CC BY
43
УДК 615.371:601.4:577.2.08
https://doi.org/10.30895/2221-996X-2020-20-2-107-115
ШИФР СПЕЦИАЛЬНОСТЬ
03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
03.01.07 Молекулярная генетика
H
Молекулярно-генетическое исследование стабильности и подтверждение подлинности штамма Внуково-32, применяемого для производства вакцины антирабической культуральной концентрированной очищенной инактивированной сухой
Г. М. Игнатьев1*, А. С. Оксанич2, Л. П. Антонова1, Т. Г Самарцева2, С. В. Мосолова1, К. М. Мефед1, Л. В. Гмыль1, Н. А. Нетесова3
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр исследования и разработки иммунобиологических препаратов им. М. П. Чумакова РАН», пос. Института полиомиелита, домовладение 8, корп. 1, поселение Московский, Москва, 108819, Российская Федерация
2Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова», Малый Казенный переулок, д. 5а, Москва, 105064, Российская Федерация
3Федеральное бюджетное учреждение науки
«Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека,
р.п. Кольцово, Новосибирская область, 630559, Российская Федерация
Бешенство — острая вирусная инфекция, вызываемая вирусом семейства Rhabdoviridae рода Lyssavirus и характеризующаяся симптомами поражения центральной нервной системы и абсолютной летальностью. Единственной возможностью предотвратить возникновение данного заболевания у людей является вакцинопрофилактика. Одним из препаратов, используемых в этих целях, является вакцина антира-бическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая, выпускаемая ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН». Цель работы: исследование структуры производственного, рабочего посевного вируса бешенства штамма Внуково-32, используемого ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН» для производства антирабической вакцины, его генетической стабильности на этапах производства, изучение возможности применения молекулярно-генетических методов для подтверждения подлинности производственного штамма в готовой форме вакцины и изучение нуклеотидной последовательности штамма CVS. Материалы и методы: производственный штамм вируса бешенства Внуко-во-32, рабочие посевные вирусы, готовые серии вакцины антирабической, штамм CVS фиксированного вируса бешенства, используемый для оценки специфического иммунитета. Молекулярно-генетическое исследование проведено с использованием ОТ-ПЦР с последующей рестрикцией и секвенированием. Результаты: представлены результаты анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена G, полученного из производственного штамма Внуково-32, серий рабочего посевного вируса и готовых серий вакцины антирабической, изготовленных в 2012, 2018, 2019 г., штамма фиксированного вируса бешенства CVS, используемого для оценки специфической активности вакцины. Показана возможность применения рестрикционного анализа для подтверждения подлинности штамма Внуково-32 на всех этапах производства, включая готовую форму вакцины. Заключение: штаммы Внуково-32 и CVS, используемые в ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН», являются вирусами бешенства. Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента гена G показал, что штамм Внуково-32 стабилен на разных этапах производства. Полученная нуклеотидная последовательность гена G штамма Внуково-32 депонирована в GenBank (номер MN116503). Показана возможность применения рестрикционного анализа для подтверждения подлинности штамма Внуково-32 вируса бешенства на всех этапах производства, включая готовую форму вакцины.
Ключевые слова: бешенство; ген G; генетическая стабильность; штамм Внуково-32; антирабическая вакцина
Для цитирования: Игнатьев ГМ, Оксанич АС, Антонова ЛП, Самарцева ТГ, Мосолова СВ, Мефед КМ, Гмыль ЛВ, Нетесова НА. Молекулярно-генетическое исследование стабильности и подтверждение подлинности штамма Внуково-32, применяемого для производства вакцины антирабической культуральной концентрированной очищенной инактивированной сухой. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020;20(2):107-115. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2020-20-2-107-115
*Контактное лицо: Игнатьев Георгий Михайлович; marburgman@mail.ru
Molecular Genetic Testing of Stability and Identification of Vnukovo-32 Strain Used for Production of the Cultural Concentrated Purified Inactivated Dry Rabies Vaccine
G. M. Ignatyev1', A. S. Oksanich2, L. P. Antonova1, T. G. Samartseva2, S. V. Mosolova1, K. M. Mefed1, L. V. Gmyl1, N. A. Netesova3
1Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences,
8/1 Township of the Poliomyelitis Institute, Moskovsky cluster, Moscow 108819, Russian Federation
2Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, 5a Maly Kazenny Lane, Moscow 105064, Russian Federation
3State Research Centre of Virology and Biotechnology "Vector', Koltsovo, Novosibirsk Oblast 630559, Russian Federation
Rabies is an acute viral disease caused by a virus of the Rhabdoviridae family of the Lyssavirus genus, which affects the central nervous system and is characterised by absolute mortality. Vaccination is the only way to prevent the disease in humans. One of the products used for vaccination is a cultural concentrated purified inactivated dry rabies vaccine produced by the Federal State Budgetary Institution of Science "Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences" (hereinafter—Chumakov Center). The aim of the study was to examine the structure of the working virus seed of Vnukovo-32 strain used by the Chumakov Center for rabies vaccine production, to assess its genetic stability during production, to explore the possibility of using molecular genetic methods for identification of the production strain in the finished dosage form, and to study the nucleotide sequence of the CVS strain. Materials and methods: Vnukovo-32 rabies virus production strain, working virus seeds, finished batches of the rabies vaccine, CVS fixed rabies virus strain used in the assessment of specific immunity. The molecular genetic study was performed using RT-PCR followed by restriction and sequencing. Results: the paper presents the results of nucleotide sequence analysis of the G gene fragment obtained from the Vnukovo-32 production strain, batches of the working virus seed, and finished batches of the rabies vaccine produced in 2012, 2018, and 2019, and the CVS fixed rabies virus strain used in the assessment of the vaccine's specific immunity. The study demonstrated that restriction analysis could be used for Vnukovo-32 strain identification at all production stages, including the finished dosage form. Conclusion: Vnukovo-32 and CVS strains used by the Chumakov Center are rabies viruses. Analysis of the nucleotide sequence of the G gene fragment showed that the Vnukovo-32 strain remains stable throughout different production stages. The obtained nucleotide sequence of gene G of the Vnukovo-32 strain was deposited in GenBank (accession number MN116503). The study demonstrated that restriction analysis could be used for Vnukovo-32 strain identification at all production stages, including the finished dosage form. Key words: rabies; gene G; genetic stability; Vnukovo-32 strain; rabies vaccine
For citation: Ignatyev GM, Oksanich AS, Antonova LP, Samartseva TG, Mosolova SV, Mefed KM, Gmyl LV, Netesova NA. Molecular genetic testing of stability and identification of Vnukovo-32 strain used for production of the cultural concentrated purified inactivated dry rabies vaccine. BlOpreparaty. Profilaktika, diagnostika, leche-nie = BlOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2020;20(2):107-115. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2020-20-2-107-115
Corresponding author: Georgy M. Ignatyev; marburgman@mail.ru
Несмотря на повсеместное внедрение вакцин против бешенства в практику здравоохранения, во всем мире по-прежнему от вируса погибает около 55 тыс. человек в год. Основная смертность приходится на страны Африки и Азии, где чаще всего умирают дети до 15 лет [1]. Причина такой ситуации в этих регионах кроется в отсутствии вакцинации от бешенства бродячих собак, которые являются основным переносчиком вируса. В то же время в этих странах имеется дефицит препаратов, которые применяются для экстренной профилактики и лечения после укусов животных — таких как антирабический иммуноглобулин и вакцины, а также в доступности медицинской помощи в отдаленных от городов населенных пунктах.
В настоящее время проблеме профилактики и лечения бешенства ВОЗ уделяет огромное внимание. Усилия ученых направлены на разработку более эффективных вакцин, вызывающих стойкий и длительный иммунитет уже после первого введения, и на снижение стоимости таких препаратов. Разрабатывается ряд новых видов вакцин от бешенства с адъювантами второго поколения, такими как агонист толл-подобного рецептора-3 ^^-3), состоящий из синтетической дцРНК, кодирующей а^-3, и полиинозин-полицитидиловой
кислоты, стабилизированной канамицином и кальцием [2]. Рекомбинантные вакцины, состоящие из рекомбинантного гликопротеина вируса бешенства, получаемого в эукариотиче-ских системах экспрессии белка, разрабатываются в Индии [3]. Применяют также генетическую модификацию вируса бешенства для создания живых аттенуированных вакцин, используя удаление генов, кодирующих фосфопротеин [4] или матрикс-ный белок [5], что приводит к отсутствию инфекции даже у им-мунокомпрометированных мышей. Другой пример генетически модифицированного вируса — это введение в геном вируса второй нуклеотидной последовательности, кодирующей гли-копротеин. Такой вирус имел более высокую патогенность по сравнению с диким вирусом, но после инактивации вызывал у мышей и собак более сильный и быстрый иммунный ответ после однократного введения, чем та же доза инактивирован-ного дикого исходного вируса [6]. Среди вакцин для профилактики бешенства у человека и животных можно выделить генетические (ДНК или РНК) вакцины, которые применяются как в чистом виде, так и в форме вирусных или бактериальных векторов [3]. Особое внимание в проводимых работах уделяется генетической стабильности применяемых вакцинных штаммов
Таблица 1. Виды вируса бешенства, включенные в род Lyssavirus, их первичные хозяева, распространение и соответствие филогруппам [8-10]
Table 1. Types of rabies viruses covered by the Lyssavirus genus, their primary hosts, habitats, and philogroups [8-10]
Принятые и предполагаемые виды Established and assumed species Выявленный первичный хозяин Confirmed primary host Регион распространения Habitat Филогруппа Philogroup
Rabies virus (RABV) Хищники и летучие мыши Predators and bats Везде, кроме Австралии и некоторых островов; летучие мыши — только в Америке Everywhere except Australia and some islands; bats—only in America
Duvenhage virus (DUVV) Насекомоядные летучие мыши (Eptesicus serotinus) Insectivorous bats (Eptesicus serotinus) Африка (суб-Сахара) Africa (sub-Saharan)
European bat lyssavirus, type 1 (EBLV-1) Насекомоядные летучие мыши (Eptesicus serotinus) Insectivorous bats (Eptesicus serotinus) Большая часть Европы (от Испании до Украины) Most of Europe (from Spain to Ukraine)
European bat lyssavirus, type 2 (EBLV-2) Насекомоядные летучие мыши (Myotis daubentonii, M. dasycneme) Insectivorous bats (Myotis daubentonii, M. dasycneme) Северо-Западная Европа Northwest Europe I
Australian bat lyssavirus (ABLV) Летучие мыши (Pteropus spp., Saccolaimus albiventris) Bats (Pteropus spp., Saccolaimus albiventris) Австралия Australia
Irkut virus (IRKV) Насекомоядные летучие мыши (Murina leucogaster) Insectivorous bats (Murina leucogaster) Восточная Азия Eastern Asia
Khujand virus (KHUV) Насекомоядные летучие мыши (Myotis mystacinus) Insectivorous bats (Myotis mystacinus) Центральная Азия Central Asia
Aravan virus (ARAV) Насекомоядные летучие мыши (Myotis blythi) Insectivorous bats (Myotis blythi) Центральная Азия Central Asia
Bokeloh bat lyssavirus (BBLV) Насекомоядные летучие мыши (Myotis nattereri) Insectivorous bats (Myotis nattereri) Франция, Германия France, Germany
Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV) Индийские летучие лисы (Pteropus medius) Indian flying foxes (Pteropus medius) Шри-Ланка Sri Lanka
Lagos bat virus (LBV) Летучие мыши (Pteropus spp., Saccolaimus albiventris) Bats (Pteropus spp., Saccolaimus albiventris) Африка (суб-Сахара) Africa (sub-Saharan)
Mokola virus (MOKV) Неизвестен Unknown Африка (суб-Сахара) Africa (sub-Saharan) II
Shimoni bat virus (SHIBV) Насекомоядные летучие мыши (Hipposideros commersoni) Insectivorous bats (Hipposideros commersoni) Кения Kenya
West Caucasian bat virus (WCBV) Насекомоядные летучие мыши (Miniopterus spp.) Insectivorous bats (Miniopterus spp.) Юго-Восточная Европа South-Eastern Europe Не определена Not deter-
Ikoma lyssavirus (IKOV) Неизвестен Unknown Танзания Tanzania
Lleida bat lyssavirus (LLEBV) Обыкновенный длиннокрыл (Miniopterus schreibersii) Bent-winged bat (Miniopterus schreibersii) Испания, Франция Spain, France mined
Не имеет
Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) Ночница Брандта (Myotis brandtii) Brandt's bat (Myotis brandtii) Финляндия Finland таксономического статуса No taxonomic status
Не имеет
Taiwan bat lyssavirus (TWBLV) Восточный нетопырь (Pipistrellus abramus) Japanese house bat (Pipistrellus abramus) Тайвань Taiwan таксономического статуса No taxonomic status
вируса (генетических конструкций) в процессе их размножения (репликации) и длительного культивирования.
Вирус бешенства относится к роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae. Геном вируса представляет собой несегменти-рованную одноцепочечную РНК отрицательной полярности длиной около 12 тыс. нуклеотидов, кодирующую пять белков: нуклеопротеин (N), фосфопротеин (P), матриксный белок (M), гликопротеин (G) и РНК-зависимую РНК-полимеразу (L) [3].
Род Lyssavirus содержит 16 видов вируса бешенства, 13 из которых распределены по 2 филогруппам (табл. 1). Кроме того, выделены два изолята вируса бешенства, которые на момент подготовки статьи не имеют таксономического статуса — Taiwan bat lyssavirus (TWBLV) [7] и Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) [8]. Первый обнаружен у двух восточных нетопырей (Pipistrellus abramus) в Тайване, второй — у ночницы Брандта (Myotis brandtii) в Финляндии. Все вирусы бешенства исходно были обнаружены у летучих мышей за исключением Mokola lyssavirus (MOKV) и Ikoma lyssavirus (IKOV), первичные хозяева которых пока не выявлены.
Подавляющее большинство случаев заболевания бешенством как человека, так и животных вызывается вирусами, относящимися к виду Rabies virus (RABV). Вирусы остальных видов либо обнаруживались лишь эпизодически у больных людей и наземных животных, либо найдены только у летучих мышей. Штаммы вирусов — SAD-Bern, SAD-B19, ERA, SAG, SAG2, Flury, Pitman Moore, — используемые для производства вакцин, также относятся к виду Rabies virus (RABV) [11].
Как и для других РНК-вирусов, геному вируса бешенства свойственна высокая эволюционная изменчивость. Это связано с тем, что вирусная РНК-полимераза не обладает корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью, что приводит к повышенному уровню возникновения нуклеотидных замен при репликации вирусного генома. Небольшие различия в ну-клеотидных последовательностях отдельных представителей одного штамма могут быть обнаружены как для вирусов, выделенных из одного зараженного организма, так и выделенных из одного образца вакцины [11]. Частота возникновения спонтанных однонуклеотидных замен в случае вируса бешенства особенно высока в последовательности гена G (21,9х10-4 мутаций на основание). Для сравнения, в последовательности гена N эта частота значительно ниже — (2,9-3,7)х10-4 Вероятно, повышенный уровень изменчивости гена G, кодирующего основной антиген, важен для вируса бешенства, помогая ему быстрее адаптироваться к различным хозяевам [12]. Таким образом, последовательность гена белка гликопротеина является высоковариабельной и может использоваться для контроля генетической стабильности. Кроме этого, белок гликопротеи-на содержит иммуногенные эпитопы, которые обеспечивают формирование иммунитета [13]. Нуклеотидная структура данных эпитопов известна [14], поэтому контроль генетической стабильности одновременно позволяет контролировать стабильность (сохранность, наличие) иммуногенных эпитопов.
Цель работы — исследование структуры производственного, рабочего посевного вируса бешенства штамма Внуко-во-32, используемого ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН» для производства антирабической вакцины, его генети-
ческой стабильности на этапах производства, изучение возможности применения молекулярно-генетических методов для подтверждения подлинности производственного штамма в готовой форме вакцины и изучение нуклеотидной последовательности штамма CVS.
Материалы и методы
В исследовании были использованы производственный штамм Внуково-32, рабочие посевные вирусы № 26 и 28 (с разным количеством пассажей) и готовые серии вакцины антирабической 521, 962, 018 (серии были приготовлены в 2012, 2018, 2019 г.), штамм фиксированного вируса бешенства CVS, используемый для оценки специфической активности. Выделение вирусной РНК из указанных образцов, структура прай-меров, использованных для реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), проведение реакции обратной транскрипции (ОТ), ПЦР описаны в приведенных ниже пунктах 1-4 соответственно. Анализ каждого из образцов проводился в трех повторах.
1. Подбор праймеров
Для определения вариабельных и консервативных участков генома вируса бешенства был проведен анализ первичной структуры полноразмерных последовательностей штаммов вирусов бешенства, представленных в GenBank. Это позволило произвести выбор нуклеотидных маркеров для подтверждения подлинности вакцинного штамма Внуково-32. На основании полученных данных проведен выбор области для амплификации и подбор праймеров. Расчеты проводили с использованием программного обеспечения Vector NTI Advance 11.0 (Invitrogen Corporation). Структура использованных в работе праймеров и их характеристика приведены в таблице 2.
При компьютерном анализе последовательности подобранных олигонуклеотидов они не образовывали стабильных вторичных структур в виде шпилек и термодинамически стабильных гомо- и гетеродимеров. Синтез праймеров был проведен в компании Синтол (Россия).
2. Выделение РНК и ОТ-ПЦР
Из 100 мкл препарата, содержащего штамм вируса бешенства Внуково-32 или штамм фиксированного вируса бешенства CVS, с помощью комплекта реагентов «МАГНО-сорб» (Ампли-Сенс®, ИнтерЛабСервис) выделяли РНК согласно инструкции производителя.
Для получения кДНК с использованием праймера RabF (табл. 2) и набора реагентов для ОТ (Синтол, Россия) на матрице вирусной РНК проводили реакцию ОТ. На первом этапе смешивали 2 мкл праймера RabF (10 пкмоль/мкл) с 6 мкл выделенной РНК и прогревали смесь при 95 °C 5 мин. Далее охлаждали пробирки при комнатной температуре 2 мин и добавляли 22 мкл смеси для ОТ (9 мкл деионизированной воды, 12 мкл 2,5-кратного буферного раствора для ОТ, 1 мкл MMLV-ревертазы) и инкубировали при 42 °C 30 мин. Для инактивации ревертазы смесь прогревали при 95 °C в течение 5 мин.
ПЦР на кДНК, полученной после ОТ, проводили в объеме 25 мкл с использованием праймеров RabF и RabR. ПЦР-смесь получали смешиванием по 1 мкл праймеров RabF
Таблица 2. Структура праймеров Table 2. Primer structure
Праймер Primer Структура Structure Длина, п.н. Length, bp Расчетная температура отжига, °С Estimated annealing temperature, °С
RabF 5' GGTAGTGGAGGACGAAGGATGC 3' 22 58,4
RabR 5' CGCAAGTCTCACTCCCTTTGGA 3' 22 60,1
GGTAGTGGAGGACGAAGGATGCACCAACCTGTCAGGGTTCTCCTACATGGAACTTAAAGTTGGATACATCTTAGCCA TAAAAATGAACGGGTTCACTTGCACAGGCGTTGTGACGGAGGCTGAAAACTACACTAACTTCGTTGGTTATGTCACA ACCACGTTCAAAAGAAAGCATTTCCGCCCAACACCAGATGCATGTAGAGCCGCGTACAACTGGAAGATGGCCGGTG
TCTCTCGTTATCATATCTCCAAGTGTA GCAGATTTGGACCCATATGACAGATCCCTTCACTCGAGGGTCTTCCCTAGC GGGAAGTGCTCAGGAGTAGCGGTGTCTTCTACCTACTGCTCCACTAACCACGATTACACCATTTGGATGCCCGAGAA TCCGAGACTAGGGAAGTCTTGTGACATTTTTACCAATAGTAGAGGGAAGAGAGCATCCAAAGGGAGTGAGACTTGCG
Рис. 1. Нуклеотидная последовательность штамма Внуково-32. Фрагмент соответствует позициям 3458-3996 генома вируса бешенства. CAGCTG сайт рестрикции PvulI.
Fig. 1. The nucleotide sequence of the Vnukovo-32 strain. The fragment corresponds to positions 3458-3996 of the rabies virus genome. PvulI restriction site, CAGCTG.
(10 пкмоль/мкл), RabR (10 пкмоль/мкл), 10 мкл универсальной 2,5-кратной реакционной смеси для ПЦР (Синтол, Россия) и 8 мкл деионизированной воды с последующим добавлением 5 мкл кДНК. Амплификацию проводили по следующей программе: 95 °C — 1 мин 30 с; 40 циклов: 95 °C — 20 с, 55 °C — 15 с, 72 °C — 45 с; финальная элонгация 72 °C — 10 мин.
3. Секвенирование
Секвенирование ПЦР-продуктов с расчетной длиной 539 п.н. проводили на автоматическом секвенаторе Genetic Analyzer 3500 (ABI, США) с использованием праймеров, использовавшихся для амплификации. Последовательность каждого фрагмента была расшифрована с прямого и обратного праймера, полученные первичные структуры проверены на отсутствие разночтений и полиморфизмов и объединены в программе Vector NTI 9.1 с помощью функции Contig Assembler.
4. Проведение ПДРФ1
В реакцию рестрикции брали по 5 мкл смеси ПЦР после амплификации. Реакцию проводили эндонуклеазой рестрикции PvuII (ООО «СибЭнзим», Россия) в объеме 20 мкл в течение 1 ч согласно инструкции производителя. Продукты гидролиза разделяли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия и визуализировали в УФ-свете.
Результаты и обсуждение
Определение нуклеотидной последовательности
фрагмента гена G из представленных образцов
Штамм Внуково-32. В результате исследования при амплификации РНК, выделенной из всех указанных образцов, включающих производственный штамм, рабочие посевные вирусы (№ 26, 28), готовые серии вакцины, были получены фрагменты с расчетной длиной 539 п.н. Нуклеотидная последовательность фрагментов всех образцов была идентична и представлена на рисунке 1.
Результаты секвенирования кДНК производственного штамма Внуково-32 представлены в GenBank (номер MN116503). В результате проведенного множественного выравнивания фрагментов гена G вируса бешенства штамма Вну-ково-32 (производственный штамм, рабочий посевной вирус, готовые серии вакцины) и ряда известных вакцинных штаммов (ERA, ERA-VC, SAG-2, SAD-B19, SAD-Bern) было показано отсутствие отличий в нуклеотидной последовательности штамма Внуково-32, полученной как из производственного штамма, рабочего посевного вируса, так и из готовых серий вакцины, выпущенных в разные годы. Это позволяет предполагать генетическую стабильность штамма Внуково-32, как минимум по изучаемому фрагменту, на разных этапах производства вакцины.
1 ПДРФ — полиморфизм длин рестрикционных фрагментов.
На основании полученных данных была составлена таблица 3, отображающая выявленные нуклеотидные различия в штаммах вируса бешенства (группа SAD).
Проведенный анализ показывает, что вакцинный штамм Внуково-32, используемый для производства, отличается от близких к нему штаммов, что позволяет проводить его идентификацию, исходя из нуклеотидного состава выбранной части генома. Анализ последовательностей штамма Внуково-32 и других вакцинных штаммов показал, что ген белка G штамма Внуково-32 содержит сайт рестрикции PvuII — CAGCTG. ДНК других штаммов не имеют такого сайта. В связи с этим появляется возможность подтверждения подлинности штамма Внуково-32 на всех этапах производства и в готовой форме вакцины с использованием молекулярно-генетичес-ких методов. Использование указанной рестриктазы позволяет гидролизовать амплифицированный фрагмент 539 п.н. с образованием двух фрагментов 276 и 263 п.н. В случае использования ПЦР-продукта, полученного на кДНК штамма Внуково-32, в агарозном геле результат гидролиза будет выглядеть одной выраженной полосой. В случае других штаммов (в нашем случае штамм CVS) реакция не пройдет, и фрагмент останется той же длины — 539 п.н. Результаты проведенного ПДРФ-анализа представлены на рисунке 2. При проведении гидролиза рестриктазой PvuII ПЦР-продукта, полученного на кДНК штамма CVS, в связи с отсутствием указанного сайта рестрикции у данного штамма реакция не прошла, в то время как у образцов, полученных на кДНК штамма Внуково-32, отмечается расщепление амплифицированного фрагмента с образованием 2 фрагментов примерно равной длины, в результате чего они визуализируются в виде одной полосы в районе 260-270 п.н.
ШтаммCVS. В результате исследования при амплификации РНК, выделенной из 10% мозговой суспензии штамма фиксированного вируса бешенства CVS, получен фрагмент с расчетной длиной 539 п.н. Нуклеотидная последовательность штамма CVS представлена на рисунке 3.
Анализ нуклеотидной последовательности фиксированного вируса бешенства штамма CVS свидетельствует о том, что она полностью гомологична нуклеотидным последовательностям штаммов CVS, представленных в открытом доступе в GenBank. В базе данных GenBank представлены последовательности штаммов CVS, используемых разными исследовательскими группами.
По своей нуклеотидной последовательности штамм CVS вируса бешенства, используемый в ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН» для контроля специфической активности, гомологичен последовательностям штаммов CVS, используемых в мире, и не содержит сайт рестрикции PvuII, характерный для штамма Внуково-32.
Таблица 3. Различающиеся нуклеотиды в изучаемом фрагменте гена G штамма Внуково-32, других вакцинных производных штаммов SAD и референсного штамма вируса бешенства RABV ref
Table 3. Differing nucleotides in the studied G gene fragment of the Vnukovo-32 strain, other vaccine derivatives of the SAD strain, and the RABV ref rabies virus reference strain
Штамм / Позиция в геноме Strain / Position in the genome Vnuk 32 РПВ ГСВ ERA ERA-VC SAG-2 SAD-B19 SAD-Bern RABV ref
3528 C C C T T T T T C
3539 A A A A A G G A A
3731 A A A C C C C C C
3732 G G G G G G G G A
3795 T T T A A A A A A
3839 A A A A A A A A G
3847 G G G G G G G G T
3918 A A A A A A A G A
3932 A A A A A A A G A
Число отличий от Vnuk 32 Number of differences from the Vnukovo-32 strain - - - 3 3 4 4 5 5
Примечание. Серым фоном выделены нуклеотиды, отличающиеся от таковых в последовательности Внуково-32; позиции нуклеотидов даны по геномной последовательности референсного штамма вируса бешенства (RABV ref GenBank NC 001542). Vnuk 32 — производственный штамм Внуково-32 (GenBank MN116503); РПВ — рабочий посевной вирус; ГСВ — готовые серии вакцины антирабической 521, 962, 018. «-» отличия не выявлены.
Note. Nucleotides that differ from those in the Vnukovo-32 sequence are highlighted in grey; nucleotide positions are given according to the genomic sequence of the rabies virus reference strain (RABV ref GenBank NC 001542). Vnuk32—production strain Vnukovo-32 (GenBank MN116503); РПВ— working virus seed; ГСВ—finished batches of the rabies vaccine 521, 962, 018. - no differences identified.
CVS Внуков o-32
M 1 _2___¡3_
100 bp Иск. PvuII' Иск. PvuII Иск. PvuII Иск FvuII
539 п.н. 539 bp
276+263 п.н. 276+263 bp
1 234 56 789
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов гидролиза рестриктазой PvuII ампликонов фрагмента гена G, полученных из различных образцов штаммов вируса бешенства. Дорожка 1 — М, маркер длин фрагментов ДНК (SE 100bp, НПО «СибЭнзим», М15); дорожки 2, 3 — штамм CVS: 2 — продукт амплификации до рестрикции PvuII, 3 — результат гидролиза PvuII; дорожки 4-9 — штамм Внуково-32; дорожки 4-5 — производственный штамм; 6-7 — серия вакцины 561; 8-9 — серия вакцины 962; 4, 6 и 8 — продукты амплификации до рестрикции PvuII; 5, 7 и 9 — результаты гидролиза PvuII. Рис. 2. Electropherogram of the products of PvuII hydrolysis of the G gene fragment amplicons obtained from different samples of rabies virus strains. Lane 1—M, marker of DNA fragment length (SE 100 bp, Research, Development and Production Facility "SibEnzyme", М15); Lanes 2, 3—CVS strain: 2—amplification product before PvuII restriction, 3—result of hydrolysis by PvuII; Lanes 4-9—Vnukovo-32 strain; Lanes 4-5—production strain; Lanes 6-7—vaccine batch 561; Lanes 8-9—vaccine batch 962; Lanes 4, 6, and 8—amplification product before PvuII restriction; Lanes 5, 7, and 9—results of hydrolysis by PvuII.
GGTAGTGGAGGACGAAGGATGCACCAACCTGTCCGAGTTCTCCTACATGGAACTCAAAGTGGGATACATCTCAGCCATCAAAGTGAAC-GGGTTCACTTGCACAGGTGTTGTGACAGAGGCAGAGACCTACACCAACTTTGTTGGTTATGTCACAACCACATTCAAGAGAAAGCATTT CCGCCCCACCCCAGACGCATGTAGAGCCGCGTATAACTGGAAGATGGCCGGTGACCCCAGATATGAAGAGTCCCTACACAATCCATACCC CGACTACCACTGGCTTCGAACTGTAAGAACCACCAAAGAGTCCCTCATTATCATATCCCCAAGTGTGACAGATTTGGACCCATATGACAA ATCCCTTCACTCAAGGGTCTTCCCTGGCGGAAAATGCTCAGGAATAACGGTGTCCTCTACCTACTGCTCAACTAACCATGATTACACCATT TGGATGCCCGAGAATCCGAGACCAAGGACACCTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAAAGGGAGTGAGACTTGCG
Рис. 3. Нуклеотидная последовательность штамма CVS. Фрагмент соответствует позициям 3458-3996 генома вируса бешенства (GenBank NC001542).
Fig. 3. The nucleotide sequence of the CVS strain. The fragment corresponds to positions 3458-3996 of the rabies virus genome (GenBank NC001542).
I
10 . 1..
f.
20 ■ 1 . -
I
30 . 1..
Ь
40 ■ 1 . -
50 ■ 1 . .
Ь
so ■ 1....
70 ■ t
G_RV__Vnuk32 4 8 S~EHA 4 3
G_SAD-B19 4 8 G SAI>-Bern 4 8
WE DEGCTNLSGFS YME LKVG YI LAI KMNG FTCTG WTE AE TYTN FVG Y VTTT FKRKH FRPT PD ACRAAY WE DEGCTNLSGFS YME LKVG YI LAI KJJnG F TCTGWTE AE T YTN FVGYVTTT FKRKH FRPT PD ACRAAY WE DEGCTNLSGFS YME LKVG YI LAI KMNG F TCTGWTE AE T YTN FVG YVTTT FKRKH FRPT PD ACRAAY
G_RABVxe£ 4 8 WE DEGCTNLSGFS YME LKVG YI §AI KMNG FTCTG WTE AE T YTN FVG Y VTTT FKRKH FRPT PD ACRAAY
80
90
100
110
120
130
140
G RV Vnuk32 118
G_EPA G_SAD-B19 G SAD-Bern
118 118 118
----[----I----I----I----I----I----I----I----[----I----I----I----I----[
NWKMAGD PRYE E SLHN P Y PD Y^WLRTVKTTKE SLVIISP SVAJJLD PYDRSLHSRVFPSGKC SGVAVS STY NWKMAGD PRYEESLHNPYPD YRWLRT VKTTKE SLVIISPS VAD LDPYDRSLHSRVFPSGKC SGVAVS STY NWKMAGD PR Y E E S L HN P Y PD YRWLRT VKTTKE SLVIISPS VADLD PYDRSLHSRVFPSGKCS G VAVS STY NWKMAGD PRY E E S LHN PY PD YRWLRTVKT TKESLVIISPSVADLDPYDRSLHSRVFPSGKCSGVAVSSTY
G_RABVref 118 NWKMAGD PRYE E S LHN P Y PD Y^WLRTVKTTKE SLVI ISP S VADLD PYDRSLH SRVF P^G^C S G VAVS STY
150 160 170 180
----I----I----I----I----I----I----I----I
G_RV_Vnuk32 188 С STNHO YTIWMPEN PRLGMS CD IFTN S RGKRASKG SE TC G_ERA 188 С STNHDYT IWMPEN PRLGMS CD I FTN S RGKRASKG SETC
G_SAD-B19 188 С STNHDYT IWMPEN PRLGMS CD I FTN S RGKRASKG SETC G_SAD-Bern 188 CSTNHDYTIWMPE § PRLGQ S CD IF TN SRGKRASKG SETC G RABVref 188 С STNHDYT IWMPEN PRLGMS CD I FTN S RGKRASKG S ETC
Рис. 4. Множественное выравнивание части белка G ряда штаммов группы SAD, кодируемых фрагментом вирусной РНК длиной 539 п.н. Черным фоном выделены аминокислотные остатки, отличающиеся от консенсусных, серым фоном — известные эпитопные участки белка G, расположенные на этом участке. Из рассмотрения удалены последовательности для штаммов ERA-VC и SAG-2, полностью совпадающие с последовательностями для штаммов ERA и SAD-B19 соответственно. Fig. 4. Multiple alignment of a portion of protein G of a number of SAD strains encoded by a viral RNA fragment, 539 bp in length. The amino acid residues that differ from consensus amino acids residues are highlighted in black, known epitope regions of protein G located in this area are highlighted in grey. The sequences of ERA-VC and SAG-2 strains that coincide completely with the sequences of ERA and SAD-B19 strains, respectively, were excluded from the analysis.
Рис. 5. Схематическое представление белка G вируса бешенства и расположение выявленных в нем эпитопных участков. Синим цветом указаны аминокислоты, соответствующие эпитопным участкам. Координаты участков приведены для зрелого белка (без учета участка сигнального пептида) (по N. A. Kuzmina [14] с изменениями).
Fig. 5. Schematic representation of the rabies virus protein G and location of identified epitope regions. The amino acids corresponding to the epitope regions are printed in blue. The coordinates of the regions are given for the mature protein (excluding the signal peptide region) (adapted from N. A. Kuzmina [14]).
Сравнение аминокислотных последовательностей, кодируемых фрагментом гена G, соответствующего позициям 3458-3996 генома вируса бешенства. Возможное влияние аминокислотных замен на антигенные свойства белка G Для определения изменений в первичной структуре белка G, вызванных заменами нуклеотидов в изучаемом фрагменте гена белка G, было проведено множественное выравнивание аминокислотных последовательностей, кодируемых этим фрагментом в выбранной группе геномов штаммов вируса бешенства (рис. 4).
Первичная структура участка белка G вируса бешенства штамма Внуково-32 содержит 3 аминокислотные замены по сравнению с консенсусными (наиболее часто встречающимися) аминокислотными остатками для вирусов всей группы SAD. Из них наиболее значимой является замена, приводящая к резкому изменению полярности аминокислотных остатков — D^V (позиция 113 в данном выравнивании).
Изучению антигенных свойств белка G вируса бешенства посвящены исследования, в которых были выявлены короткие участки этого белка, являющиеся антигенными детерминантами (эпитопами) для известных моноклональных антител к вирусу бешенства [14]. Полученные данные представлены в работе X. Liu с соавт. [6]. Обнаруженные к настоящему времени основные антигенные участки белка G вируса показаны на рисунке 5 [14].
Сравнение этих данных с выравниванием, приведенным на рисунке 4, показывает, что часть белка G, кодируемая изучаемым фрагментом 539 п.н., содержит два эпитопа (GCTNLSGFS и KRA; выделены на рис. 4 серым цветом фона). Эти последовательности белка G не содержат изменений ни у одного из рассмотренных штаммов. Таким образом, по имеющимся данным, белок G из штамма Внуково-32 содержит как минимум два неизмененных эпитопных участка, способных участвовать в выработке иммунного ответа у вакцинируемых. Все три наблюдаемые замены аминокислотных остатков расположены между двумя антигенными участками и, вероятно, не оказы-
вают существенного влияния на пространственную структуру белка и изменение его экспонируемых частей. К сожалению, трехмерная структура белка G вируса бешенства до сих пор не установлена, что не дает возможности определить экспонируемые части белка и положение в нем части, кодируемой фрагментом 539 п.н., более точно.
Выводы
1. Структура РНК вируса бешенства штаммов Внуково-32, CVS, кодирующая часть фрагмента белка G, соответствует аналогичному фрагменту РНК вируса бешенства.
2. Структура РНК штамма вируса бешенства Внуково-32, используемого в ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН», длиной 539 п.н., кодирующая фрагмент белка G, является стабильной на этапах производства.
3. В изученной части нуклеотидной последовательности штамм вируса бешенства CVS гомологичен нуклеотидным последовательностям штаммов вируса бешенства CVS, используемых в других странах.
4. Показана возможность применения рестрикционно-го анализа для подтверждения подлинности штамма Внуко-во-32 вируса бешенства на всех этапах производства, включая готовую форму вакцины.
Вклад авторов. Г. М. Игнатьев — идея и дизайн исследования, анализ и интерпретация результатов исследования; А. С. Оксанич — дизайн исследования, расчет праймеров, проведение секвенирования, анализ результатов исследования; Л. П. Антонова — проведение полимеразной цепной реакции, написание и доработка текста; Т. Г. Самарцева — проведение полимеразной цепной реакции, секвенирование; С. В. Мосолова — подготовка образцов штаммов вируса бешенства; К. М. Мефед — выделение РНК из образцов готовой формы вакцины, анализ результатов исследования; Л. В. Гмыль — обсуждение дизайна исследования, сравнение аминокислотных последовательностей, кодируемых фрагментом гена G, анализ результатов исследования; Н. А. Нетесова — дизайн исследования, проведение анализа первичной структуры полноразмерных последовательностей штаммов вирусов бешенства, выбор нуклеотидных маркеров.
Authors' contributions. Georgy M. Ignatyev—elaboration of the study idea and design, analysis and interpretation of the results; Aleksey S. Oksanich—elaboration of the study design, calculation of primers, performing sequencing, analysis of the results; Liliya P. Antonova—performing polymerase chain reaction, writing and editing of the text; Tatyana G. Samartseva— performing polymerase chain reaction and sequencing; Svetla-na V. Mosolova—preparation of the samples of the rabies virus strains; Kirill M. Mefed—isolation of RNA from the finished dosage form of the vaccine, analysis of the study results; Larisa V. Gmyl—discussion of the study design, comparison of the amino acid sequences encoded by the G gene fragment, analysis of the study results; Nina A. Netesova—elaboration of the study design, analysis of the primary structure of full-length sequences of the rabies virus strains, selection of nucleotide markers.
Благодарности. Исследование проводилось без спонсорской поддержки.
Acknowledgements. The study was performed without external funding.
Конфликт интересов. Г. М. Игнатьев является членом редакционной коллегии журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение».
Conflict of interest. Georgy M. Ignatyev is a member of the Editorial Board of the BlOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment.
^HTepaTypa/References
1. Hampson K, Coudeville L, Lembo T, Sambo M, Kieffer A, Attlan M, et al. Estimating the global burden of endemic canine rabies. PLoS Negl Trop Dis. 2015;9(4):e0003709. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0003709
2. Zhang Y, Zhang S, Li W, Hu Y, Zhao J, Liu F, et al. A novel rabies vaccine based on toll-like receptor 3 (TLR3) agonist PIKA adjuvant exhibiting excellent safety and efficacy in animal studies. Virology. 2016;489:165-72.
https://doi.org/10.1016/j.virol.2015.10.029
3. Ertl HCJ. New rabies vaccines for use in humans. Vaccines. 2019;7(2):54. https://doi.org/10.3390/vaccines7020054
4. Morimoto K, Shoji Y, Inoue S. Characterization of P gene-deficient rabies virus: propagation, pathogenicity and antigenicity. Virus Res. 2005;111(1):61-7. https://doi.org/10.1016Zj.virusres.2005.03.011
5. Ito N, Sugiyama M, Yamada K, Shimizu K, Takayama-Ito M, Hosokawa J, et al. Characterization of M gene-deficient rabies virus with advantages of effective immunization and safety as a vaccine strain. Microbiol Immunol. 2005;49(11):971-9.
https://doi.org/10.1111/j. 1348-0421.2005.tb03692.x
6. Liu X, Yang Y, Sun Z, Chen J, Ai J, Dun C, et al. A recombinant rabies virus encoding two copies of the glycoprotein gene confers protection in dogs against a virulent challenge. PLoS One. 2014;9(2):e87105.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087105
7. Hu SC, Hsu CL, Lee MS, Tu YC, Chang JC, Wu CH, et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerg Infect Dis. 2018;24(4):782-5. https://doi.org/10.3201/eid2404.171696
8. Nokireki T, Tammiranta N, Kokkonen UM, Kantala T, Gadd T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transbound Emerg Dis. 2018;65(3):593-6.
https://doi.org/10.1111/tbed.12833
9. Amarasinghe GK,Ayllon MA, Bào Y, Basler CF, Bavari S, Blasdell KR, et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2019. Arch Virol. 2019;164(7):1967-80. https://doi.org/10.1007/s00705-019-04247-4
10. Picard-Meyer E, Beven V, Hirchaud E, Guillaume C, Larcher G, Robardet E, et al. Lleida Bat Lyssavirus isolation in Miniopterus schreibersii in France. Zoonoses Public Health. 2019;66(2):254-8. https://doi.org/10.1111/zph.12535
11. Geue L, Schares S, Schnick C, Kliemt J, Beckert A, Freuling C, et al. Genetic characterisation of attenuated SAD rabies virus strains used for oral vaccination of wildlife. Vaccine. 2008;26(26):3227-35.
https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2008.04.007
12. Kissi B, Badrane H, Audry L, Lavenu A, Tordo N, Brahimi M, et al. Dynamics of rabies virus quasispecies during serial passages in heterologous hosts. J Gen Virol. 1999;80(8):2041-50.
https://doi.org/10.1099/0022-1317-80-8-2041
13. Dietzgen RG, Kondo H, Goodin MM, Kurath G, Vasilakis N. The family Rhabdoviridae: mono- and bipartite negativesense RNA viruses with diverse genome organization and common evolutionary origins. Virus Res. 2017;227:158-70. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2016.10.010
14. Kuzmina NA, Kuzmin IV, Ellison JA, Rupprecht CE. Conservation of binding epitopes for monoclonal antibodies on the rabies virus glycoprotein. J Antivir Antiretrovir. 2013;5(2):037-43.
Об авторах / Authors
Игнатьев Георгий Михайлович, д-р мед. наук, проф. Georgy M. Ignatyev, Dr. Sci. (Med.), Professor. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9731-3681
Оксанич Алексей Сергеевич, канд. биол. наук. Aleksey S. Oksanich, Cand. Sci. (Biol.). ORCID: https://orcid.org/0000-0002-8600-7347
Антонова Лилия Петровна. Liliya P. Antonova. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1221-1134
Самарцева Татьяна Геннадьевна. Tatyana G. Samartseva. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3264-6722
Мосолова Светлана Владимировна. Svetlana V. Mosolova. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9177-9712
Мефед Кирилл Михайлович, канд. биол. наук. Kirill M. Mefed, Cand. Sci. (Biol.). ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7335-1982
Гмыль Лариса Вениаминовна. Larisa V. Gmyl. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-1494-411X
Нетесова Нина Александровна, д-р биол. наук. Nina A. Netesova, Dr. Sci. (Biol.). ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9896-5403
Поступила 26.03.2020 Received 26 March 2020
После доработки 25.05.2020 Revised 25 May 2020
Принята к публикации 27.05.2020 Accepted 27 May 2020
