CC BY
51
УДК 619:578.835.2:57.082.26:57.083.2:547.455.623
Ключевые слова: клетки ВНК-21/2-17, глюкоза, лактат, рН, ионы, вирус ящура
Key words: ВНК-21/2-17 cells, glucose, lactate, рН, ions, FMD virus
Гусева М. Н., Кузнецова Е. Г., Лозовой Д. А., Михалишин Д. В., Шевченко М. А.
МЕТАБОЛИЗМ ГЛЮКОЗЫ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ВИРУСА ЯЩЕРА В СУСПЕНЗИИ КЛЕТОК ВНК-21/2-17
GLUCOSE METABOLISM IN THE PROCESS OF FOOT AND MOUTH DISEASE (FMD) VIRUS CULTIVATION IN BHK-21/2-17 CELL SUSPENSION
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец
FGBI "Federal Centre for Animal Health" Address: 600901, Russia, Vladimir, Yurevets
Гусева Марина Николаевна, к. б. н., ст. научн. сотрудник. E-mail: guseva_mn@arriah.ru
Guseva Marina N., Ph.D. in Biology Science, Senior Researcher. E-mail: guseva_mn@arriah.ru Кузнецова Елена Геннадьевна, к. б. н., вед. научн. сотрудник Kuznetsova Yelena G., Ph.D. in Biology Science, Leading Researcher Лозовой Дмитрий Анатольевич, к. в. н., временно исполняющий обязанности директора Lozovoy Dmitry A., Ph.D. in Veterinary Science, Acting Director Михалишин Дмитрий Валерьевич, к. в. н., зав. лабораторией профилактики ящура Mikhalishin Dmitry V., Ph.D. in Veterinary Science, Head of the Laboratory for FMD Prevention Шевченко Максим Александрович / Shevchenko Maxim A., Postgraduate
Аннотация. В статье приведены данные по изучению динамики потребления глюкозы клетками ВНК-21/2-17, определена корреляция между изменением количества глюкозы и некоторыми физико-химическими показателями питательной среды. Также представлены результаты исследований влияния различного количества глюкозы на репродукцию вируса ящура и выход иммуногенных компонентов.
Summary. Results of studying dynamics of glucose intake by BHK-21/2-17 cells are demonstrated and the correlation between a change in glucose amount and some physico-chemical showings of the nutrient medium is shown in the paper. Also, results of studying an impact of glucose amount on FMD virus reproduction and yield of immunogenic components are presented.
Введение
Одним из существенных компонентов питательной среды для суспензионного культивирования клеток является глюкоза. В концентрации 5-20 мМ она служит традиционным источником углерода в питательных средах [1, 8].
Потребность клеток в глюкозе, прежде всего, определяется ее энергетической ролью в обмене веществ. Кроме того, клетки используют глюкозу и в пластических целях -для синтеза некоторых заменимых аминокислот, а также жирных и нуклеиновых кислот [1, 8].
Метаболизм глюкозы происходит, главным образом, путем гликолиза, представляющего собой последовательность биохимических реакций, в результате которых глюкоза распадается на две молекулы пиро-виноградной кислоты (пирувата) (аэробный
гликолиз) или две молекулы молочной кислоты (лактата) (анаэробный гликолиз).
Образующаяся молочная кислота не является конечным продуктом обмена веществ. Под действием лактатдегидрогеназы она окисляется снова, образуя пируват, который и участвует в дальнейших биохимических превращениях.
Таким образом, лактат представляет собой метаболический «тупик»: он не может утилизироваться в каких-либо других внутриклеточных реакциях и должен вновь превратиться в пируват или окислиться до СО2 и Н2О в ходе реакций цикла Кребса. Результатом такой биохимической реакции является продукция энергии в форме аденозинтрифосфата (АТФ) и окисление NADH (никотинамидадениндинуклеотид-фосфата) в NAD (никотинамидаденинди-нуклеотид). В присутствии кислорода и ос-
новных кофакторов лактат превращается в пируват; он не накапливается и поддерживает равновесие с последним.
Поскольку лактат может элиминироваться только путем превращения в пируват, концентрация лактата тесно связана концентрацией пирувата, являющегося ключевой промежуточной субстанцией на пересечении нескольких важных путей метаболизма. Основным источником пирувата является гликолиз, в ходе которого он образуется при окислении глюкозы, а также трансаминиро-вание - процесс, при котором формирование пирувата происходит при участии аминокислот, особенно аланина [5].
При поддержании кислотно-щелочного равновесия ионы водорода сначала связываются с бикарбонатом и другими буферами, а затем поглощаются при утилизации лак-тата через глюконеогенез (процесс синтеза глюкозы из веществ неуглеводной природы) или окисление [5].
Энергетический эффект анаэробного гликолиза по сравнению с аэробным -небольшой: образование двух моль лактата из глюкозы сопровождается синтезом всего двух моль АТФ. Это объясняется тем, что восстановленная форма полу-
ченная при окислении глицероальдегидфос-фата, не используется дыхательной цепью, а акцептируется пируватом.
Пируват также может окисляться в цикле лимонной кислоты с образованием СО2 и воды. Накопление в среде молочной кислоты (лактата), особенно характерное для эмбриональных и трансформированных клеток, свидетельствует о нарушениях в функционировании цикла лимонной кислоты [10].
Если количество глюкозы падает ниже критического уровня, то источником энергии могут служить аминокислоты [5, 10].
Исключение глюкозы из состава культу-ральной среды ведет к прогрессивным изменениям эпителиальных клеток. Это было исследовано на примере клеток крысиного сердца [4]. Кроме того, концентрация глюкозы оказывает большое влияние на содержание витамина С, гликопротеиновый и инсулиновый метаболизм; что доказано на примере эпителиальных клеток сердца
эмбриона коровы. Концентрация глюкозы в культуральной среде 2 г/дм3 вызывает 5-кратное снижение усвоения аскорбиновой кислоты эпителиальными клетками [10].
Повышение концентрации глюкозы, также как и ее дефицит, вызывает увеличение ее потребления растущими клетками и образование молочной и пировиноградной кислот, токсичных для клеток, при этом наблюдается зернистость клеток и меньший прирост их числа [10].
Присутствие глюкозы в количестве 0,2 % в сбалансированном солевом растворе обеспечивает высокое накопление вируса ящура в клетках ВНК-21 (108 БОЕ/см3) [9].
В задачу наших исследований входило изучение динамики потребления глюкозы клетками ВНК-21/2-17, определение корреляции между изменением количества глюкозы и некоторыми физико-химическими показателями в питательной среде, а также изучение влияния различного количества глюкозы на репродукцию вируса ящура.
Материалы и методы
В работе использовали:
• суспензионную культуру клеток ВНК-21/2-17;
• культиваторы стеклянные (КС) рабочим объемом до 30 дм3 (Россия);
• культиваторы металлические (КМ) рабочим объемом до 1800 дм3 (Россия).
Питательную среду для выращивания клеток готовили согласно «Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов».
Качественный и количественный состав питательных сред определяли на различных (последовательных) этапах культивирования клеток ВНК-21/2-17 на протяжении всего производственного цикла. Первые 3 пассажа проводились в КС, 4-6 пассажи - в КМ.
Концентрацию клеток ВНК-21/2-17 в суспензии учитывали с помощью камеры Горя-ева для счета форменных элементов крови, модель 851, которая соответствует ТУ 64-1816-84.
Содержание глюкозы, лактата, ионов, давление кислорода и углекислого газа, а также насыщение воздухом и СО2 в процентах
определяли при помощи биохимического анализатора BioProfile 400 (США).
Интенсивность пролиферации (ИП) определяли по кратности прироста клеток за 48-72 часа (отношение конечной концентрации клеток к исходной в пределах одного пассажа). Минимальная кратность прироста для данной культуры - не менее 4.
Для воспроизведения стандартных условий культивирования (объемы культивируемой клеточной суспензии; барботаж, рН) исследования проводились на протяжении шести пассажей.
Суспензионную культуру клеток выращивали и заражали вирусом согласно «Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов». Для заражения клеток использовали куль-туральный вирус штаммов «А /Киргизия/07 №2045» и «О1 1618».
Для обработки результатов исследований использовали статистические методы, применяемые в биологии [3].
Известно, что корреляция - это статистическая взаимосвязь двух или нескольких случайных величин.
Коэффициент корреляции (К) может принимать значение от +1 до -1 в зависимости от тесноты связи. При полной прямой корреляции R равен +1, при полной обратной - -1. Когда корреляция отсутствует, коэффициент близок к 0. Обычно считают, величина R в интервале 0,20-0,30 свидетельствует о наличии слабой, в интервале 0,50-0,60 - средней, а в интервале 0,80-0,90 - сильной (тесной) корреляции между признаками [3].
Результаты и обсуждение
С помощью биохимического анализатора BioProfile 400 измеряли содержание глюкозы, лактата, давление кислорода в исходной питательной среде и в динамике во всех пассажах производственного цикла культивирования клеток ВНК-21/2-17. Результаты проведенных исследований представлены на рисунках 1 и 2.
Результаты исследований, представленные на рисунке 1, позволяют говорить о том, что в каждом рассматриваемом пассаже производственного цикла - от размораживания
Последователи ше пассаж [
н глюкоза У лактат
0 24 48 72 О 24 48 0 24 48 0 24 48 0 24 48
Время культивирования, часы
Рис. 1. Динамика изменения содержания глюкозы и лактата в питательной среде в процессе культивирования клеток ВНК-21/2-17.
Последовательные пассажи
кЫш
0 24 48 72 0 24 43 0 24 4$ 0 24 49 0 0
В]>;мя >'■ и щлроеання, часы
Рис. 2. Динамика изменения давления кислорода в питательной среде в процессе культивирования клеток ВНК-21/2-17.
Рис 3. Интенсивность прироста клеток ВНК-21/2-17 в различных пассажах.
(1-й пассаж) до получения производственного объема клеточной суспензии (6-й пассаж) -идет активная утилизация глюкозы клетками ВНК-21/2-17, т. е. ее содержание постепенно понижается от начала культивирования до окончания (48 часов) в каждом последовательном пассаже. Так, количество глюкозы уменьшалось в 1,86 раз в первом пассаже до 2,76 раз - в шестом (различия существенны, р < 0,001). В то же время в каждом пассаже производственного цикла наблюдается увеличение содержания лактата в питательной среде от начала культивирования до окон-
14704334
чания культивирования (48 часов) в каждом последовательном пассаже. Количество лак-тата возрастало от нуля до 1,37 г/дм3 (более чем в сто раз) в первом пассаже и в 8,88; в 4,1; в 6,25; в 5,5; в 7,1 раз во 2-6 пассажах, соответственно (различия существенны, р < 0,001).
Было отмечено (рис. 2), что, начиная с 4-го пассажа, парциальное давление кислорода в среде падало в 1,4-2,1 раз по сравнению с первыми пассажами (различия существенны, р < 0,001). Первые три пассажа, вероятно, происходит адаптация клеток после криоконсервирования, с чем и связано более высокое потребление кислорода по сравнению с последующими пассажами. В 4-м пассаже заметно уменьшалась интенсивность прироста клеток (рис. 3): в 1,36 раз по сравнению с первым и в 1,83 - с пятым. Предположительно, это напрямую связано с соотношением воздушной и водной фазы. В 4-м пассаже суспензии клеток ИП упала в 1,7-1,9 раз, а в 5 и 6 пассажах - в 1,25 и в 1,18, соответственно. Это зависело от условий культивирования в каждом конкретном пассаже (соотношений воздушной и водной фазы, барботажа, рН и т. д.).
Проведенный нами анализ полученных результатов показал наличие тесной корреляции между содержанием глюкозы и парциальным давлением кислорода (Я = 0,697). Коэффициент корреляции между количеством лактата и давлением кислорода также был достаточно высок и составлял 0,7597 (табл.).
Так как в процессе выращивания клеток образуется лактат (молочная кислота), то можно предположить, что имеет место анаэробный гликолиз, который происходит при недостаточном количестве кислорода. Кроме того, лактат интенсивно закисляет клеточные суспензии.
Поскольку молочная кислота может элиминироваться только путем превращения в пируват, то концентрация лактата тесно связана с метаболизмом пирувата [5]. Так, из литературных данных известно, что ионы водорода сначала связываются с бикарбонатом и другими буферами, а затем поглощаются при утилизации лактата через глюконеогенез. Таким образом, поддерживается кислотно-щелочное равновесие [5].
Обратная корреляция содержания лак-тата с парциальным давлением кислорода (Я = -0,76) и с количеством ионов НСО3-(Я = -0,77) (табл.) является косвенным доказательством глюконеогенеза, т. е. дальнейшей утилизации лактата.
Известно, что ионы калия играют большую роль в белковом синтезе, гликолизе, функционировании натрий-калиевого насоса и других процессах. Важность натрий-калиевого насоса определяется тем, что непрерывное откачивание из клетки натрия и нагнетание в нее калия необходимо для осуществления многих жизненных процессов: осморегуляции, сохранения клеточного объема, поддержания разности потенциалов по обе стороны мембраны, поддержания элек-
№ Физико-химиче ские Коэффициент корреляции
показатели Глюкоза Лактат
1 Парц.давление О2 0,6970 -0,7597
2 Парц.давление СО2 0,2588 -0,390
3 НСО3- 0,6719 -0,7733
4 -0,9748 0,9672
5 рН 0,708 -0,8152
6 № -0,6752 0,5893
7 К+ 0,8291 -0,7969
8 Осмомоляльность -0,8521 0,8192
9 Конц. клеток -0,9689 0,9265
Таблица.
Изучение корреляции между содержанием глюкозы, лактата и различными физико-химическими показателями среды (К = 19)
трическои активности в нервных и мышечных клетках, для активного транспорта через мембраны других веществ (сахаров, аминокислот).
Примерно треть всеИ АТФ, расходуемой животной клеткой в состоянии покоя, затрачивается именно на поддержание работы натрий-калиевого насоса. Если каким-либо внешним воздействием подавить дыхание клетки, т. е. прекратить поступление кислорода и выработку АТФ, то ионный состав внутреннего содержимого клетки начнет постепенно меняться, затем он придет в равновесие с ионным составом среды, окружающей клетку, и в этом случае наступает ее смерть [6].
В представленной таблице показана корреляция между содержанием глюкозы, лак-тата и различными физико-химическими показателями среды. Так, коэффициент корреляции между содержанием глюкозы и количеством ионов К+ составил 0,83; содержанием ионов - минус 0,68. Это является косвенным доказательством участия данных ионов в процессе гликолиза.
Коэффициент корреляции (Д) между количеством глюкозы и ионами аммония составил минус 0,97, что говорит о расходовании различных аминокислот на нужды клетки путем гликолиза. Таким образом, можно предположить, что клетки использовали глюкозу для синтеза некоторых заменимых аминокислот, а также жирных и нуклеиновых кислот.
На следующем этапе работы мы изучали репродукцию вируса ящура в среде с различным содержанием глюкозы. Результаты исследований представлены на рисунках 4, 5, 6.
В результате проведенных исследований было установлено, что высокий выход им-муногенных компонентов при репродукции вируса ящура в КС наблюдался при концентрации глюкозы 0,2, 0,4 и 0,8 % (0,68±0,014, 0,65±0,020 и 0,62±0,038 мкг/см3, соответственно) (рис. 4). При снижении концентрации глюкозы до 0,1 % повышалось значение рН на 0,2-0,4 единицы и снижался выход иммуногенных компонентов в 2,75 раза; различия существенны, р < 0,001. Кроме того, при понижении концентрации глюкозы было
Ра Культиваторстекляннын ■ Культиватор металлический
0,1 0.? 0,1 0,6 Концентрация глюкозы в тггпггельноп среде,: >
Рис. 4. Количесво иммуногенных компонентов вируса ящура в 1 млн клеток ВНК-21/2-17 при репликации в среде с различным содержанием глюкозы.
-Л
1
1 I 1 1
\ = I Ё =
В ь
20 18 16
10
6 4
3 о
0,1 0,1 О.а 0,8
Концсягрящи гяюноэыв гоютелыюй среде. %
■ Культиьвтор стеклянный
Рис. 5. Время репродукции вируса ящура в среде с различным содержанием глюкозы.
> . г ^
я 3 10
1 60
£ =
г ; 50
I 30
I - 30
X * го
1 10
— — —
— — —
— —
■ Культиватор стеклянный
■ Культи ввтор металл лчесний
од о,г о,д о.е Концентрация глюкозы I- шггагельной среде. %
Рис. 6. ЦПД вируса ящура при репликации в среде с различным содержанием глюкозы.
замечено увеличение времени репродукции вируса на 5-6 часов и уменьшение процента пораженных клеток на 13-15 % (рис. 5, 6).
При репродукции вируса ящура в металлических культиваторах с концентрацией глюкозы также были замечены различия. Так, при концентрации 0,1 % и 0,2 % в 4,501,62 раза уменьшался выход иммуногенных компонентов, количество пораженных клеток снижалось, время репродукции вируса увеличивалось (рис. 4, 5, 6), также наблюдалось уменьшение величины рН на 0,2-0,5
единиц. Известно, что вирус ящура наиболее стабилен при рН 7,4-7,7. Сдвиги рН в кислую сторону ведут к изменению свойств вируса, распаду его капсиды на 12S частицы и разрушению незащищенной РНК [2].
Механизм репродукции вируса заключается в том, что инфицированная вирусом клетка служит источником энергии и предшественником для синтеза вирусных компонентов, а также предоставляет весь аппарат (рибосомы, тРНК, ферменты, и т. д.), необходимый для синтеза вирусных белков [7], а так как глюкоза является основным и наиболее универсальным источником энергии для обеспечения метаболических процессов клетки, то, вероятно, ее недостаток способствовал уменьшению выработки вирусных компонентов.
Заключение
В ходе проведенных исследований была изучена динамика потребления глюкозы клетками ВНК-21/2-17. Отмечено, что количество глюкозы уменьшалось от 1,86 раза в первом пассаже до 2,76 раз в шестом (различия существенны, р < 0,001). Количество лактата возрастало в 4,10-8,88 раза в зависимости от пассажа (различия существенны, р < 0,001).
Была найдена корреляция между содержанием глюкозы и парциальным давлением кислорода (Д = 0,6970), ионами К+ (Д = 0,8291), Ш+ ^ = -0,6752), НСО3- (Я = 0,6719), что косвенно подтверждало процессы гликолиза и глюконеогенеза, происходящие в клетках ВНК-21/2-17.
Мы считаем, что при культивировании клеток ВНК-21/2-17 сначала начинался процесс анаэробного гликолиза, а затем - процесс глюконеогенеза.
Корреляция между количеством глюкозы и ионами аммония (Д = -0,97) указывала на
процессы использования глюкозы для синтеза некоторых заменимых аминокислот, а также жирных и нуклеиновых кислот.
При исследовании репродукции вируса ящура в средах с различным содержанием глюкозы установлено, что наиболее высокий выход иммуногенных компонентов при культивировании в КС был отмечен при концентрации глюкозы от 0,2, до 0,8 %. При наработке вируса в металлических культиваторах также наблюдали различия: оптимальные результаты были получены при концентрации глюкозы 0,4 %.
Таким образом, для данного метода культивирования оптимальным является содержание глюкозы 0,4-0,8 %.
Список литературы
1. Биотенология клеток животных / ред. Р. Е. Спи-ер, Дж. Б. Гриффитс. - М. : Агропромиздат, 1989. -Т. 1. - 365 с.
2. Бурдов, А. Н. Ящур / А. Н. Бурдов, А. И Дудников, П. В. Малярец [и др.]. - М. : Агропромиздат, 1990. - 320 с.
3. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц - М. : Практика, 1999. - 459 с.
4. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / ред. Л. П. Дьяконов. - М. : Компания Спутник+, 2009. - 656 с.
5. Нельсон, Д. Основы биохимии Ленинджера Т. 2. Биоэнергетика и метаболизм / Д. Нельсон, М. Кокс. -М. : Бином, 2011. - 633 с.
6. Николаев, А. Я. Биологическая химия / А. Я. Николаев. - М. : МИА, 2004. - 566 с.
7. Рюкерт, Р. Р. Пикорнавирусы и их репликация / Р. Р. Рюкерт // Вирусология. - М., 1989. - Т. 2. -С. 190-256.
8. Самуйленко, А. Я. Биотехнология: учебник для вузов / А. Я. Самуйленко, Ф. И. Василевич, Е. С. Воронин [и др.] ; ред. А. Я. Самуйленко. - 2-е изд., пере-раб. - М., 2013. - 746 с.
9. Сергеев, В. А. Вирусы и вирусные вакцины / В. А. Сергеев, Е. А. Непоклонов, Т. И. Алипер. - М. : Библионика, 2007. - 523 с.
10. Фрешни, Р. Я. Культура животных клеток. Практическое руководство / Р. Я. Фрешни. - М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. - 691 с.
Ф
Наши подписные индексы в каталогах: Пресса России - 29447, Газеты. Журналы (Роспечать) - 33184
