т. е. являются родственными.
Однако изолят О №2108 Забайкальский/2010 в РМН демонстрировал более близкое антигенное родство штаммам
О/Приморский/2000 и О PanAsia2 (г1 0,62 и 0,42) по сравнению с изолятом О №2102 Забайкальский/2010, имеющим с этими штаммами пограничные значения показателя г1 (0,36 и 0,33).
Наши результаты по определению антигенного соответствия изучаемых изолятов штамму О1 Маниса согласуются с результатами исследований изолятов типа О, выделенных в 2010-2011 гг. в Южной Корее (г1 = 0,30-0,33), проведенными в Пербрайт-ском институте (Великобритания) [5].
Близкое антигенное родство штамма О PanAsia2 и изолята О №2108 Забайкальский/2010 было подтверждено контрольным заражением пяти голов КРС, иммунизированного моновалентной инактивированной сорбированной культуральной вакциной из штамма О PanAsia2, вирусом ящура штамма О №2108/Забайкальский/2010, при котором все животные были защищены от генерализации ящурного процесса.
По результатам изучения штаммы, выделенные в 2010 г. в Забайкальском крае, депонированы в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационными номерами О №2102 Забайкальский/2010 (производственный) 1 марта 2012 г. и О №2108 Забайкальский/2010 (производственный) 27 февраля 2012 г.
Заключение
Результаты серомониторинга, проведенного в буферной зоне Забайкальского края до возникновения вспышек ящура, показали, что в некоторых населенных пунктах/хозяйствах Ононского района у вакцинированных животных не было напряженного иммунитета к вирусу ящура типа О.
Изоляты, отобранные при вспышках ящура в июле и августе 2010 г. в Забайкальском и Шилкинском районах Забайкальского края, были адаптированы к первично трипсинизи-
рованной культуре клеток СП и перевиваемым культурам клеток IB-RS-2 и ПСГК-30 на уровне 2-3 пассажей и освежены на естественно-восприимчивых животных, определена их инфекционная активность.
Производственные штаммы типа О в антигеном отношении перекрывают изоляты, ответственные за вспышки ящура в Забайкальском крае в 2010 г. Близкое антигенное родство штамма вируса ящура О №2108 Забайкальский/2010 и вакцинного штамма O PanAsia2 подтверждено результатами контрольного заражения вакцинированного КРС, при котором все животные были защищены от генерализованной формы ящура.
Штаммы вируса ящура О №2102 Забайкальский/2010 и О №2108 Забайкальский/
2010 депонированы в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Список литературы
1. Мищенко, А. В. Роль диких животных в распространении ящура / А. В. Мищенко, В. А. Мищенко,
B. М. Захаров, Ц. Банди // Ветеринария. - 2012. -№ 11. - С. 3-5.
2. Щербаков, А. В. Филогенетический анализ изолятов вируса ящура, вызвавших вспышки болезни в России и Монголии в 2011 г. / А. В. Щербаков, А. М. Тимина // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2011. - Т. 9. -
C. 5-10.
3. Knowles, N. J. Southeast Asian Foot-and-Mouth Disease Viruses in Eastern Asia / N. J. Knowles, J. J. He, Y. Shang, A. Scherbakov [et al.] // Emerg Infect Dis. -2012. - V 18 (3). - P. 499-501.
4. Kremenchugskaya, S. R. Phylogenetic and antigenic characteristics of type O FMDV isolates responsible for outbreaks in Russia and neighboring countries in 20102012 / S. R. Kremenchugskaya, A. V. Scherbakov // Open sessions of the standing technical and research committees of the EuFMD commission: Appliance of science in the progressive control of FMD, Jerez de la Frontera, Spain, 2012 : Book of Abstracts. - Rome, 2012. - P. 193.
5. Report of the 39th Session of EuFMD, Rome
2011 [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.fao.org/ag/againfo/commissions/en/eufmd/ gensess_39report_txt.html - дата обращения 12.12.2012.
Ф
Курсы повышения квалификации для ветеринарных врачей и студентов ветеринарных вузов
в Санкт-Петербурге: www.invetbio.spb.ru/seminars.html
