Научная статья на тему 'ОПОСРЕДОВАННЫЙ КОНТРОЛЬ ПОЛНОТЫ ИНАКТИВАЦИИ АНТИГЕНА ВИРУСА БЕШЕНСТВА ДЛЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ ВАКЦИН С ПРИМЕНЕНИЕМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ'

ОПОСРЕДОВАННЫЙ КОНТРОЛЬ ПОЛНОТЫ ИНАКТИВАЦИИ АНТИГЕНА ВИРУСА БЕШЕНСТВА ДЛЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ ВАКЦИН С ПРИМЕНЕНИЕМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

CC BY
151
36
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ВИРУС БЕШЕНСТВА / АНТИРАБИЧЕСКАЯ ВАКЦИНА / ПОЛНОТА ИНАКТИВАЦИИ АНТИГЕНА / ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Доронин Максим Игоревич, Михалишин Дмитрий Валерьевич, Борисов Алексей Валерьевич, Мудрак Наталья Станиславовна, Михалишин Валерий Васильевич

Бешенство занимает первоочередное место среди вирусных болезней человека и животных, является одним из сверхопасных зоонозов с неизбежным летальным исходом. Рабической болезни уделяют огромное внимание международные организации (ВОЗ, МЭБ, ФАО, GARC) и ветеринарные службы многих стран мира. Важной мерой по борьбе с бешенством является иммунизация животных. Для этих целей в ветеринарии зачастую применяют инактивированные антирабические вакцины. Технология изготовления таких препаратов обязательно предусматривает проведение исследования на отсутствие вирулентного вируса бешенства в конечном продукте. В статье представлены сведения по разработке и тестированию способа опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса бешенства с применением обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции. Предлагается применение оптимизированной реакции амплификации с использованием системы оригинальных праймеров N-F и L9989-R, детектирующих протяженный участок в N-, P-, M-, G-, L-генах вируса бешенства размером 9986 п. н. С помощью данного метода выявляется наличие неповрежденной нуклеиновой кислоты вируса бешенства до процесса инактивации и ее отсутствие после воздействия инактивантами. Наличие продуктов ПЦР опосредованно свидетельствует о сохранении нуклеиновой кислоты вируса без повреждения и, как следствие, о наличии вирулентности, а отсутствие ампликонов указанного размера - о повреждении РНК и потере вирулентных свойств вирусной частицы. Показана возможность одновременного исследования большого количества проб для определения полноты инактивации антигена вируса бешенства в сырье для антирабической инактивированой вакцины в течение 5 ч. Разработанный способ позволяет с высокой степенью достоверности исследовать полноту инактивации антигена вируса бешенства. Чувствительность способа составляет 99,36 %, специфичность - 100,00 %, общая точность - 99,68 %.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Доронин Максим Игоревич, Михалишин Дмитрий Валерьевич, Борисов Алексей Валерьевич, Мудрак Наталья Станиславовна, Михалишин Валерий Васильевич

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

MEDIATED CONTROL OF THE COMPLETENESS OF INACTIVATION OF ANTIGEN OF THE RABIES VIRUS FOR RABIES VACCINES USING A POLYMERASE CHAIN REACTIO

Rabies occupies the first place among viral diseases of humans and animals, it is one of the most dangerous zoonoses with an inevitable fatal outcome. International organizations (WHO, OIE, FAO, GARC) and veterinary services in many countries of the world pay great attention to rabies. Immunization of domestic, agricultural and wild carnivores is an important measure in the fight against rabies. For these purposes, inactivated rabies vaccines are often used in veterinary medicine. The technology for the manufacture of such drugs necessarily provides for a study for the absence of virulent rabies virus in the raw material for the vaccine. The article presents information on the development and testing of a method for indirect control of the completeness of rabies virus antigen inactivation using reverse transcriptase polymerase chain reaction followed by electrophoresis of amplicons in agarose gel. It is proposed to employ an optimized amplification reaction using a system of original primers N-F and L9989-R, detecting an extended region in the N-, P-, M-, G-, L-genes of the rabies virus with a size of 9986 bp. Using this method, it is possible to detect intact rabies virus nucleic acid before the inactivation process and its absence after exposure to inactivants. The presence of PCR products indirectly indicates the preservation of the virus nucleic acid without damage and, as a consequence, the presence of virulence, and the absence of amplicons of the specified size indicates damage to the RNA and the loss of the virulent properties of the viral particle. The possibility of simultaneous study of a large number of samples to determine the completeness of inactivation of the antigen of the rabies virus in the raw material for the inactivated rabies vaccine within 5 hours is shown. The developed method allows to determine with a high degree of reliability the completeness of inactivation of the antigen of the rabies virus. The sensitivity of the method is 99.36 %, the specificity is 100.00 %, and the overall accuracy is 99.68 %.

Текст научной работы на тему «ОПОСРЕДОВАННЫЙ КОНТРОЛЬ ПОЛНОТЫ ИНАКТИВАЦИИ АНТИГЕНА ВИРУСА БЕШЕНСТВА ДЛЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ ВАКЦИН С ПРИМЕНЕНИЕМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ»

онного титра вируса бешенства в сырье для вакцин.

Исследование выполнено в рамках научного направления ФГБУ «ВНИИЗЖ» «Ветеринарное благополучие». Исследование выполнено без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы

1. Груздев К. Н. Бешенство животных. / К. Н. Груздев, А. Е. Метлин. Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2019. 394 с.

2. Патент РФ № 2712769, 27.05.2019. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов // Заявка № 2019116272. 2019, авт. Лозовой Д. А., Михали-шин Д. В., Доронин М. И., Щербаков А. В., Тимина А. М., Шишкова А. А., Борисов А. В., Стариков В. А.

3. GenBank. [Электронный ресурс] / URL: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 02.12.2020).

4. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2019 (OIE). Rabies. 2019. Ch. 3.1.17. P. 578-612.

5. Adams M. S. Thermodynamic characterization and nearest neighbor parameters for RNA duplexes

under molecular crowding conditions / M. S. Adams, B. M. Znosko // Nucleic Acids Res. 2019. N. 23; 47(7). P. 3658-3666. doi: 10.1093/nar/gkz019.

6. SantaLucia J. Jr. The thermodynamics of DNA structural motifs / J. SantaLucia Jr., D. Hicks // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure: journal. 2004. Vol. 33. P. 11-14. doi: 10.1146/annurev. biophys.32.110601.141800

7. The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com [Электронный ресурс] / URL: http://bioteachnology.com/dna/ analysis-dna-rna-wavelengths-230-260-280-nm. (Дата обращения 04.12.2020).

8. The RNA Institute college of arts and science university at Albany. The mfold Web Server. RNA Folding Form. [Электронный ресурс] / URL: http:// bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna/form1.cgi (Дата обращения: 21.12.2020).

9. Vallat B. OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. 2nd ed. Paris, France, 2008. 67 p.

10. Yue Y. Application of NASBA and RPA in detection of pathogenic bacteria / Y. Yue, J. Z. Zhang, M. J. Zhang // Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 2019. N. 10; 40(8). P. 1018-1022. doi: 10.3760/cma.j.is sn.0254-6450.2019.08.027.

11. Wang Y. The nearest neighbor and next nearest neighbor effects on the thermodynamic and kinetic properties of RNA base pair / Y. Wang, Z. Wang, Y. Wang, T. Liu, W. Zhang // J. Chem Phys. 2018. N. 28;148(4):045101. doi: 10.1063/1.5013282.

DOI: 10.24412/2074-5036-2021-2-25-34 УДК 619:578.824.11:615.371:573.6

Ключевые слова: вирус бешенства, антирабическая вакцина, полнота инактивации антигена, полимеразная цепная реакция.

Key words: rabies virus, rabies vaccine, completeness of antigen inactivation, polymerase chain reaction. Доронин М. И., Михалишин Д. В., Борисов А. В., Мудрак Н. С., Михалишин В. В.

ОПОСРЕДОВАННЫЙ КОНТРОЛЬ ПОЛНОТЫ ИНАКТИВАЦИИ АНТИГЕНА ВИРУСА БЕШЕНСТВА ДЛЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ ВАКЦИН С ПРИМЕНЕНИЕМ

ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

MEDIATED CONTROL OF THE COMPLETENESS OF INACTIVATION OF ANTIGEN OF THE RABIES VIRUS FOR RABIES VACCINES USING A POLYMERASE CHAIN REACTION

ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец

Federal Centre for Animal Health, Federal Governmental Budgetary Institution Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur 'evets

Доронин Максим Игоревич, к. б. н., вед. науч. сотрудник. E-mail:doronin@arriah.ru

Doronin Maksim Igorevich, PhD in Biological Science, Leading Researcher. E-mail:doronin@arriah.ru Михалишин Дмитрий Валерьевич, к. в. н., зав. лабораторией. E-mail:mihalishindv@arriah.ru

Мichalishin Dmitry Valerjevich, PhD in Veterinary Science, Head of the Laboratory. E-mail:mihalishindv@arriah.ru

Борисов Алексей Валерьевич, к.в.н., вед. науч. сотрудник. E-mail: borisov_av@arriah.ru

Borisol Aleksei Valerjevich, PhD in Veterinary Science, Leading Researcher. E-mail:borisov_av@arriah.ru

Мудрак Наталья Станиславовна, главный научный сотрудник. E-mail: mudrak@arriah.ru Mudrak Natalja Stanislavovna, Doctor of Biological Sciences, Chief Researcher. E-mail: mudrak@arriah.ru Михалишин Валерий Васильевич, профессор, доктор ветеринарных наук, эксперт. E-mail: mihalishin@arriah.ru

Мichalishin Valery Vasiljevich, Professor, Doctor of Veterinary Science, Expert. E-mail:mihalishin@arriah.ru

Аннотация. Бешенство занимает первоочередное место среди вирусных болезней человека и животных, является одним из сверхопасных зоонозов с неизбежным летальным исходом. Рабической болезни уделяют огромное внимание международные организации (ВОЗ, МЭБ, ФАО, GARC) и ветеринарные службы многих стран мира. Важной мерой по борьбе с бешенством является иммунизация животных. Для этих целей в ветеринарии зачастую применяют инактивированные антирабические вакцины. Технология изготовления таких препаратов обязательно предусматривает проведение исследования на отсутствие вирулентного вируса бешенства в конечном продукте. В статье представлены сведения по разработке и тестированию способа опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса бешенства с применением обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции. Предлагается применение оптимизированной реакции амплификации с использованием системы оригинальных праймеров N-F и L9989-R, детектирующих протяженный участок в N-, P-, M-, G-, L-генах вируса бешенства размером 9986 п. н. С помощью данного метода выявляется наличие неповрежденной нуклеиновой кислоты вируса бешенства до процесса инактивации и ее отсутствие после воздействия инактивантами. Наличие продуктов ПЦР опосредованно свидетельствует о сохранении нуклеиновой кислоты вируса без повреждения и, как следствие, о наличии вирулентности, а отсутствие ампликонов указанного размера - о повреждении РНК и потере вирулентных свойств вирусной частицы. Показана возможность одновременного исследования большого количества проб для определения полноты инактивации антигена вируса бешенства в сырье для антира-бической инактивированой вакцины в течение 5 ч. Разработанный способ позволяет с высокой степенью достоверности исследовать полноту инактивации антигена вируса бешенства. Чувствительность способа составляет 99,36 %, специфичность - 100,00 %, общая точность - 99,68 %.

Summary. Rabies occupies the first place among viral diseases of humans and animals, it is one of the most dangerous zoonoses with an inevitable fatal outcome. International organizations (WHO, OIE, FAO, GARC) and veterinary services in many countries of the world pay great attention to rabies. Immunization of domestic, agricultural and wild carnivores is an important measure in the fight against rabies. For these purposes, inactivated rabies vaccines are often used in veterinary medicine. The technology for the manufacture of such drugs necessarily provides for a study for the absence of virulent rabies virus in the raw material for the vaccine. The article presents information on the development and testing of a method for indirect control of the completeness of rabies virus antigen inactivation using reverse transcriptase polymerase chain reaction followed by electrophoresis of amplicons in agarose gel. It is proposed to employ an optimized amplification reaction using a system of original primers N-F and L9989-R, detecting an extended region in the N-, P-, M-, G-, L-genes of the rabies virus with a size of 9986 bp. Using this method, it is possible to detect intact rabies virus nucleic acid before the inactivation process and its absence after exposure to inactivants. The presence of PCR products indirectly indicates the preservation of the virus nucleic acid without damage and, as a consequence, the presence of virulence, and the absence of amplicons of the specified size indicates damage to the RNA and the loss of the virulent properties of the viral particle. The possibility of simultaneous study of a large number of samples to determine the completeness of inactivation of the antigen of the rabies virus in the raw material for the inactivated rabies vaccine within 5 hours is shown. The developed method allows to determine with a high degree of reliability the completeness of inactivation of the antigen of the rabies virus. The sensitivity of the method is 99.36 %, the specificity is 100.00 %, and the overall accuracy is 99.68 %.

Введение

Вспышки бешенства в мире продолжают фиксировать в различных точках земного шара. Возбудителем рабической болезни является вирус бешенства, который принадлежит порядку Mononegavirales, семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus, виду Rabies lyssavirus [3]. Геном вируса представлен не-сегментированной одноцепочечной негативной спиральной молекулой РНК длиной около 12 000 н. о., который кодирует 5 основных белков: нуклеопротеин (N-белок),

фосфопротеин (Р-белок), матриксный белок (М-белок), гликопротеин ^-белок), РНК-зависимую РНК-полимеразу ^-белок). Между G- и L-цистронами располагается псевдо-ген (у-фрагмент) ^аЬег, 2005). Размеры Р-, М-, G-, у- и L-генов в среднем составляют 1420, 990, 610, 1675, 525, 6475 н. о., соответственно [1, 4].

Экономические потери, которые возникают по причине бешенства, в мире оценивают на уровне около 6,7 млрд евро в год [4]. Комплексный подход по профилактике рабиче-

ской болезни предполагает в качестве доминирующей меры иммунизацию домашних, сельскохозяйственных и диких плотоядных животных, а также исследование уровня напряженности поствакцинального гуморального иммунитета [1]. Для формирования защитного иммунитета у животных применяют различные антирабические вакцины, в том числе культуральные инактивированные препараты, которые зарекомендовали себя в России и в мире. Для домашних плотоядных и сельскохозяйственных животных в России используют инактивированные вакцины из различных штаммов вируса бешенства, в том числе ВНИИЗЖ.

Технология изготовления антирабических инактивированных вакцин ветеринарного назначения обязательно предусматривает проведение исследования на отсутствие вирулентного вируса бешенства в сырье [11, 13]. В соответствии с требованиями Всемирной организации по охране здоровья животных при производстве антирабических вакцин для получения инактивированного антигена применяют инактиванты первого порядка, а именно Р-пропиолактон (БПЛ), 1,2-аминоэ-тилэтиленимин (АЭЭИ) [1, 2, 11].

Р-пропиолактон является внутренним циклическим эфиром Р-оксипропионовой кислоты с высокой реактогенностью. БПЛ, электрофил по своей природе, взаимодействует с нуклеиновой кислотой вируса по ок-симетиленовому углероду [14], что вызывает частичную деградацию вирусной РНК и, тем самым, утрачивается вирулентность возбудителя бешенства. В то же время антигенные свойства вирусных частиц сохраняются.

АЭЭИ - циклический амин, который вступает в реакцию замещения водорода в №Н-связи вирусной РНК с сохранением цикла инактиванта. Данный процесс приводит к деградации нуклеиновой кислоты вируса, а также формированию соединений, подобных 7-(2-аминоэтил) гуанидину [10], в результате этого утрачивается вирулентность возбудителя, но при этом сохраняется антигенные свойства частицы вируса.

Представленные инактиванты I порядка вызывают потерю инфекционных свойств вируса бешенства за счет многочисленных

делеций и повреждений вирусной РНК, присоединение новых функциональных групп к нуклеотидам, и даже разрушения вирусного генома до низкомолекулярных фрагментов [2, 5, 10, 14]. В результате процессы обратной транскрипции, трансляции и про-цессинга белков вируса и, как следствие, репродукции и сборки вириона in vivo и in vitro становятся невозможными. Разрывы в N-, P-, M-, G-генах приводят к прекращению процесса синтеза важнейших белков вируса бешенства. Разрушения РНК в L-гене делает невозможным синтез фермента РНК-зависимой-ДНК-полимеразы, иными словами, не осуществляется репликация нуклеиновой кислоты вируса и, как следствие, воспроизводство вирионов [1]. Таким образом, при одном из указанных повреждений вирус бешенства утрачивает свои вирулентные свойства. Этот феномен можно определить с помощью молекулярно-биологическо-го исследования.

Полноту инактивации верифицируют с использованием теста на остаточное содержание вирулентного вируса бешенства в чувствительной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 с применением реакции иммунофлуоресценции (РИФ) [11]. Существенными недостатками указанного метода являются: длительная процедура анализа, связанная с репродукцией вируса (не менее 4 суток для каждого из трех пассажей); субъективность при оценке результатов исследования; высокая стоимость культуры клеток и затраты на ее поддержание. В связи с этим целесообразно разработать способ контроля полноты инактивации антигена вируса бешенства с применением молекуляр-но-биологического исследования, который является более быстрым, менее затратным методом и отличается при этом высокой степенью надежности. Так, для определения остаточной вирулентности вирусов классической чумы свиней, инфекционного бронхита кур, эховирусов и др. в последние годы стали применять обратно-транскриптазную полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) с последующей детекцией продуктов реакции с помощью горизонтального электрофореза,

а также биофизический метод с применением рестрикционного и электрофоретическо-го анализа (Закутский Н. И., Луницин А. В., 2016) [5]. Для контроля полноты инактивации антигена вируса бешенства в вирионных вакцинах данный метод ранее не применялся. Для работы с РНК-содержащим вирусом бешенства было решено взять за основу ОТ-ПЦР [6, 8, 9].

В настоящее время данный метод применяют только для проведения диагностики рабической болезни, типирования и молеку-лярно-эпидемиологических исследований вируса бешенства, а также для дифференциации штаммов с применением штаммоспе-цифических праймеров (Tordo et al., 1995, 1996; Цыбанов с соавт., 2002; David et al., 2002; Rimhanen-Finne et al., 2010; Dacheux et al., 2010). Данный метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью, объективностью анализа данных и быстротой проведения исследования. За счет оптимизации условий постановки анализа и разработке штаммоспецифичных оригинальных праймеров, позволяющих детектировать фрагменты большой длины, подборе необходимых контролей, можно проводить анализ степени повреждения вирусного генома и, как следствие, исследование полноты инактивации антигена вируса бешенства.

Цель исследования заключалась в разработке и тестировании высокочувствительного и высокоспецифичного способа опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса бешенства при производстве антирабических вакцин для ветеринарии с применением ОТ-ПЦР.

Материалы и методы

Контрольные образцы. При проведении контроля полноты инактивации антигена вируса бешенства использовали следующие контрольные образцы:

- ПКО „ттт, - положительный контроль-

выд-е РНК г

ный образец на этапе выделения РНК (исходный неинактивированный вирус бешенства);

- ПКОПцР - положительный контрольный образец на этапе ПЦР (проверенная комплементарная (кДНК) неинактивированного вируса бешенства);

- ВКОвыд е РНК - внутренний контрольный образец на этапе выделения РНК (исходный неинактивированный вирус ящура);

- ВКОПцР - внутренний контрольный образец на этапе ПЦР (проверенная кДНК не-инактивированного вируса ящура);

- ОКО - отрицательный контрольный образец, контроль фона (деионизированная вода);

- ОИКОвыд-е РНК - отрицательный инакти-вированный контрольный образец на этапе выделения РНК (инактивированная суспензия вируса бешенства);

- ОИКОПцР - отрицательный инактивиро-ванный контрольный образец на этапе ПЦР (проверенная кДНК вируса бешенства, выделенная из инактивированной суспензии).

Выделение РНК. На данном этапе использовали исследуемый материал, а также кон-троли ПКО РНК, ВКО РНК, ОИКО РНК,

выд-е РНК выд-е РНК выд-е РНК

ОКО. Для лизиса поверхностных белковых структур вируса бешенства использовали раствор, содержащий 50 % карболовой кислоты (рН<7,0) и 50 % 4М раствора гуаниди-низотиоцананата. Фракционирование проводили с помощью хладона-20, 80 %-ного пропанола-2, 80 %-ного этанола и центрифугирования при 14 000 об/мин. Для работы отбирали верхнюю фракцию, представляющую собой экстракт РНК [7]. Элюирование РНК проводили в воде для молекулярно-био-логических исследований.

Оценка степени чистоты экстрактов РНК. Степень чистоты выделенных элюатов РНК исследовали с помощью спектрального анализа по общепринятой методике [12].

Проведение ОТ-ПЦР. Для проведения реверсии РНК вируса бешенства готовили реакционную смесь с использованием набора реагентов для обратной транскрипции с гек-самерами Applied Biosystems™ GeneAmp™. В качестве фермента использовали высокоточную ревертазу Maxima H Minus. Реакцию осуществляли при температуре 42 °С в течение 60 мин за 1 цикл. Полученную в реакции обратной транскрипции кДНК исследовали в реакции амплификации. На данном этапе в дополнение к контролям, которые применяли на стадиях выделения РНК и обратной транскрипции, использовали дополнитель-

ные контроли: ПКОпцр, ВКОПЦР, ОИКОПЦр. Для проведения реакции использовали оригинальные праймеры (дизайн представлен в разделе «Результаты исследований и обсуждение») в концентрации 20 пМ на реакцию, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с концентрацией каждого в ПЦР-смеси по 0,25 мМ и хлорида магния - 3 мМ. В качестве катализатора реакции амплификации применяли высокоточную ДНК-полимеразу Platinum High Fidelity (2,5 ед.). Количество кДНК составляло 3/25 от объема реакционной смеси. Объем ПЦР-смеси компонентов вместе с кДНК для проведения одной реакции составлял 25 мкл.

Активацию ДНК-полимеразы проводили при температуре 94 °С за 180 с в течение 1 цикла. Реакцию амплификации осуществляли в течение 35 циклов, каждый из которых складывался из 3 подэтапов: «денатурация», проводимая при температуре 94 °С в течение 60 с, «отжиг праймеров» -при температуре 58 °С в течение 60 с, «элонгация» - при температуре 72 °С в течение 90 с. Финишную денатурацию осуществляли при температуре 72 °С в течение 180 с. Для постановки реакции использовали амплифи-катор Eppendorf Mastercycler GSX1 (или аналог). Суммарное время ОТ-ПЦР составляет 3 ч. 04 мин.

Детекцию ампликонов проводили с помощью горизонтального электрофореза в 1 %-м агарозном геле с применением 0,0005 % бромистого этидия, интеркалирущего между азотистыми основаниями ПЦР-продуктов.

Определение чувствительности,

специфичности и общей точности метода. Чувствительность метода определяли по формуле: Ч = ДП/(ДП+ЛО), где Ч -диагностическая чувствительность, ДП -достоверноположительный результат, ЛО -ложноотрицательный результат. Специфичность метода определяли по формуле: Сп = ДО/(ДО+ЛП), где Сп - диагностическая специфичность, ДО - достоверно-отрицательный результат, ЛП - ложнопо-ложительный результат. Общую точность теста определяли по формуле: Т = (ДП+ДО)/ (ДП+ДО+ЛП+ЛО), где Т - общая точность, ДП - достоверноположительный результат,

ДО - достоверноотрицательный результат, ЛП - ложноположительный результат, ЛО -ложноотрицательный результат.

Результаты исследований и обсуждение

На первом этапе работы проводили исследования по разработке способа контроля полноты инактивации антигена вируса бешенства при производстве антирабических вакцин для ветеринарии с применением ОТ-ПЦР. Для этого выделяли РНК вируса бешенства до и после процесса инактивации в соответствии с процедурой, описанной в разделе «Материалы и методы», исследовали степень чистоты полученных элюатов РНК спектральным методом; проводили синтез кДНК и реакцию амплификации, предполагающую использование системы оригинальных прай-меров, детектирующих протяженный участок для Р-, М-, G-, L-генах вируса с размером 9989 п.н., с последующей детекцией амплико-нов методом горизонтального электрофореза. По итогам анализа оценивали наличие или отсутствие продуктов полимеразной цепной реакции в виде светящихся полос в потоке ультрафиолетового света при длине волны 312 нм. На основании полученных треков ампликонов делали заключение о целостности участков генома вируса бешенства и, как следствие, о полноте инактивации антигена. Для проведения указанной процедуры требуется около 5 ч.

Для амплификации большеразмерного участка генома вируса бешенства впервые была разработана система оригинальных праймеров, дизайн которых представлен в таблице 1 и на рисунке 1.

Для анализа применяли следующие оли-гонуклеотиды:

1) №Р (для участка высококонсервативного гена N вируса бешенства, кодирующего нуклеопротеин);

2) L9989-R (для участка L-гена вируса бешенства, несущего информацию о РНК-зависимой ДНК-полимеразе). Указанная система праймеров позволяла амплифици-ровать ПЦР-продукты вируса бешенства с размером 9989 п.н., соответственно.

Предложены критерии интерпретации данных реакции амплификации при

Таблица 1

Дизайн олигонуклеотидных праймеров для реакции амплификации при использовании способа контроля полноты инактивации антигена вируса бешенства

№ п/п Наименование праймера Локализация прай-мера в геноме Первичная структура олигонукле-отидного праймера (5'-3') Размер участка генома, п.н.

1 N-F ген N CGCACGCTTAACAACCAGAT 9989

2 L9989-R ген L ATTCTCTGGAGACGCCGTGA

контроле полноты инактивации антигена вируса бешенства в сырье для вакцин. Важным условием качественно проведенных исследований являются результаты испытания контрольных образцов. Если ПКО

РНК'

выд-е

ПКОПЦР, ВКО РНК, ВКО после всех

ПЦР выд-е РНК ПЦР

стадий исследования в горизонтальном электрофорезе дают положительный результат (наличие ампликонов), а ОКО, ОИКОвыд е РНК, ОИКОПцР - отрицательный результат (отсутствие ампликонов), то в таком случае стадии выделения РНК, обратной транскрипции и реакции амплификации проведены верно, и можно учитывать результаты исследуемых проб. Если в треке исследуемой пробы обнаружены светящиеся продукты ПЦР, то анализируемый участок нуклеиновой кислоты вируса бешенства не поврежден, следовательно, данный образец считается неинак-тивированным или неполностью инактиви-рованным (рисунок 2, позиция 1). Если во всех треках свечение ампликона отсутствует, то данный участок генома вируса бешенства поврежден, тем самым, репликация вируса бешенства невозможна и он считается ави-рулентным (рисунок 2, позиция 2). Иными словами, на основании отсутствия ПЦР-продуктов исследуемой пробы по сравнению

с положительными контролями позволяет сделать заключение о разрушении нуклеиновой кислоты вируса бешенства в инактиви-рованных суспензиях и, как следствие, об отсутствии вирулентного вируса. В том случае, если обнаружены несоответствия в результатах анализа контролей, требуется повторно провести исследование.

На следующем этапе анализа проводили исследование процесса инактивации вируса бешенства в течение 24 ч Р-пропиолактоном с помощью разработанного способа в сравнении с традиционным методом РИФ в моно-слойной клеточной линии ВНК-21. Суспензию вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ с титром инфекционной активности 7,25 ^ ККИД50/см3, по данным титрования в перевиваемой монослойной клеточной линии ВНК-21, сразу после репродукции в суспензионной культуре клеток ВНК-21 разделили на 3 емкости и подвергали процессу инактивации с применением БПЛ:

1 флакон - концентрация БПЛ 0,025 %, температура инактивации плюс 36-37 °С, экспозиция - 4 ч;

2 флакон - концентрация БПЛ 0,050 %, температура инактивации плюс 36-37 °С, экспозиция - 4 ч;

_Jj 10 20 30 40 50 60 70 80 90

SZ^^H....................

L9989-R-fov L9989-R-rev

Рис. 1. Дизайн праймеров для амплификации большеразмерного фрагмента кДНК вируса бешенства (RabV - участок генома вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ, fov - прямой праймер, rev - обратный праймер, темной полосой выделен интересующий праймер)

3 флакон - концентрация БПЛ 0,050 %, температура инактивации плюс 36-37 °С, экспозиция - 0,5 ч, далее температура - плюс 4 °С, экспозиция - 23,5 ч.

Водородный показатель вирусной суспензии поддерживали в диапазоне 7,2-7,6. Суспензии подвергали тщательному перемешиванию в течение 3-5 минут через каждый час. Параллельно исследовали вирус бешенства штамма ВНИИЗЖ, не подвергнутый инактивации, экспозиция которого проводилась при той же температуре и в тот же период времени (контроль инактивации).

Для определения времени полной инактивации после добавления химического агента через 2 ч в стерильных условиях производили отбор проб из всех флаконов. Исследование проводили в трех повторностях. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса бешенства в РИФ, а также разработанным способом контроля полноты инактивации антигена вируса бешенства с помощью ОТ-ПЦР. По результатам электрофореза контролей в ОТ-ПЦР, все стадии реакции проведены правильно, и можно учитывать полученные данные исследуемых суспензий вируса бешенства, подвергнутых

Рис. 2. Электрофореграмма по результатам контроля полноты инактивации антигена вируса бешенства в сырье для вакцин (позиция 1 - проба не инактивиро-вана, позиция 2 - проба инактивирована)

влиянию Р-пропиолактона. Результаты анализа в РИФ и ОТ-ПЦР отражены в таблице 2.

Из данных, представленных в таблице 2, видно, что контроль инактивации (вирус бешенства, не подвергнутый инактивации,

Таблица 2

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Исследование остаточной инфекционности вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в суспензии после воздействия р-пропиолактоном в разных концентрациях

при температуре 36-37 °С (п=3)

Условия инактивации Результаты определения полноты инактивации вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ

концентрация БПЛ, % температура, °С экспозиция, ч ОТ-ПЦР РИФ

2 ч 4 ч 8 ч 12 ч 16 ч 20 ч 24 ч 2 ч 4 ч 8 ч 12 ч 16 ч 20 ч 24 ч

0,025 36-37 4 +

0,050 36-37 4 +

0,050 36-37 0,5 + + + + + + + + + +

4-5 23,5

0,000 (контроль инактивации) 36-37 4 + + + + + + + + + + + + + +

0,000 (кон- 36-37 0,5

троль инактивации) 4-5 23,5 + + + + + + + + + + + + + +

Примечание: контроль инактивации - вирус бешенства, экспозиция которого проходила при той же температуре и времени, но без химического агента; ОТ-ПЦР: «+» - нуклеиновая кислота вируса бешенства не разрушена, «-» - нуклеиновая кислота вируса бешенства разрушена; РИФ: «+» - наличие специфического свечения иммунных комплексов, «-» - отсутствие специфического свечения иммунных комплексов.

экспозиция при температуре 36-37 °С через 4 ч, а также при экспозиции в течение 0,5 ч при температуре 36-37 °С и 23,5 ч при температуре 4 °С через 24 ч) сохранял вирусную нуклеиновую кислоту без повреждений при детекции в электрофорезе. При этом полная инактивация вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ Р-пропиолактоном с концентрацией 0,025 % при температуре 36-37 °С достигалась через 4 ч, с концентрацией 0,050 % при температуре 36-37 °С - через 4 ч, с концентрацией 0,050 % при температуре 36-37 °С в течение 2 ч и при температуре 4 °С в течение 23,5 ч - через 20 ч.

В инактивированных суспензиях вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ полностью отсутствовали продукты ПЦР нужного размера, что свидетельствовало о прохождении полной инактивации вируса. Полученные результаты были подтверждены в РИФ. Таким образом, определение полноты инактивации вирусного сырья после воздействия БПЛ с помощью ОТ-ПЦР не уступает по своей эффективности традиционному методу и позволяет значительно сократить время проведения анализа.

На следующем этапе работы исследовали процесс инактивации вируса бешенства

штамма ВНИИЗЖ в течение 24 ч 1,2-аминоэ-тилэтиленимином с помощью разработанного способа в сравнении с традиционным методом РИФ в культуре клеток ВНК-21. Для работы использовали ту же суспензию вируса, что и для опыта с БПЛ. Суспензию вируса сразу после его культивирования подвергали процессу инактивации с применением АЭЭИ (рН 8,2-8,6) с концентрацией 0,025 % при температуре 36-37 °С в течение 24 ч. Водородный показатель вирусной суспензии поддерживали в диапазоне 7,2-7,6. Суспензию подвергали тщательному перемешиванию в течение 3-5 минут через каждый час. Параллельно исследовали вирус бешенства штамма ВНИИЗЖ, не подвергнутый инактивации, экспозиция которого проводилась при той же температуре и в тот период времени. Исследование проводили в 5 повторностях.

Для определения времени полной инактивации после добавления химического агента через 2, 4, 7, 8, 12, 20 и 24 ч в стерильных условиях производили отбор проб. Полученные образцы исследовали на наличие инфекционной активности вируса бешенства в РИФ, а также с помощью разработанного способа. Результаты исследования в РИФ

Таблица 3

Исследование остаточной инфекционности суспензий вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ после воздействия 0,025 % 1,2-аминоэтилэтиленимина при температуре 36-37 °С

Наименование пробы № повтор-ности Результаты определения полноты инактивации вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ

ОТ-ПЦР РИФ

2 ч 4 ч 7 ч 8 ч 12 ч 20 ч 24 ч 2 ч 4 ч 7 ч 8 ч 12 ч 20 ч 24 ч

инактивирован-ная проба 1 + + + - - - - + + + - - - -

2 + + + - - - - + + + - - - -

3 + + + - - - - + + + - - - -

4 + + + - - - - + + + - - - -

5 + + + - - - - + + + - - - -

контроль инактивации 1 + + + + + + + + + + + + + +

2 + + + + + + + + + + + + + +

3 + + + + + + + + + + + + + +

4 + + + + + + + + + + + + + +

5 + + + + + + + + + + + + + +

Примечание: контроль инактивации - вирус бешенства, экспозиция которого проходила при той же температуре и времени, но без химического агента; ОТ-ПЦР: «+» - нуклеиновая кислота вируса бешенства не разрушена, «-» - нуклеиновая кислота вируса бешенства разрушена; РИФ: «+» - наличие специфического свечения иммунных комплексов, «-» - отсутствие специфического свечения иммунных комплексов.

Таблица 4

Пределы диагностических возможностей теста опосредованного определения полноты инактивации антигена вируса бешенства в сырье для вакцины с применением ОТ-ПЦР при амплификации большеразмерного фрагмента

Показатели Результаты анализа

РИФ ОТ-ПЦР

ДП 314 312

ДО 314 314

ЛП 0 0

ЛО 0 0

Всего: 628 628

Чувствительность, % 100,00 99,36

Специфичность, % 100,00 100,00

Общая точность, % 100,00 99,68

Примечание: ДП - достоверноположительный результат, ДО - достоверноотрицательный результат, ЛП - лож-ноположительный результат, ЛО - ложноотрицательный результат.

и ОТ-ПЦР отобранных суспензий вируса бешенства после экспозиции с АЭЭИ и без него отражены в таблице 3.

Из данных, представленных в таблице 3, видно, что по данным ОТ-ПЦР контроль инактивации (вирус бешенства, не подвергнутый инактивации, экспозиция при температуре 36-37 °С в течение 24 ч) сохранил вирусную кДНК без повреждений в участке длиной 9986 п.н. Полная инактивация вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ 1,2-амино-этилэтиленимином с концентрацией 0,025% при температуре плюс 36-37 °С достигается через 8 ч. Спустя этот период времени продукты ПЦР в указанной тест-системе полностью отсутствовали, что свидетельствовало о прохождении полной инактивации вируса. Полученные результаты были подтверждены в РИФ. Таким образом, опосредованное определение полноты инактивации вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ после воздействия АЭЭИ с помощью ОТ-ПЦР не уступает по своей эффективности традиционному методу и позволяет сократить время проведения исследования до 5 ч.

На заключительном этапе исследования проводили тестирование разработанного способа контроля полноты инактивации антигена вируса бешенства при производстве антирабических вакцин для ветеринарии с применением метода ОТ-ПЦР. Для опреде-

ления чувствительности разработанного теста опосредованного определения полноты инактивации антигена вируса ящура исследовали 314 образцов суспензий, которые являлись истинно инактивированными по данным исследования в РИФ. Постановку теста проводили, как отражено выше. В результате анализа в ОТ-ПЦР при амплификации большеразмерного фрагмента генома вируса бешенства определили, что из 314 истинно инактивированных образцов суспензий 312 определены в качестве инактивированных, а 2 - в качестве неинактивированных, т.е. количество ДП составило 312, а ЛО - 2 (таблица 4). Таким образом, чувствительность теста составила 99,36 %.

Для исследования специфичности метода тестировали 314 образцов суспензий, которые являлись истинно неинактивированны-ми по данным исследования в РИФ. В результате исследования в ОТ-ПЦР определили, что из 314 истинно неинактивированных суспензий 314 определены в качестве неинак-тивированных, статус инактивированных суспензий присвоен не был, т. е. количество ДО составило 360 (таблица 4). Таким образом, специфичность разработанного теста составила 100,00 %. Учитывая полученные данные рассчитали общую точность метода, которая соответствовала 99,68 %. Следует также отметить, что с помощью разработан-

ного способа одновременно проверяли до 96 образцов (7 контролей и 89 исследуемых образцов), учитывая возможности амплифика-тора.

Заключение

Разработан способ опосредованного контроля полноты инактивации антигена вируса бешенства с применением обратно-транс-криптазной полимеразной цепной реакции с последующим электрофорезом ампликонов в агарозном геле.

Предлагается применение оптимизированной ОТ-ПЦР с использованием системы оригинальных олигонуклеотидных прай-меров N-F и L9989-R, детектирующих протяженный участок в Р-, М-, G-, L-генах вируса бешенства размером 9986 п.н., с последующим электрофорезом ампликонов в агарозном геле. С помощью данного метода возможно выявлять неповрежденную нуклеиновую кислоту вируса бешенства до процесса инактивации и ее отсутствие после воздействия инактивантами. Наличие продуктов ПЦР опосредованно свидетельствует о сохранении нуклеиновой кислоты вируса без повреждения и, как следствие, о наличии вирулентности, а отсутствие ам-пликонов указанного размера - о повреждении РНК и потери вирулентных свойств вирусной частицы.

Определена возможность одновременного исследования большого количества проб (до 89) для определения полноты инактивации антигена вируса бешенства в сырье для антирабической инактивированой вакцины в течение 5 ч.

Доказано, что разработанный способ позволяет с высокой степенью достоверности определять полноту инактивации антигена вируса бешенства. Выявлено, что чувствительность способа составила 99,36 %, специфичность - 100,00 %, общая точность -99,68 %.

Исследование выполнено в рамках научного направления ФГБУ «ВНИИЗЖ» «Ветеринарное благополучие». Исследование выполнено без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы

1. Груздев К. Н. Бешенство животных. / К. Н. Груздев, А. Е. Метлин. Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2019. 394 с.

2. Курашова С. С. Сравнительная характеристика инактивирующих агентов для создания вакцин против геморрагической лихорадки с почечным синдромом / С. С. Курашова, А. А. Ишмухаметов, М. С. Егорова [и др.] // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2018. № 17(4). С. 26-29.

3. Метлин А. Е. Современные аспекты классификации лиссавирусов / А. Е. Метлин // Ветеринария сегодня. 2017. № 3 (22). С. 52-57.

4. Метлин А. Е. Комплекс средств и методов диагностики и борьбы с бешенством: автореферат ... д. вет. н. / А. Е. Метлин. Казань, 2018. 48 с.

5. Федоров Д. Г. Усовершенствование технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против классической чумы свиней: Автореферат. . к. вет. н. / Д. Г. Федоров. Покров, 1999. 24 с.

6. Barrat, J. Rabies diagnosis / J. Barrat, E. PicardMeyer, F. Cliquet // Developments in Biologicals. 2006. Vol. 125. P. 71-77.

7. Chomczynski P. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. / Р. Chomczynski, N. Sacchi // Nat Protoc. 1 (2). 2006. P. 581-585.

8. GenBank. [Электронный ресурс] / URL: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 22.01.2021).

9. Ito M. Detection of rabies virus RNA isolated from several species of animals in Brazil by RT-PCR / M. Ito, T. Itou, T. Sakai, M. F. Santos, Y. T. Arai, T. Takasaki, I. Kurane, F. H. Ito // J. Vet. Med. Sci. 2001 Dec;63(12):1309-13. doi: 10.1292/jvms.63.1309.

10. Khazaie Y. Poly[N-(2-aminoethyl)ethyleneimine] as a new non-viral gene delivery carrier: the effect of two protonatable nitrogens in the monomer unit on gene delivery efficiency / Y. Khazaie, F. A. Dorkoosh, L. Novo, E. Van Gaal, A. Fassihi, S. Z. Mirahmadi-Zareh, M. H. N. Esfahani, C. F. Van Nostrum, W. E. Hen-nink // J. Pharm. Pharm. Sci. 2014. N. 17(4). P. 461-474. doi: 10.18433/j3r015.

11. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2019 (OIE). Rabies. 2019. Ch. 3.1.17. P. 578 -612.

12. TheAnalysis of DNA or RNAusing Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com [Электронный ресурс] / URL: http://bioteachnology.com/dna/ analysis-dna-rna-wavelengths-230-260-280-nm. (Дата обращения 13.01.2021).

13. WHO Rabies vaccines: WHO position paper-recommendations. Vaccine. 2010. Vol. 28. P. 7140-7142.

14. P-Propiolactone. National Toxicology Program Rep Carcinog. 2011. N. 12. P. 366-367.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.