Научная статья на тему 'СПОСОБ ОПОСРЕДОВАННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ИНФЕКЦИОННЫХ ДОЗ ВИРУСА БЕШЕНСТВА В НЕИНАКТИВИРОВАННОМ СЫРЬЕ ДЛЯ ВАКЦИНЫ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ'

СПОСОБ ОПОСРЕДОВАННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ИНФЕКЦИОННЫХ ДОЗ ВИРУСА БЕШЕНСТВА В НЕИНАКТИВИРОВАННОМ СЫРЬЕ ДЛЯ ВАКЦИНЫ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

CC BY
35
20
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
КОЛИЧЕСТВО ИНФЕКЦИОННЫХ ДОЗ ВИРУСА БЕШЕНСТВА / АНТИРАБИЧЕСКАЯ ВАКЦИНА / РЕАКЦИЯ АМПЛИФИКАЦИИ / ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Доронин М. И., Михалишин Д. В., Борисов А. В., Груздев К. Н.

Технологический контроль при изготовлении живой антирабической вакцины из штамма РВ-97 вируса бешенства требует определения количества инфекционных доз вируса. В статье представлено описание способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для живой вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ. Данный способ позволяет снизить время проведения анализа до 4 ч, увеличить чистоту РНК вируса бешенства штамма РВ-97 за счет использования метода твердофазной экстракции с применением частиц цеолита, увеличить чувствительность и специфичность за счет применения оригинальных специфических олигонуклеотидов, удешевить исследование по сравнению с методом РИФ в клеточном монослое. Между значением количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 и пороговым циклом амплификации выявлена зависимость, отраженная в виде показательной функции с основанием 10 с высокими достоверностью аппроксимации (R2 = 0,9927) и эффективностью амплификации 99,99 %. Разработанная математическая модель КИДВБ РВ-97 = 10л(-о,3о12-а +10,2040) позволяет определять количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для производства антирабической вакцины. В результате тестирования выявлено, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с результатами реакции иммунофлуоресценции в культуре клеток на 99,5-100 % для 1080-70 ККИД50/мл (n=70), на 98-99,5 % для 107 0-40 ККИД50/мл (n=70), на 97-98,5% для 104 0-3 0 ККИД50/мл (n=70), на 94-98 % для 103 0-2 0 ККИД50/мл (n=70), на 93-98 % для 1020-1 0 ККИД50/мл (n=70). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа. Аналитическая чувствительность метода составила 101 ККИД50/мл, диагностическая чувствительность - 99,76 % (n=412), специфичность - 100,00 % (n=412), общая точность - 99,88 % (n=412). При исследовании прецизионности представленного способа в условиях воспроизводимости обнаружили, что значения коэффициента вариации находились в диапазоне 0,041-0,158 %, что соответствует общепринятым требованиям (C5<3 %).

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Доронин М. И., Михалишин Д. В., Борисов А. В., Груздев К. Н.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

METHOD FOR MEDIATED DETERMINATION OF THE AMOUNT OF INFECTIOUS DOSES OF RABIES VIRUS IN NON-INACTIVATED RAW MATERIALS FOR VACCINE BY PCR METHOD

Technological control in the manufacture of a live rabies vaccine from the RV-97 strain of the rabies virus requires the determination of the number of infectious doses of the virus. The article describes a method for indirectly determining the number of infectious doses of rabies virus strain RV-97 in raw materials for a live vaccine using the realtime RT-PCR method. This method makes it possible to reduce the analysis time to 4 hours, to increase the purity of the RNA virus of the RV-97 strain by using the solid-phase extraction method using zeolite particles, to increase the sensitivity and specificity due to the use of original specific oligonucleotides, to reduce the cost of the study in comparison with the IFR in cell monolayer. A relationship was revealed between the value of the number of infectious doses of the rabies virus strain RV-97 and the threshold amplification cycle, reflected in the form of an exponential function with a base 10 with a high accuracy of approximation (R2 = 0.9927) and an amplification efficiency of99.99 %. The developed mathematical model AIDRV RV-97 = 10 л < 03012 •Ct +10-2040') allows determining the number of infectious doses of the rabies virus strain RV-97 in raw materials for the production of rabies vaccine. As a result of testing, it was revealed that the data obtained using the developed method correlated with the results of the immunofluorescence reaction in cell culture by 99.5-100 % for 1080-70 TCID00 /ml 70-40 TCID50 /ml 40-30 TCID50 /ml 30-20 TCID50 /ml 2 0-10 TCID50 /ml 1 TCID5(fml, diagnostic sensitivity - 99.76 % function show_eabstract() { $('#eabstract1').hide(); $('#eabstract2').show(); $('#eabstract_expand').hide(); } ▼Показать полностью

Текст научной работы на тему «СПОСОБ ОПОСРЕДОВАННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ИНФЕКЦИОННЫХ ДОЗ ВИРУСА БЕШЕНСТВА В НЕИНАКТИВИРОВАННОМ СЫРЬЕ ДЛЯ ВАКЦИНЫ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ»

DOI 10.24412/2074-5036-2021-3-41-48 УДК 619:578.835.2:615.371.004.12:616-076

Ключевые слова: количество инфекционных доз вируса бешенства, антирабическая вакцина, реакция амплификации, полимеразная цепная реакция.

Keywords: the amount of infectious doses of rabies virus, rabies vaccine, amplification reaction, polymerase chain reaction.

Доронин М. И., Михалишин Д. В., Борисов А. В., Груздев К. Н.

СПОСОБ ОПОСРЕДОВАННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ИНФЕКЦИОННЫХ ДОЗ ВИРУСА БЕШЕНСТВА В НЕИНАКТИВИРОВАННОМ СЫРЬЕ ДЛЯ ВАКЦИНЫ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

METHOD FOR MEDIATED DETERMINATION OF THE AMOUNT OF INFECTIOUS DOSES OF RABIES VIRUS IN NON-INACTIVATED RAW MATERIALS FOR VACCINE

BY PCR METHOD

ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец Federal Centre for Animal Health, Federal Governmental Budgetary Institution Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur 'evets

Доронин М. И., к. б. н., вед. науч. сотрудник. E-mail: doronin@arriah.ru

Doronin M.I., PhD of Biological Science, Leading Researcher. E-mail: doronin@arriah.ru. Михалишин Д. В., к. в. н., зав. лабораторией. E-mail: mihalishindv@arriah.ru Мichalishin D.V., PhD of Veterinary Science, Head of the Laboratory. E-mail: mihalishindv@arriah.ru Борисов А. В., к. в. н., вед. науч. сотрудник. E-mail: borisov_av@arriah.ru Borisov A.V., PhD of Veterinary Science, Leading Researcher. E-mail: borisov_av@arriah.ru Груздев К. Н., д. б. н., профессор, Заслуженный ветеринарный врач РФ, трижды Лауреат Премии

Правительства РФ в области науки и техники. E-mail: gruzdev@arriah.ru Gruzdev K.N., Doctor of Biological Sciences, Professor, Honored Veterinarian of the Russian Federation, three times Laureate of the Prize of the Government of the Russian Federation in the field of science

and technology. E-mail: gruzdev@arriah.ru

Аннотация. Технологический контроль при изготовлении живой антирабической вакцины из штамма РВ-97 вируса бешенства требует определения количества инфекционных доз вируса. В статье представлено описание способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для живой вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ. Данный способ позволяет снизить время проведения анализа до 4 ч, увеличить чистоту РНК вируса бешенства штамма РВ-97 за счет использования метода твердофазной экстракции с применением частиц цеолита, увеличить чувствительность и специфичность за счет применения оригинальных специфических олигонуклеотидов, удешевить исследование по сравнению с методом РИФ в клеточном монослое. Между значением количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 и пороговым циклом амплификации выявлена зависимость, отраженная в виде показательной функции с основанием 10 с высокими достоверностью аппроксимации (R2 = 0,9927) и эффективностью амплификации 99,99 %. Разработанная математическая модель КИДВБ РВ97 = 10л(-°,3°12« +10,2°40) позволяет определять количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для производства антирабической вакцины. В результате тестирования выявлено, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с результатами реакции иммунофлуоресценции в культуре клеток на 99,5-100 % для 108-0-7-0 ККИД50/мл (n=70), на 98-99,5 % для 107-0-4-0 ККИД50/мл (n=70), на 97-98,5% для 104'0-3-0 ККИД50/мл (n=70), на 94-98 % для 103-0-2-0 ККИД50/мл (n=70), на 93-98 % для 102-0-1-0 ККИД50/мл (n=70). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа. Аналитическая чувствительность метода составила 101 ККИД50/мл, диагностическая чувствительность - 99,76 % (n=412), специфичность - 100,00 % (n=412), общая точность - 99,88 % (n=412). При исследовании прецизионности представленного способа в условиях воспроизводимости обнаружили, что значения коэффициента вариации находились в диапазоне 0,041-0,158 %, что соответствует общепринятым требованиям (C5<3 %).

Summary. Technological control in the manufacture of a live rabies vaccine from the RV-97 strain of the rabies virus requires the determination of the number of infectious doses of the virus. The article describes a method for indirectly determining the number of infectious doses of rabies virus strain RV-97 in raw materials for a live vaccine using the realtime RT-PCR method. This method makes it possible to reduce the analysis time to 4 hours, to increase the purity of the

Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 3 (51), 2021 41

RNA virus of the R V-97 strain by using the solid-phase extraction method using zeolite particles, to increase the sensitivity and specificity due to the use of original specific oligonucleotides, to reduce the cost of the study in comparison with the IFR in cell monolayer. A relationship was revealed between the value of the number of infectious doses of the rabies virus strain RV-97 and the threshold amplification cycle, reflected in the form of an exponential function with a base 10 with a high accuracy of approximation (R2 = 0.9927) and an amplification efficiency of99.99 %. The developed mathematical model AIDRV RV-97 = 10 '(- °'3012 •Ct +10-2040> allows determining the number of infectious doses of the rabies virus strain RV-97 in raw materials for the production of rabies vaccine. As a result of testing, it was revealed that the data obtained using the developed method correlated with the results of the immunofluorescence reaction in cell culture by 99.5-100 % for 1080-70 TCID50 /ml (n = 70), at 98-99.5 % for 1070-40 TCID50 /ml (n = 70), by 97-98.5 % for 1040-30 TCID50 /ml (n = 70), by 94-98 % for 1030-20 TCID /ml (n = 70), by 93-98 %for 102 0-10 TCID /ml (n = 70). The results obtained

'50 < S J 50

indicated a high degree of accuracy of the developed method. The analytical sensitivity of the method was 101 TCID50/ml, diagnostic sensitivity - 99.76 % (n = 412), specificity - 100.00 % (n = 412), overall accuracy - 99.88 % (n = 412). In the study of the precision of the presented method under reproducibility conditions, it was found that the values of the coefficient of variation were in the range of 0.041-0.158 %, which corresponds to the generally accepted requirements (Cô <3 %).

Введение

Бешенство - это острый прогрессирующий энцефаломиелит со смертельным исходом, вызываемый нейротропным вирусом. Возбудитель принадлежит порядку Mononegavirales, семейству Rhabdoviridae, включающему в себя рода Lyssavirus, Ephemerovirus, Vesiculovirus. Возбудители бешенства обнаружены на всех континентах, кроме Антарктиды, более чем в 100 странах мира. Многочисленные и разнообразные варианты лиссавирусов встречаются у самых разных видов животных по всему миру. Среди них классический вирус бешенства на сегодняшний день является довольно распространенной инфекцией человека и животных. Десятки миллионов потенциальных контактов с людьми и десятки тысяч смертей от вируса бешенства происходят каждый год. От бешенства ежегодно в мире умирает около 59 000 человек и более 1 млн животных [2, 3, 4].

Геном вируса бешенства представлен негативной молекулой РНК размером около 12000 н.о., который кодируют пять структурных белков: нуклеопротеин (N), фосфопро-теин (P), матричный белок (M), гликопротеин (G) и РНК-направленную РНК-полимеразу (L) (рис. 1А) [2]. Белок N инкапсулирует геном РНК, образуя плотно закрученный комплекс N-РНК, известный как рибонукле-опротеин (РНП) [8]. РНП конденсируется вместе с L- и P-белком в спиральный нукле-окапсид. Белок P является некаталитическим кофактором для полимеразы. Белок M окружает нуклеокапсид, соединяя его с вирусной оболочкой [2]. G-белок взаимодействует

с матриксным белком, является белком, экспонированным на поверхности оболочки вируса бешенства, и единственным лигандом для клеточных рецепторов [7, 11].

Стратегия транскрипции и репликации вируса бешенства отражена на рисунке 1Б, из которого видно, что геномная РНК (-) является матрицей. Во время транскрипции пять матричных РНК (мРНК) с кэпирован-ным 5'-концом (С) и З'-полиаденилирован-ным концом кодируют вирусные Р-, М-, G-, L-белки. Во время репликации негативная РНК транскрибируется в позитивную РНК, а затем снова транскрибируется в РНК (-) для завершения репликации [9].

Бешенство вызывает серьезные потери, которые связаны с гибелью людей и животных, ликвидацией последствий вспышек заболевания, проведением профилактических и карантинных мероприятий, регулированием численности диких плотоядных животных, отловом бродячих кошек и собак и осуществлением лабораторных исследований по постановке диагноза. Комплекс мер, направленных на борьбу с бешенством и его профилактику, включает в себя применение оральных вакцин для диких плотоядных, в том числе лисиц, которые являются важным резервуарным хозяином вируса бешенства в России и Европе [2, 4, 8], а также использование инактивированных сорбированных и эмульсионных вакцин для домашних и сельскохозяйственных животных.

При изготовлении антирабических вакцин вируссодержащую суспензию исследуют на определение количества инфекционных доз (КИД) вируса бешенства для оценки

42

гликопротеин

матриксный белок

А

^ Ц » ё тип

I

С1 N [АААДААДД

С| Р 1АААААААА

сЩаааааааа

>5"

О

нуклеопротеин

фосфопротеин О полнмераза ()

РНК(-)

| N Г~3 1Г~ОТ"1 5 ~Н~

„I уг-н-пгагк II 5 г РНК (-)

>5' >3-

>5-

Рис. 1. Характеристика вируса бешенства (А - Структура вириона, Б - Стратегия транскрипции и репликации вируса бешенства).

его активности в клетках [5, 12]. В 1,0 см3 суспензии вируса определяют количество клеточных культуральных инфекционных доз, вызывающих 50 %-ное поражение клеток (ККИД50/мл), что фактически отражает концентрацию вирионов, содержащих РНК вируса бешенства. В классическом варианте для этих целей используют монослойную клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21, с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50 % клеток в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) [2]. У данного метода есть некоторые недостатки: длительная процедура анализа, связанная с репродукцией вируса в клетках (не менее 3 суток); определенная степень субъективности при оценке результатов исследования; высокая стоимость клеточной линии как тест-системы и затраты на ее поддержание; высокая вероятность риска контаминации культуры клеток [8, 10].

Исходя из этого целесообразно разработать способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства в сырье для антирабической вакцины на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [10]. Данный метод является высокочувствительным, специфичным и позволяет проводить исследование в течение 4 часов, не требует использования клеточных линий для анализа, снижает риск контаминации исследуемых образцов.

В настоящее время представленный метод широко применяют для диагностики раз-

личных инфекционных заболеваний, в том числе бешенства, а также для опосредованного количественного определения вирусной нагрузки суспензий вируса ящура [2, 8, 10]. Однако, для определения количества инфекционных доз вируса бешенства в сырье для вакцин ранее данный метод не применялся.

Цель исследования заключалась в разработке и апробировании способа опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства в неинактивированном сырье для вакцины с применением ПЦР-РВ.

Материалы и методы

Вирус. Для исследований использовали неинактивированные суспензии вируса бешенства штамма РВ-97, применяемого для изготовления антирабических вакцин.

Выделение нуклеиновой кислоты. Элю-ирование нуклеиновой кислоты проводили методом твердофазной экстракции с применением частиц цеолита с диаметром 350 мкм и хаотропной смеси, состоящей из 3М

Рис. 2. Спектры поглощения экстрактов РНК вируса бешенства штамма РВ-97 стандартных образцов (п=3).

43

Рис. 3. Зависимость величины порогового цикла амплификации и количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 (п=4, отмечены точки, отображающие средние значения пороговых циклов амплификации кДНК)

раствора мочевины и ЗМ раствора гуани-динизотиоцианата (1:1 по объему). Отмывание цеолитовых частиц осуществляли с применением 80 % раствора изопропанола. Для элюирования РНК используют буфер ТЕ (10 мМ трис(оксиметил)аминометан, 1 мМ этилендиамин-тетраацетат, рН 7,3).

Спектральный анализ проводили, определяя поглощение экстрактом РНК монохроматического ультрафиолетового света, что позволяет оценить степень чистоты экстракта, который в последующем тестируют в реакции амплификации. Измерения спектральной поглощающей способности образцов проводят при длинах волны в диапазоне 205-325 нм и температуре 22-25 °С.

Проведение обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ). Для постановки реакции использовали компоненты, которые представлены в таблице 1. Применяли следующие олигонуклеотидные прай-меры и зонд: upstream-5'-NF-RV-97-quant-, downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймер и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонд. Их дизайн представлен в таблице 2. Для проведения реакции использовали дезоксирибонукле-озидтрифосфаты (по 0,2 мМ), хлорид магния (2 мМ), Taq-буферный раствор Colorless Flexi (5х), ферменты AMV-ревертазу (10 е.а.) и ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (10 е.а.).

Обратную транскрипцию проводят при температуре 42 °С в течение 15 мин. Перед проведением ПЦР-РВ осуществляют предварительный прогрев смеси при температуре 95 °С в течение 5 мин. для активации фермента Taq-ДНК-полимеразы и инактивации AMV-ревертазы. ПЦР-РВ включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг праймеров и зонда, элонгацию. Денатурацию проводят при температуре 95 °С в течение 10 с, отжиг олигонуклеотидов - при температуре 56 °С в течение 30 с, элонгацию - при температуре 68 °С в течение 30 с.

Статистическая обработка результатов проводилась при определении средних арифметических значений и достоверности статистической разницы между средними

Таблица 1

Состав реакционной смеси для определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 методом ОТ-ПЦР-РВ

Наименование компонента смеси Концентрация компонента

Upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймер (50 пМ) 5 пМ

Downstream-5'-NR-RV-97-quant -праймер (50 пМ) 5 пМ

5'-NP-RV-97-quant -Су5/ВНд3-зонд (50 пМ) 5 пМ

Дезоксирибоаденозинтрифосфат (dATP, 25 мМ) по 0,20 мМ каждого

Дезоксирибогуанозинтрифосфат (dGTP, 25 мМ)

Дезоксирибоцитидинтрифосфат (dCTP, 25 мМ)

Дезоксириботимидинтрифосфат (dTTP, 25 мМ)

Хлорид магния (25 мМ) 2 мМ

Taq-буферный раствор Colorless Flexi (х 5) 20 % от объема реакционной смеси

AMV-ревертаза 10 е.а.

ДНК-зависимая ДНК-полимераза 10 е.а.

Примечание: объем вносимого элюата РНК - 5 мкл, объем реакционной смеси - 25 мкл. 44 Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 3 (51), 2021

величинами, определенными по разностному методу Стьюдента-Фишера. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости р<0,005. Валидационные характеристики методики, в том числе достоверность, аналитическую чувствительность, диагностическую чувствительность и специфичность, общую точность, коэффициент осцилляции, коэффициент вариации и др. определяли в соответствии с международными рекомендациями [1, 13].

Результаты исследований и обсуждение

На первом этапе исследования проводили разработку способа опосредованного определения КИД вируса бешенства в сырье для вакцин с применением метода ПЦР-РВ. Для этого подготавливают контрольную панель стандартов вируса бешенства штамма РВ-97, в качестве которых используют суспензии вируса бешенства указанного штамма с КИД: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ККИД50/см3. В качестве отрицательных контролей применяют суспензию клеток ВНК-21, не зараженную вирусом бешенства. Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей выделяли нуклеиновую кислоту. Для этого применяли частицы цеолита с диаметром 350 нм. Учитывая, что размер вирионов составляет 100-300 х 45-100 нм, частицы цеолита диаметром 350 нм подходят для сорбирования вируса бешенства. Для лизиса белковых клеточных структур и вирусных частиц, а также ингибирова-ния РНКаз и ДНКаз используют хаотропную смесь, а именно 3М мочевину и 3М гуаниди-низотиоцианат в соотношении 1:1. Данный комплекс денатурирует белковые молекулы и нуклеиновые кислоты. Хаотропные компоненты в растворенном состоянии увеличивают энтропию системы путем нарушения межмолекулярных взаимодействий, а именно, водородных связей, ван-дер-ваальсовых сил и гидрофобных эффектов. Структура и функции макромолекул определяются влиянием данных сил, поэтому увеличение концентрации хаотропных растворенных веществ в биологической системе приводит к денатурации белков и нуклеиновых кислот. Кроме того, используемые хаотропные аген-

ты уменьшают гидрофобные взаимодействия между молекулами и, тем самым, влияют на липидный слой клеток и вириона вируса бешенства, что приводит к лизису [10].

На следующем этапе исследования с помощью спектрального анализа в излучении ультрафиолетового света проводили оценку степени чистоты полученных элюатов нуклеиновой кислоты. Значения экстинк-ции образцов в диапазоне от 205 до 325 нм осуществляли через каждые 2 нм, производя запись спектра поглощения РНК с помощью компьютерной программы Spectrum v. 5.0 (рисунок 2). Из рисунка 2 следует, что значения OD205-259 и OD261-325 не превышали OD260, что является признаком высокой степени чистоты полученных элюатов РНК (n=3). Отмечали отсутствие выраженных пиков на графиках при длинах волны 205, 235, 270, 280 и 320 нм, что свидетельствовало о практически полном отсутствии загрязнения экстрактов РНК примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков ГТЦ, полипептидов и крупных конгломератов, соответственно. Значения коэффициентов экстинкции (R1) для стандартов приближены к норме 2,000 (R1 = 1,994-2,000), что подтверждало отсутствие ДНК и наличие лишь следовых количеств примесей белка. Деградации нуклеиновой кислоты и наличия свободных ну-клеотидов в элюатах не наблюдалось, так как R1 не превышал 2,000. Экстракты вирусной РНК не загрязнены полисахаридами и ГТЦ, поскольку значения коэффициента экстинк-ции (R2) приближены к норме 2,000 и соответствовали 1,998-2,000. Учитывая, что при замещении 1 % РНК на углеводы значение R2 уменьшается на 0,002, в полученных экстрактах наличие полисахаридных примесей составило не более 1 %, что допустимо [10].

Полученные экстракты РНК вируса бешенства штамма РВ-97, выделенные из контрольных образцов с разным количеством инфекционных доз, исследовали в ОТ-ПЦР-РВ, как описано в разделе «Материалы и методы». Постановку реакции проводили в 4 по-вторностях. В качестве гомологичных участку N-гена вируса бешенства штамма РВ-97 для проведения реакции амплификации применяли следующие праймеры: upstream-

Таблица 2

Дизайн оригинальных олигонуклеотидов для реакции амплификации нуклеиновой кислоты вируса бешенства для определения количества инфекционных доз

Наименование олигонуклеотидов Последовательность олигонуклеотидов (5'...3') Локализация, н.о. Расчетная длина ампликона, п.н.

upstream-5'-NF-RV-97-quant-праймер ОАСАГСТТТТТСТССШОА 701.719 604

downstream-5'-NR-RV-97-quant-праймер ТСАТСАГСАТТШАОСАТАААС 1283.1304

5'-№^-97^ШП1-СУ5/ BHQ3-зонд Су5- ОТТТАСТвООТТТОТАААОСА -BHQ3 793.813

quant и 5'-NP-RV-97-quant-Cy5/BHQ3-зонд, нуклеотидные последовательности которых отражены в Таблице 2. Их дизайн подбирали в соответствии с общепринятыми требованиями [10, 13]. Размеры прямого, обратного праймера и зонда составляют 19, 21 и 22 н.о., что соответствует требованиям [10, 13]. Нуклеотидная последовательность зонда не комплементарна праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в составе праймеров и зонда. Флуорофор Су5 присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции BHQ3 - к З'-концу. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному зонду, которые участвуют в реакции [10, 13]. В качестве флуоресцентного красителя был выбран Су5 с длиной волны максимальной флуоресценции 670 нм. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции BHQ3 с длиной волны максимального поглощения при 672 нм и возможном диапазоне гашения 620-730 нм. Иными словами, была выбрана подходящая пара «флуорофор-гаситель». Размер ампли-кона составляет 604 п.н.

Выявлено, что для олигонуклеотидов не характерно образование «шпилек», а также не обнаружено 3'-комплементарно сти и сайтов, отжигающих сами на себя при условии, когда минимальное количество пар оснований, необходимое для димеризации праймера и шпильки - 4.

Была определена температура отжига праймеров и зонда по кривым плавления гетеродимера олигонуклеотида и матрицы

с помощью модели фолдинга. Данные температуры для ир8й-еат-5'-ОТ^^97^иаП;, downstream-5'-NR-RV-97-quant и 5'-№-RV-97-quant-Cy5/BHQ3 составляют 55, 56, 56 °С, соответственно. Для проведения реакции амплификации было решено проводить гибридизацию праймеров и зонда с участком №гена вируса бешенства штамма РВ-97 при температуре 56 °С.

Последовательности оригинальных оли-гонуклеотидов исследовали на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием GenBank данных последовательности кДНК вируса бешенства [6]. Подобранные нуклеотидные последовательности проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью компьютерной программы МЮШ, в результате этого выявили, что для разработанных олигону-клеотидов наличия внутренних вторичных структур не определено.

Результаты ОТ-ПЦР-РВ анализировали, сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации (С), полученных с помощью пересечения пороговой линии и экспоненциальной кривой функции Fl = Г (С). Устанавливали зависимость между пороговым циклом амплификации и количеством инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 (КИДВБ РВ-97) в сырье для анти-рабической вакцины. Полученные данные отражены на рисунке 3 и выражены в виде показательной функции с основанием 10: КИДВБ РВ-97 = 10Л(-0>3012'а +10'2040). Оценивали величину эффективности реакции ампли-

46

фикации (Е) по формуле: Е=(10-1/к-1) (к брали из функции С = 10Л(-кКИДвб рв-97+Ь)), а также достоверность аппроксимации ^2). Эффективность реакции амплификации составила 99,99 %, достоверность аппроксимации -0,9927, что соответствовало общепринятым требованиям, предъявляемым к молекуляр-но-биологическим тест-системам [10].

На следующем этапе работы проводили исследование валидационных показателей разработанного способа. Для анализа использовали 350 суспензий культурального вируса бешенства производственного штамма РВ-97 с количеством инфекционных доз от 10100 до 10800 ККИД50/см3. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса бешенства штамма РВ-97 с титром вируса 107 00 ККИД50/см3. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток ВНК-21, не зараженную вирусом бешенства. Исследуемые пробы и контрольные образцы анализировали в трех повторностях в ОТ-ПЦР-РВ и классическим методом титрования в моно-слойной клеточной линии ВНК-21 с применением специфического иммуноглобулина G, меченого флуоресцеинизотиоцианатом. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом РИФ в культуре клеток на 99,5-100 % для 108'0-7'0 ККИД50/см3 (п=70), на 98-99,5 % для 107>0-4>0 ККИД50/см3 (п=70), на 97-98,5 % для 104>0-3>0 ККИД50/см3 (п=70), на 94-98 % для 103>0-2>0 ККИД50/см3 (п=70), на 93-98 % для 102>0-1>0 ККИД^/см3 (п=70). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа.

Аналитическую чувствительность метода ОТ-ПЦР-РВ для опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства в сырье для вакцин проводили, используя положительные стандарты вируса бешенства со следующими КИД вируса бешенства: 100, 1005, 101, 1015, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ККИД50/мл. Испытуемые контрольные образцы исследовали в 5 повторностях разработанным способом. Все этапы работы осуществляли, как описано выше. Выявлено, что аналитиче-

ская чувствительность метода составила 101 ККИД50/мл.

Для определения чувствительности метода тестировали 412 образцов суспензий, которые являлись заведомо положительными по данным исследования методом РИФ в клеточной линии ВНК-21. Постановку теста проводили, как отражено выше. В результате анализа с помощью разработанного способа определили, что количество достоверно положительных - 411, а ложноотрицательных -1. Таким образом, чувствительность метода составила 99,76 %.

Специфичность метода определяли при исследовании 412 образцов суспензий, которые являлись отрицательными по данным исследования в РИФ. По итогам анализа с помощью разработанного способа определили, что количество достоверно отрицательных - 412. Таким образом, специфичность разработанного теста составила 100,00 %. Учитывая полученные данные, рассчитали общую точность метода, которая соответствовала 99,88 %.

Параметры прецизионности метода опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства в условиях воспроизводимости исследовали при тестировании суспензий вируса бешенства двумя операторами в разное время в 20 повторностях. Для генеральной совокупности значений С( размах вариации составил 0,07-0,54, среднее линейное отклонение находилось в диапазоне 0,006-0,055 (менее 0,5), иными словами, степень колеблемости в выборках относительно среднего уровня признака низкая. Дисперсия составила 0,001-0,008, среднее квадратичное отклонение - 0,009-0,078, что подтверждает незначительную степень отклонений индивидуальных значений С( от среднего арифметического и высокий уровень достоверности данных внутри каждой выборки. Значения коэффициента осцилляции находились в диапазоне от 0,324 до 1,544 %, линейный коэффициент вариации составлял 0,039-0,155 %, коэффициент вариации - 0,041-0,158 %, что соответствует общепринятым требованиям (С5<3 %) [1, 13]. Иными словами, по показателям вариации

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

47

представленный способ удовлетворял критериям приемлемости.

Заключение

Разработан способ опосредованного определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ, который дает возможность снизить время проведения анализа до 4 ч; увеличить чистоту РНК вируса бешенства штамма РВ-97 за счет использования метода твердофазной экстракции с применением частиц цеолита; увеличить чувствительность и специфичность за счет применения оригинальных специфических олигонуклеотидов; удешевить исследование по сравнению с методом РИФ в клеточном монослое.

Выявлено, что между количеством инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 и пороговым циклом амплификации установлена зависимость, отраженная в виде показательной функции с основанием 10 с высокими достоверностью аппроксимации = 0,9927) и эффективностью амплификации 99,99 %. Разработанная математическая модель КИДВБ РВ-97 = 10Л(-°'3012'а +10'2040) позволяет определять количество инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97 в сырье для производства антирабической вакцины.

Обнаружено, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом РИФ в культуре клеток на 99,5-100 % для Ю80-70 ККИД50/см3 (п=70), на 98-99,5 % для 107'0-4'0 ККИД50/см3 (п=70), на 97-98,5 % для 104'0-3'0 ККИД5%м3 (п=70), на 94-98 % для 103'0-2'0 ККИД50/см3 (п=70), на 93-98 % для 102'0-1'0 ККИД50/см3 (п=70). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа.

Определено, что аналитическая чувствительность метода составила 101 ККИД50/мл, диагностическая чувствительность - 99,76 % (п=412), специфичность - 100,00 % (п=412), общая точность - 99,88 % (п=412).

Проведено исследование прецизионности представленного способа в условиях воспроизводимости. Значения коэффици-

ента осцилляции находились в диапазоне от 0,324 до 1,544 %, линейный коэффициент вариации составлял 0,039-0,155 %, коэффициент вариации - 0,041-0,158 %, что соответствует общепринятым требованиям (CS<3 %) Подтверждена высокая степень прецизионности в условиях воспроизводимости для разработанного способа, что позволяет его применять для определения количества инфекционных доз вируса бешенства штамма РВ-97.

Список литературы

1. Васильева, Л. А. Статистические методы в биологии, медицине и сельском хозяйстве: учеб. пособие / Л. А. Васильева. Новосибирск.: Институт цитологии и генетики СО РАН, 2007. 124 с.

2. Груздев К. Н. Бешенство животных. / К. Н. Груздев, А. Е. Метлин. Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2019. 394 с.

3. Echevarría J. E. Current Rabies Vaccines Do Not Confer Protective Immunity against Divergent Lyssaviruses Circulating in Europe / J. E. Echevarría, A. C. Banyard, L. M. McElhinney, A. R. Fooks // Viruses. 2019. V. 11(10):E892. 10.3390/v11100892.

4. European Food Safety Authority and European Centre for Disease Prevention and Control // The European Union One Health 2018 Zoonoses Report. EFSA Journal. 2019. V. 17(12):5926, 276 pp. http://dx.doi.org/10.2903/ j.efsa.2019.5926.

5. Gautret P. Rabies vaccination for international travelers/ P. Gautret, P. Parola // Vaccine. 2012. 30(2):126-33. 10.1016/j.vaccine.2011.11.007.

6. GenBank. [Электронный ресурс] / URL: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 18.02.2021).

7. Levin S. N. Infections of the nervous system / S. N. Levin, J. L. Lyons //Am J. Med. 2018. V. 131. P. 25-32.

9. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2019 (OIE). Rabies. 2019. Ch. 3.1.17. P. 578-612.

10. Okumura A., Harty R.N. Rabies virus assembly and budding Adv / А. Okumura, R. N. Harty // Virus Res. -2011. - V. 79. - P. 23—32.

12. PCR. Methods and Protocols / ed. L. Dominques. 2017. 283 p. DOI 10.1007/978-1-4939-7060-5.

13. Schnell M. J. The cell biology of rabies virus: using stealth to reach the brain. / M. J. Schnell, J. P. McGettigan, C. Wirblich , A. Papaneri // Nat Rev Microbiol. 2010. V. 8. P. 51-61.

14. Taylor E. Avoiding preventable deaths: The scourge of counterfeit rabies vaccines / E. Taylor, A. C. Banyard, H. Bourhy, F. Cliquet, H. Ertl, C. FehlnerGardiner, et al. // Vaccine. 2019. V. 37(17). P, 2285-2287. 10.1016/j.vaccine.2019.03.037.

15. Vallat B. OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. / Vallat B. 2nd ed. Paris, France, 2008. 67 p.

48

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.