CC BY
48
ORIGINAL RESEARCH
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020
Сравнительная молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса бешенства (Rabies lyssavirus, Lyssavirus, Rhabdoviridae), циркулировавших на территории Российской Федерации в период с 1985 по 2016 год
Зайкова О.Н.12, Гребенникова ТВ.12, Лосич М.А.1, Елаков А.Л.1, Гулюкин А.М.3, Метлин А.Е.4
1 Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, г. Москва, Россия;
2 ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов», 117198, г. Москва, Россия;
3 ФГБНУ «Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук». 109428, г. Москва, Россия;
4 ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», 123022, г. Москва, Россия
Бешенство - древнейшая инфекция, вызываемая нейротропным вирусом рода Lyssavirus, семейства Rhabdoviridae, который поражает всех теплокровных позвоночных. Гомология последовательностей аминокислот нуклеопротеина среди лиссавирусов 78-93%.
Целью данного исследования было изучение генетического разнообразия и молекулярной эпидемиологии лиссавирусов, циркулировавших на территории РФ с 1985 по 2016 г.
Материал и методы. Исследовано 54 изолята вируса бешенства, выделенных от животных, 2 изолята, выделенных от людей, и 4 вакцинных штамма вируса бешенства: RV-97, ERA, Shchelkovo 51, ERAG333. Филогенетический анализ проводили с использованием данных GenBank о фрагментах геномов 73 изолятов вируса бешенства и 9 изолятов EBLV-1. Для исследования использовали программы DNASTAR V.3.12, Bio Edit 7.0.4.1 и MEGA v. 10.0.5, Primer Premier 5.
Результаты. Сравнительный молекулярно-генетический анализ фрагментов геномов 130 лиссавирусов, выделенных на территории РФ и Украины, а также вакцинных штаммов вируса бешенства показал их распределение по географическому признаку. Сравнение фрагментов нуклеопротеина изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории РФ и Украины, с вакцинными штаммами выявило 4 маркёрных мутации: V56I (для Евразийской группы), L/V95W (для Центральной группы), D101N/S/T, N/G106D. Филогенетический анализ изолята «Juli», выделенного в 1985 г. от человека, укушенного летучей мышью, и описанного М.А. Селимовым и С.В. Грибенча, доказал его принадлежность к европейскому лиссавирусу летучих мышей (подгруппе 1a).
Обсуждение. Изучение молекулярной эпидемиологии бешенства в пределах РФ позволяет проводить ге-нотипирование вируса (распределение по группам, выявление маркёрных мутаций, генотипирование изолята «Juli»). Это помогает изучать скрытые механизмы рабической инфекции в популяции животных и человека, а также характеризовать вакцинные штаммы, в том числе при оральной вакцинации. Заключение. Необходимо дальнейшее изучение молекулярной эпидемиологии бешенства в пределах РФ и граничащих с ней стран.
Ключевые слова: бешенство; лиссавирусы; филогенетический анализ; секвенирование; эпизоотический процесс.
Для цитирования: Зайкова О.Н., Гребенникова Т.В., Лосич М.А., Елаков А.Л., Гулюкин А.М., Метлин А.Е. Сравнительная молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса бешенства (Rabies lyssavirus, Lyssavirus, Rhabdoviridae), циркулировавших на территории Российской Федерации в период с 1985 по 2016 год. Вопросы вирусологии. 2020; 65(1): 41-48.
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-1-41-48
Для корреспонденции: Зайкова Ольга Николаевна, науч. сотрудник лаборатории молекулярной диагностики ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи», мл. науч. сотрудник ФГАОУ ВО «РУДН», 117198, г. Москва. E-mail: zaykova_o_n@mail.ru
Финансирование. Публикация подготовлена при поддержке Программы «5-100» ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов».
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Участие авторов: концепция и дизайн исследования - Гребенникова Т.В.; сбор и обработка материалов - Зайкова О.Н., Гулюкин А.М., Елаков А.Л.; статистическая обработка - Зайкова О.Н.; написание текста - Зайкова О.Н., Лосич М.А.; редактирование - Гребенникова Т.В., Гулюкин А.М., Метлин А.Е.
Поступила 19.01.20 Принята в печать 29.01.20
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Comparative molecular and genetic characterization of rabies viruses (Rabies lyssavirus, Lyssavirus, Rhabdoviridae) circulated in the Russian Federation in 1985-2016
Zaykova O.N.12, Grebennikova T.V.12, Losich M.A.1, Elakov A.L.1, Gulyukin A.M.3, Metlin A.E.4
1 National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after honorary academician N.F. Gamaleya, Moscow , 123098, Russia;
2 Peoples' Friendship University of Russia, Moscow, 117198, Russia;
3 All-Russian Scientific and Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after K.I. Scriabin and Ya.R. Kovalenko of the Russian Academy of Sciences, Moscow, 109428, Russia;
4 All-Russian State Center for Quality and Standardization of Medicines for Animals and Feed, Moscow, 123022, Russia Introduction. Rabies caused by the neurotropic virus of the genus Lyssavirus, Rhabdoviridae family, which infects all warm-blooded vertebrates including human beings. The homology level of the amino acid sequences for Lyssaviruses nucleoprotein reaches 78-93%.
Aim - study the genetic diversity and molecular epidemiology of Lyssaviruses circulated in the Russian Federation in 1985-2016.
Material and methods. 54 isolates of rabies virus isolated from animals, and 2 isolates from humans, 4 vaccine strains of rabies virus: RV-97, ERA, Shchelkovo 51, ERAG333 used in phylogenetic study. Phylogenetic analysis was performed using Genbank data on genome fragments of 73 rabies virus isolates and 9 EBLV-1 isolates. DNASTAR V.3.12, Bio Edit 7.0.4.1 and MEGA v.10.0.5, Primer Premier 5 programs have been used. Results. Comparative molecular genetic analysis of genomes fragments of 130 Lissaviruses, isolated on the territory of the RF, Ukraine in 1985-2016, vaccine strains of rabies virus, showed their distribution by geographical feature. Comparison of the nucleoprotein fragments of the rabies virus isolates with vaccine strains revealed 4 marker mutations: V56I (Eurasian group), L/V95W (Central group), D101N/S/T, and N/G106D. Phylogenetic analysis of the isolate «Juli», isolated from a human bitten by a bat proved his belonging to the European Bat lyssavirus-1a.
Discussion. Study of the molecular epidemiology of rabies within the Russian Federation allows for the genotyping of the viruses and helps to study the hidden mechanisms of rabies infection in animal and human populations, and to characterize vaccine strains, including during oral vaccination.
Conclusion. Further study of the molecular epidemiology of rabies within the Russian Federation and the countries bordering it is important.
Keywords: rabies; lyssaviruses; phylogenetic analysis; sequencing; epizootic process.
For citation: Zaykova O.N., Grebennikova T.V., Losich M.A., Elakov A.L., Gulyukin A.M., Metlin A.E. Comparative molecular and genetic characterization of rabies viruses (Rabies lyssavirus, Lyssavirus, Rhabdoviridae) circulated in the Russian Federation in 1985-2016. Voprosy Virusologii (Problems of Virology, Russian journal). 2020; 65(1): 41-48. (In Russ.).
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-1-41-48
For correspondence: Olga N. Zaykova, Researcher at the Laboratory of Molecular Diagnostics, National Research
Center for Epidemiology and Microbiology named after honorary academician N.F. Gamaleya, Moscow, 123098,
Russia; Junior Researcher at the Peoples' Friendship University of Russia, Moscow, 117198, Russia. E-mail:
zaykova_o_n@mail.ru
Information about authors:
Zaykova O.N., http://orcid.org/0000-0003-4708-2069
Grebennikova T.V., http://orcid.org/0000-0002-6141-9361
Losich M.A., http://orcid.org/0000-0002-5618-1918
Elakov A.L., http://orcid.org/0000-0001-5798-6518
Gulyukin A.M., https://orcid.org/0000-0003-2160-4770
Metlin A.E., https://orcid.org/0000-0002-4283-0171
Acknowledgments. The publication was prepared with the support of the « Peoples' Friendship University Program 5-100».
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Contribution: research concept and design - Grebennikova T.V.;
collection and processing of materials - Zaykova O.N., Gulyukin A.M., Elakov A.L.;
statistical processing - Zaykova O.N.; spelling text - Zaykova O.N., Losich M.A.;
editing -- Grebennikova T.V., Gulyukin A.M., Metlin A.E.
Received 19 January 2020 Accepted 29 January 2020
Введение
Бешенство - одна из древнейших инфекций, возбудителем которой является нейротропный вирус рода Lyssavirus, семейства Rhabdoviridae. Вирус классического бешенства (Rabies virus) поражает всех теплокровных позвоночных. Геном вируса бешенства представлен молекулой РНК отрицательной полярности и имеет 5 открытых рамок считывания, располагающихся в геноме в следующем порядке: 3'-N-P-M-G-L-5' [1-3].
По данным Международного комитета по таксономии вирусов, род Lyssavirus в настоящее время насчи-
тывает 16 видов, переносчиками для 13 видов могут являться рукокрылые млекопитающие, 7 видов лис-савирусов были обнаружены у людей (Rabies virus, European bat lyssavirus-1, European bat lyssavirus-2, Irkut lyssavirus, Duvenhage lyssavirus, Australian bat lyssavirus, Mokola lyssavirus). Уровень гомологии последовательностей аминокислот нуклеопротеина среди лиссавирусов достигает 78-93%, что имеет важное значение при генотипировании [4-7].
Изучая изоляты вируса бешенства, выделенные на территории бывшего СССР, И.В Кузьмин и соавт. раз-
ORIGINAL RESEARCH
делили их на несколько групп: А, В, С, D, UG. Позднее С.А. Чупин и соавт. предложили описать группы как Евразийскую, Северную Европейскую, Центральную Российскую и Кавказскую. Топология филогенетических дендрограмм предложенных классификаций совпадает [7-10].
Так, при исследовании фрагментов геномов изо-лятов из Республики Саха (Якутия), Аляски (США), Республики Коми в работе С.А. Чупина и соавт. было установлено, что эти изоляты относятся к Арктической группе, подгруппе Арктическая-2. За 20 лет на данном участке генома эта линия вируса, предком которой, предположительно, является штамм SG23, выделенный от песца в 1988 г., не претерпела изменений. В дальнейшем при более тщательных исследованиях молекулярной структуры гена N этого штамма установлена скорость фиксации замен: 1,4*10~4замен на сайт в год [7].
Бешенство широко распространено в мире, за исключением островных государств, осуществляющих строгие карантинные и профилактические мероприятия. Резервуаром и источником инфекции в природных очагах являются преимущественно дикие плотоядные, а в антропургических очагах - обычно собаки и кошки. В свою очередь, бешенство собак является источником 99% случаев заражения человека и представляет потенциальную угрозу более чем для 3,3 млрд человек. В последнее время возросла роль кошки как потенциального звена в передаче вируса бешенства. В мире ежегодно от бешенства умирают 59 тыс. человек в более чем 150 странах. Наиболее распространено бешенство в странах Азии и Африки (95%) [11-14].
Основу профилактики распространения бешенства составляют оральная иммунизация диких плотоядных, вакцинация домашних и бродячих животных. Известно, что штаммы вируса бешенства, используемые для создания оральных вакцин, могут быть остаточно вирулентными по отношению к некоторым видам животных, поэтому важным этапом контроля антирабических мероприятий должен быть сравнительный молекулярно-генетический анализ штаммов вируса бешенства, используемых при создании оральных вакцин, и изолятов, выделенных на территориях, где проводят оральную иммунизацию [15-19].
Изучение молекулярной эпидемиологии бешенства позволяет охарактеризовать популяции вируса, циркулирующие на территории РФ [20].
Цель данного исследования - изучение генетического разнообразия и молекулярной эпидемиологии лиссавирусов, циркулирующих на территории РФ с 1985 по 2016 г.
Материал и методы
Исследуемые образцы. Было исследовано 54 изоля-та вируса бешенства, выделенных от животных:
• отстрелянных после проведения программы по оральной вакцинации в Брянской и Кировской областях, в том числе 13 изолятов, выделенных от лис, и два - от енота и енотовидной собаки соответственно;
• 39 изолятов, предоставленных лабораторией ФГБУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, Россия) при поддержке лаборатории эпизоотологии ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН, выделенных в Центральном и Приволжском федеральных округах от енотовидной собаки (n = 7), собаки (n = 9), кошки (n = 1), лисы (n = 18) и КРС (n = 4).
Два изолята: «Shuv» (2002 г., Центральная часть России) и «Juli» (1985 г., Белгород, Россия), выделенных от людей, были получены из коллекции НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. Ранее они были описаны в работе С.В. Грибенча и соавт. [6] и в обзоре А.Д. Бот-винкина со ссылкой на исследования М.А. Селимова [8].
Для выравнивания нуклеотидных последовательностей и построения филогенетических деревьев использовали первичную структуру фрагментов геномов 73 лиссавирусов, содержащихся в базе данных GenBank (43 изолята выделены от лис, четыре -от собак, один - от енотовидной собаки, восемь -от крупного рогатого скота, четыре - от кошки, один -от барсука, пять - от волка, три - от человека, один -от верблюда, два - от песца, один - от лошади), а также 9 изолятов EBLV-1.
Для молекулярно-генетического анализа также использовали первичную структуру фрагментов геномов вакцинных штаммов: RV-97, ERA, Щёлково 51, ERA G333.
Контроли при проведении МФА и ОТ-ПЦР использовали в соответствии с методикой [21] и ГОСТ 26075-2013.
Специфические олигонуклеотиды. Нуклеотидные последовательности праймеров, фланкирующих фрагмент гена N, были взяты из работы P. Heaton и соавт., 1997 г. [22], или разработаны в лаборатории (см. таблицу).
Приготовление препаратов. Для подтверждения наличия вируса бешенства в нативных образцах использовали МФА, согласно ГОСТ 26075-2013. Окрашенные препараты просматривали в поле зрения люминесцентного инвертированного микроскопа «Olympus CKX41» (Япония) при увеличении ><20.
Выделение РНК. РНК выделяли из 200 мкл 10% суспензии мозга с применением коммерческого препарата TRI Reagent® (Sigma Aldrich, США) по методике, рекомендованной производителем.
Проведение ОТ-ПЦР. Первым этапом было получение кДНК из РНК, затем проводили ПЦР. Объём реакционной смеси в нашей модификации составил 40 мкл, вносили 10 мкл кДНК. Учёт реакции проводили методом горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле.
Секвенирование ПЦР-фрагментов. Образцы очищали из агарозного геля с помощью набора Silica Bead DNA Gel Extraction Kit (Fermentas, США) согласно инструкции производителя и секвенировали. Реакцию проводили на амплификаторе Mastercycler Gradient (Eppendorf, Германия) с применением Big-Dye® Terminator v 3.1 Ready Reaction kit (Applied Biosystems, США), затем продукты амплификации переосаждали для последующего секвенирования с использованием автоматического секвенатора Applied Biosystems® 3130 Genetic Analyzer (США).
ВОПРОСЫ ВИРУСОЛОГИИ. 2020; 65(1 )
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-1-41-48 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Олигонуклеотиды, фланкирующие фрагмент гена N вируса бешенства, используемые в исследовании The nucleotide sequences of the primers flanking the N gene fragment of the Rabies virus using in this study
Источник Праймер Последовательность Позиция в геноме
Reference Primer Sequence Genome position
P. Heaton и соавт. [22] JW12 5'-ATGTAACACC(C/T)CTACAATTG-3' 55-73
P. Heaton, et al. [22] JW6(DPL) 5'-CAATTCGCACACATTTTGTG-3' 660-641
JW6 (E) 5'-CAGTTGGCACACATCTTGTG-3' 660-641
JW6 (M) 5'-CAGTTAGCGCACATCTTATG-3' 660-641
Разработаны в лаборатории F2 5'-TAACACC(C\T)CTACAATGGA-3' 58-75
Developed in the laboratory R1 3'-TACACACGITTAACCTCATG-5' 647-666
Компьютерный анализ. Для выравнивания нукле-отидных последовательностей и построения филогенетических деревьев применяли пакет программ DNASTAR V.3.12 (Lasergen Inc., США) и программы Bio Edit 7.0.4.1 [23], MEGA v. 10.0.5 [24]; для подбора специфических олигонуклеотидов пользовались программным обеспечением Primer Premier 5 (Premier Biosoft int., США) [25].
Результаты
Проверка изолятов, выделенных от животных и человека, методами МФА и ПЦР выявила вирус бешенства и фрагменты его генома.
Далее сравнивали нуклеотидные и аминокислотные последовательности полученных фрагментов с использованием ранее полученных данных [26-28] и базы данных GenBank.
Сравнение полученных фрагментов нуклеопро-теина изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории РФ и Украины, с вакцинными штаммами выявило 4 маркёрных позиции: V56I, L/V95W, D101N/S/T, N/G106D. Размер исследуемого участка фрагмента гена N составил 439 нуклеотидных остатков (н.о., положение в гене 100-538 н.о.), кодирующих порядка 146 аминокислот.
Так, абсолютное большинство изолятов из республик Алтай, Хакасия, из Красноярска. Омска, республик Тыва и Бурятия имеют в 56-й позиции аминокислоту изолейцин вместо валина. Изоляты из Центральной части России (Центральной группы вирусов), а именно из Московской, Нижегородской, Владимирской, Тверской и Ярославской областей, в 95-й позиции содержат аминокислоту триптофан, как и изолят «Shuv».
Филогенетический анализ изолятов вируса бешенства, циркулировавших на территории РФ (рис. 1), показал, что «Shuv» относится к Центральной группе вирусов бешенства и по молекулярной структуре близок к изолятам из г. Владимир, Собинского района Владимирской области и Москвы. Все изоляты Центральной группы в 95-й позиции имеют аминокислоту триптофан. Изолят из Украины Rvu 09-06 по молекулярной структуре ближе к изолятам Евразийской группы.
Изоляты Центральной группы вирусов в позиции 101 имеют аспарагиновую аминокислоту, в то время как изоляты Евразийской группы вирусов в дан-
ной позиции могут содержать различные аминокислоты и подразделяются на 2 группы. Первую группу образуют изоляты из республик Алтай и Хакасия, из Красноярска, Омска, Республики Тыва, из Тулы и Кировской области. В 101-й позиции они содержат аминокислоту аспарагин либо серин. К 2-й группе относятся изоляты из Белгорода, Брянской и Нижегородской областей, а также один украинской изолят 09-06_Ukraine, содержащие в 101-й позиции аминокислоту треонин.
Изоляты Центральной группы в 106-й позиции имеют аминокислоту глицин, остальные изоляты, в том числе 4 изолята из Тверской и Владимирской областей, в данной позиции содержат аспарагиновую кислоту.
Изоляты Евразийской группы из республик Алтай и Хакасия, из Красноярска, Омска, республик Тыва и Бурятия образуют на филогенетической дендрограм-ме несколько подгрупп: Омская, группа Красноярск-Хакасия-Алтай, куда входит один изолят из Республики Бурятия и один из Омска, и группа Тыва-Бурятия (см. рис. 1). В целом внутри каждой группы по молекулярной структуре данного фрагмента генома изоляты между собой различаются примерно на 0-2%.
При исследовании изолята «Juli» было установлено, что он относится к европейскому лиссавирусу летучих мышей 1 (EBLV-1). Размер исследуемого фрагмента гена N составил 486 н.о. (положение в гене 100-585), кодирующих 161 аминокислоту. Филогенетический анализ (рис. 2) изолята «Juli» и 9 изолятов EBLV-1 показал, что данный изолят, вероятно, можно отнести к подгруппе EBLV-1a. По молекулярной структуре на заданном участке генома он отличается от других представителей этой подгруппы в 158-й позиции, где содержит аминокислоту лизин вместо аргинина. При этом изоляты подгруппы EBLV-1b имеют 2 маркёрных позиции: R8K и H102N, отличающие их от представителей EBLV-1a.
Филогенетический анализ указывает на то, что выделенный в 1968 г. изолят NC 009527 может быть общим предком изолята «Juli» и изолятов, выделенных во Франции в 2003-2008 гг., относящихся к подгруппе EBLV-1a.
Обсуждение
Сравнительно низкая скорость изменчивости молекулярной структуры нуклеопротеина позволяет типировать лиссавирусы и вирус бешенства по гео-
ORIGINAL RESEARCH
4
76 4 -
8Ш
|
HZ
Bryansk_76 Lipetsk_8057f_2011 Rvu09-06 Ukraine Bryansk_77 Voronezh_7512f_2008 Smolensk 2406_2016 Belgorod_7S48f_2008 Nizhniy_273_2014.seq Lipetsk_8053c_2011 Smolensk 461_2016 Lipetsk_8054f_2011 Bryansk_68 Ryazan_813_2014 Belgorod_7532_cow_2008 Belgorocl_7539f_2008 Voronezh_7513f_2008 Voronezh_7514f_2008 Bryansk_13 Krutovo 165_2015 Petushki 2580_2016 Sobinka 2579_2016 Sobinka 2979_2015 Sobinka 538 2016 Vladimir 2448_2015 Ryazan_810_2014 Voronezh_7510f_2008 Voronezh_7511f_2008 Ryazan_816_2014 Lipetsk_8052f_2011 Nizhniy_291_2014 Nizhniy_927_2014 Ryazan_814_2014 Ryazan_812_2014 RV241 Tula Kirov region_13 Kirov region_16 Kirov region_20 Kirov region_9 Kirov region_10 Kirov region_11 Kirovregion_15 Kirov region_18 Kirov region 21 Kirov region_24 Kirov region_3 Astrakhan_8329H_2003 Astrakhan 8330H 2003
3.9_[
iE
0msk_8000f_2011 0msk_8001f_2011 0msk_7703f_2010 0msk_7445f_2008 0msk_7701f_2010 0msk_7586d_2009 0msk_7604c_2009 Omsk 7444f 70ПЯ
Krasnoyarsk_7972f_2011 Krasnoyarsk 7980f_2011 Krasnoyarsk_7503f_2008 Krasnoyarsk_7502f_2008 Krasnoyarsk_7937f_2011 Krasnoyarsk 7938f_2011 Krasnoyarsk_7941f_2011 Krasnoyarsk_7973f_2011 Krasnoyarsk_7979f_2011 wolf-kras Buryatia Krasnoyarsk_7499fA_2008 Krasnoyarsk_7499fT_2008 Krasnoyarsk_7500f_2008 Krasnoyarsk_7501f_2008 Krasnoyarsk_7504f_2008 Krasnoyarsk 7508h_2008 Khakassia_7892_cow_2011 Krasnoyarsk_7943f_2011 Altai_7565f_2008 74J4 П— Altai_7566f_2008 78 9 _ Altai_7564_cow_2008 89J5J -- Altai_7572_cow_2008 0msk_7461f_2008 Khakassia_7891_cow_2011 Khakassia_7894w_2011 Khakassia_7893_cow_2011 Khakassia_7895f_2011 Khakassia 7896f 2011 Tuva_7719w_2010 Tuva_8093camel_2012 Tuva_7463w_2008 Tuva_7466cow_2008 Tuva_7467d_2008 Tuva_7468f_2008 Tuva_7471f_2008 Tuva_8060c_2011 Tuva_8092w_2012 )8 1 I budger buryatia 2 cow-8 Buryatia ' fox-2012 Buryatia_
графическим группам в частности, изучать не только скрытые механизмы распространения бешенства в популяциях животных и человека, но и возможности реверсии вакцинных штаммов, используемых в живых оральных вакцинах для диких плотоядных, к вирулентному варианту [26-33].
В ходе исследования нами проанализировано 130 фрагментов геномов лиссавирусов в сравнении с вакцинными штаммами. Молекулярный анализ изолята «Juli», выделенного от человека, показал его принадлежность к подгруппе EBLV-1a, распространённой в странах Европы, где практически удалось элиминировать Rabies virus, но большую угрозу на сегодняшний день представляют лиссавирусы летучих мышей. Изолят был выделен в 1985 году от человека, укушенного летучей мышью, и описан С.В. Грибенча, а также А.Д. Ботвинкиным [6, 8, 34].
Согласно данным обзора А.Д. Ботвинкина (2011 г.) со ссылкой на М.А. Селимова (1989 г.), вирус «Juli» был выделен от девочки 11 лет, жительницы Украины, гостившей в Белгороде и укушенной летучей мышью в губу в 1985 г. Она заболела и умерла через 1 мес с типичной клинической картиной бешенства. После описания этого случая стало ясно, что rabies-like (rabies-related) вирусы, как их тогда называли, не только циркулируют среди летучих мышей в Европе, но и представляют опасность для лю-
—turasiaп group
(Евразийская группа)
Рис. 1. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основании данных о первичной структуре гена N с помощью MegAlign 7.1.0.
Fig. 1. Phylogenetic tree obtained from the primary structure of thebased on partial sequences of N gene fragment of rabies virus isolates
with MegAlign 7.1.0
ВОПРОСЫ ВИРУСОЛОГИИ. 2020; 65(1)
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-1-41 -48 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
100
EU626551 (isolate 08120FRA) 2008 EU626552 (isolate 07240FRA) 2007 EU293109 (isolate 03002FRA) 2003 NC 009527 1968
-(gl9g)
MF187867 (isolate 9397RUS) 1985 MF187876 (isolate 9443UKR) 1987 KP241939(isolate RV2416) 2007 AY863400 (isolate N02031FRA) 2001 -EU293112 (isolate 8918FRA) 1989
EBLV-la
EBLV-lb
0.0050
V
100
.. I
MT187867,J,isolate 9397RÜS)_198 MT18787«^i,isolate 9443UKR)_198 Juli_1985 NC_009527_1968
£0293109^ sol ate 03002FRA)_20 EU€26551^1iaolate 08120IRA)_20 EU626S52^!,isolate 07240IRA)_20 AY8 6 34 0 O^li в ola te_N02 0 31FRA)_2 EU293112^i,isolate 8918FRA)_198 KRMimiiBolate RV2416)_2007
Mri87867^isolate 9397RUS)_198 MT187876aiiisolate 9443ÜKR)_198 Juli_1985 NC_0 09 5 2 7_19 68
EU293109^isolate 03002ERA)_20 EU£26551^isolate 08120ERA)_20 EU626552^£isolate 07240IRA)_20 AY8 6 34 0 s ola te_N02 0 31TRA)_2 EU293112^isolate 8918ГЕА)_198 gmj53ÄXisolate KV2416)_2007
HNQLVS Г 3EVQSDOYEYKYPMKDKKKPSITLGKDPDLKTAYKSILSGMNAAK113PDI]VCSYliAGAWLrEGICPEDVn,SYGINIAKKfflKITPATLVD
К
К
& 110 120 130 140 150 ____|____|____|____|____|____|____|____|____|____|. А L60
WNTEGN>iAOTGGODbTRDPTTrcHASbVGUjLCbyRbSKIVGQirPGlJYKrMVA м EQ
к
N ,'ы
\
Рис. 2. Филогенетическая дендрограмма изолятов EBLV-1, полученная на основании данных о фрагменте гена N с помощью MEGA
v. 10.0.5, и сравнение фрагментов нуклеопротеина EBLV-1.
Fig. 2. Phylogenetic tree obtained from the primary structure of the N gene fragment of EBLV-1 isolates with MEGA v. 10.0.5 and fragment
comparison of nucleoprotein of EBLV-1
дей. Ранее был известен только один такой случай в Африке [8]. Интересно, что изучаемый нами изо-лят «Juli» попадает в одни и те же временные рамки с изолятами 9397RUS (1985 г.) и 9443UKR (1987 г.), которые описаны в работе C. Troupin и соавт. (2017 г.) [35].
Однако при изучении молекулярной структуры фрагментов нуклеопротеина выявлена одна аминокислотная замена, отличающая изолят «Juli» от других представителей EBLV-1. Наличие замены на сравнительно коротком участке (161 а.о.) может свидетельствовать либо о том, что ранее охаракте-
ризованный изолят 9397RUS (1985 г.) или 9443UKR (1987 г.) претерпел изменения в серии пассажей через мозг белых мышей, либо о том, что молекулярная структура фрагмента генома вируса «Juli» описана нами впервые в рамках данной работы.
Ранее неоднократно было показано распределение вирусов бешенства, циркулирующих на территории РФ и сопредельных стран, на 6 групп [7, 30, 31]:
А. Арктическая: север Красноярского края, север Республики Саха (Якутия), Республика Коми, Земля Франца-Иосифа, Аляска, северная часть Канады, Гренландия.
ORIGINAL RESEARCH
B. Арктически-подобная: Хабаровский край, Читинская область, Приморский край, Маньчжурия (Китайская Народная Республика, КНР).
^ Степная (Евразийская): Белгородская, Тульская, Волгоградская, Оренбургская, Пензенская, Воронежская, Липецкая, Нижегородская, Новосибирская, Астраханская, Омская области, республики Тыва, Дагестан и Башкортостан, Алтайский, Краснодарский и Красноярский края, Украина, Республика Казахстан, Монголия, провинция КНР Внутренняя Монголия и Синьцзян-Уйгурский автономный район КНР.
D. Центральная (Центрально-российская): Московская, Владимирская, Тверская, Тульская, Рязанская, Нижегородская области, Венгрия.
E. Северо-восточно-европейская: Псковская, Новгородская, Брянская, Ленинградская области, Эстония, Финляндия, Литва, Словакия, Польша, Германия, Украина.
F. Кавказская: Республика Дагестан, Краснодарский край, Грузия, Азербайджанская Республика, Ирак, Иран.
Было отмечено, что эпизоотии бешенства циклич-ны, носят сезонный характер и связаны с ареалом обитания и миграциями основных переносчиков возбудителя. Из представленной классификации видно, что некоторые области повторяются в разных группах, это можно проследить и при молекулярном анализе изолятов, выделенных в различных регионах. Так, ранее было показано, что изоляты из Московской, Тверской, Владимирской и Нижегородской областей образуют кластер и их молекулярная структура соответствует Центральной группе вирусов [28].
Изоляты из республик Тыва и Бурятия образуют подгруппу; вероятно, это объясняется тем, что данные регионы граничат друг с другом. Так же можно объяснить образование подгруппы Красноярск-Алтай-Хакасия, в которую, кроме того, попали изолят из Республики Бурятия и изолят из Омска. Однако большинство представленных изолятов из Омска образовали подгруппу, своим расположением указывая в направлении изоля-тов Центральной части России, входящих в Степную (Евразийскую) группу вирусов на дендрограмме.
Евразийская (Степная) группа - наиболее широко представленная группа вирусов, она имеет несколько ответвлений на филогенетической дендрограмме. Подобное наблюдение филогенетического и территориального распределения вирусов, особенности молекулярной структуры гена N лиссавирусов даёт нам право предположить, что эпизоотия бешенства движется с северо- и юго-востока на запад и юго-запад, концентрируясь в центральной части РФ. А с ростом городов и с увеличением числа бродячих невакци-нированных животных эпизоотии природного типа переходят в городскую среду.
Следует отметить, что один изолят из Украины (Rvu 09-06), выделенный от кошки, по молекулярной структуре близок к Степной группе вирусов бешенства, а другой (Rvu 10-33) ранее был отнесён к Северо-восточно-европейской группе [32]. Необходимо
отметить, что пусковым механизмом распространения рабической инфекции являются не только миграции природных резервуарных хозяев вируса бешенства, немаловажную роль может играть и увеличение в последнее время трансграничных передвижений людей со своими животными. Таким образом, необходим не только тщательный контроль со стороны ветеринарных служб, но и ответственный подход самих хозяев, выезжающих со своими питомцами за границу.
Заключение
Бешенство - это природно-очаговый зооантропо-ноз, и для борьбы со смертельной инфекцией необходимы координация ветеринарных и медицинских служб, исследования в области эпидемиологии, мониторинг антирабических антител после вакцинации против бешенства, просветительская работа с населением, контроль программ по оральной иммунизации диких плотоядных.
Результаты проведённых исследований говорят о необходимости дальнейшего мониторинга случаев бешенства на территории РФ методами молекулярного анализа.
Л И Т Е РАТ У РА (п.п. 3-5, 9, 10, 12, 13, 15-17, 19, 21-25, 32-35 см. REFERENCES)
1. В кн.: Львов Д.К., ред. Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. М.: МИА; 2013.
2. Васильев Д.А., Луговцев В.Ю., ред. Вирусы, вызывающие болезни общие для многих видов сельскохозяйственных животных. Курс лекций по вирусологии. Часть вторая. Ульяновск; 2004.
6. Грибенча С.В., Козлов А.Ю., Костина Л.В., Елаков А.Л., Лосич М.А., Цибезов В.В. и др. Получение моноклональных антител к нуклеопротеину вируса бешенства. Вопросы вирусологии. 2013; 58(5): 38-43.
7. Чупин С.А., Чернышова Е.В., Метлин А.Е. Генетическая характеристика полевых изолятов вируса бешенства, выявленных на территории Российской Федерации в период 2008-2011 гг. Вопросы вирусологии. 2013; 58(4): 44-9.
8. Ботвинкин А.Д. Смертельные случаи заболевания людей бешенством в Евразии после контактов с рукокрылыми. (Обзор литературы). Plecotus et al. 2011; (14): 75-86.
11. Всемирная организация здравоохранения. Available at: http:// www.who.int/ru
14. Шабейкин А.А., Гулюкин А.М., Зайкова О.Н. Обзор эпизоотической ситуации по бешенству в Российской Федерации за период с 1991 по 2015 годы. Ветеринария Кубани. 2016; (4): 4-6. 18. Елаков А.Л., Уласов В.И., Баньковский Д.О., Сафонов Г.А. Изучение биологических свойств штамма ERA G333 вируса бешенства. Ветеринария. 2011; (2): 22-4. 20. Полещук Е.М., Сидоров Г.Н., Нашатырева Д.Н., Градобоева Е.А., Пакскина Н.Д., Попова И.В. Бешенство в Российской Федерации: информационно-аналитический бюллетень. Омск: КАН; 2019.
26. Елаков А.Л., Зайкова О.Н., Кочергин-Никитский К.С., Гребенникова Т. В., Алипер Т. И. Мониторинг бешенства у диких животных в Брянской области. Ветеринария. 2015; (1): 11-4.
27. Зайкова О.Н., Гребенникова Т.В., Елаков А.Л., Кочергин-Ни-китский К.С., Алипер Т.И., Чучалин С.Ф. и др. Молекулярно-генетическая характеристика геномов полевых изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории Кировской области. Вопросы вирусологии. 2016; 61(4): 186-92.
DOI: http://doi.org/10.18821/0507-4088-2016-61-4-186-192
28. Зайкова О.Н., Гребенникова Т.В., Гулюкин А.М., Шабейкин А.А., Полякова И.В., Метлин А.Е. Молекулярно-генетическая характеристика полевых изолятов вируса бешенства, выявленных на территории Владимирской, Московской, Тверской, Нижегородской и Рязанской областей. Вопросы вирусологии. 2017; 62(3): 101-8. DOI: http://doi.org/10.18821/0507-4088-2017-62-3-101-108
29. Гулюкин А.М. Значимость современных методов лабораторной диагностики и идентификации возбудителя бешенства для иммунологического мониторинга данного зооноза. Вопросы вирусологии. 2014; 59(3): 5-10.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
30. Полещук Е.М., Сидоров Г.Н., Грибенча С.В. Итоги изучения антигенного и генетического разнообразия вируса бешенства в популяциях наземных млекопитающих России. Вопросы вирусологии. 2013; 58(3): 9-16.
31. Ботвинкин А.Д., Кузьмин И.В., Хисматуллина Н.А. Итоги изучения антигенного разнообразия вируса бешенства на территории бывшего СССР. Ветеринарная патология. 2004; (3): 117-27.
REFERENCES
1. L'vov D.K., ed. Virology Guide. Viruses and Viral Infections of Humans and Animals [Rukovodstvo po virusologii. Virusy i virusnye infektsii cheloveka i zhivotnykh]. Moscow: MIA; 2013. (in Russian)
2. Vasil'ev D.A., Lugovtsev V.Yu., ed. Disease-Causing Viruses are Common to Many Types of Farm Animals. Course of Lectures on Virology. Part Two [Virusy, vyzyvayushchie bolezni obshchie dlya mnogikh vidov .sel 'skokhozyaystvennykh zhivotnykh. Kurs lektsiy po virusologii. Chast'vtoraya]. Ul'yanovsk; 2004. (in Russian)
3. Cai L., Tao X., Liu Y., Zhang H., Gao L., Hu S., et al. Molecular characteristics and phylogenetic analysis of N gene of human derived rabies virus. Biomed Environ. Sci. 2011; 24(4): 431-7.
DOI: http://doi.org/10.3967/0895-3988.2011.04.015.
4. International Committee on Taxonomy of Viruses ICTV. Available at: http://www.ictvonline.org/
5. Hayman D.T., Fooks A.R., Marston D.A., Garcia-R J.C. The global phylogeography of lyssaviruses - challenging the 'out of Africa' hypothesis. PLoS Negl. Trop. Dis. 2016; 10(12): e0005266.
DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005266
6. Gribencha S.V., Kozlov A.Yu., Kostina L.V., Elakov A.L., Losich M.A., Tsibezov V.V., et al. Production of the monoclonal antibodies to the rabies virus nucleoprotein. Voprosy virusologii. 2013; 58(5): 38-43. (in Russian)
7. Chupin S.A., Chernyshova E.V., Metlin A.E. Genetic characterization of the rabies virus field isolates detected in Russian Federation within the period 2008-2011. Voprosy virusologii. 2013; 58(4): 44-9. (in Russian)
8. Botvinkin A.D. Fatal human cases of rabies in Eurasia after contacts with bats. (Review of the literature). Plecotus et al. 2011; (14): 75-86. (in Russian)
9. Kuzmin I.V., Orciari L.A., Arai Y.T., Smith J.S., Hanlon C.A., Kameoka Y., et al. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences. Virus Res. 2003; 97(2): 65-79.
DOI: http://doi.org/10.1016/s0168-1702(03)00217-x
10. Botvinkin A.D., Poleschuk E.M., Kuzmin I.V., Borisova T.I., Gazaryan S.V., Yager P., et al. Novel lyssaviruses isolated from bats in Russia. Emerg. Infect. Dis. 2003; 9(12): 1623-5.
DOI: http://doi.org/10.3201/eid0912.030374
11. World Health Organization. Available at: http://www.who.int/
12. Shulpin M.I., Nazarov N.A., Chupin S.A., Korennoy F.I., Metlin A.Y., Mischenko A.V. Rabies surveillance in the Russian Federation. Rev. Sci. Tech. 2018; 37(2): 483-95. DOI: http://doi.org/10.20506/rst.37.2.2817
13. Hampson K., Coudeville L., limbo T., Sambo M., Kieffer A., At-tlan M., et al. Estimating the global burden of endemic canine rabies. PLos Negi. Trop. Dis. 2015; 9(4): e0003709. DOI: http://doi. org/10.1371/journal.pntd.0003709
14. Shabeykin A.A., Gulyukin A.M., Zaykova O.N. Overview on epizootic situation on rabies in the Russian Federation for the period from 1991 to 2015. VeterinariyaKubani. 2016; (4): 4-6. (in Russian)
15. Fehlner-Gardiner C., Nardine-Davis S., Armstrong J., Muldoon F., Bachmann P., Wandeler A. ERA vaccine-derived cases of rabies in wildlife and domestic animals in Ontario, Canada, 1989 - 2004. J. Wildl. Dis. 2008; 44(1): 71-85.
DOI: http://doi.org/10.7589/0090-3558-44.L71
16. Müller T., Bätza H.J., Beckert A., Bunzenthal C., Cox J.H., Freuling C.M., et al. Analysis of vaccine-virus-associated rabies cases in red foxes (Vulpes vulpes) after oral rabies vaccination campaigns in Germany and Austria. Arch. Virol. 2009; 154(7): 1081-91.
DOI: http://doi.org/10.1007/s00705-009-0408-7
17. Forró B., Marton S., Kecskeméti S., Hornyák Á., Bányai K. Vaccine-associated rabies in red fox, Hungary. Vaccine. 2019; 37(27): 3535-3538. DOI: http://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.05.014
18. Elakov A.L., Ulasov V.I., Ban'kovskiy D.O., Safonov G.A. Studying of biological properties rabies virus strain ERA G333. Veterinariya. 2011; (2): 22-4. (in Russian)
19. Metlin A., Paulin L., Suomalainen S., Neuvonen E., Rybakov S., Mikhalishin V., et al. Characterization of Russian rabies virus vaccine strain RV-97. Virus Res. 2008; 132(1-2): 242-7.
DOI: http://doi.org/10.1016/j.virusres.2007.11.016
20. Poleshchuk E.M., Sidorov G.N., Nashatyreva D.N., Gradoboeva E.A., Pakskina N.D., Popova I.V. Rabies in Russian Federation: Informational Analytical Bulletin [Beshenstvo v Rossiyskoy Federatsii: informatsionno-analiticheskiy byulleten']. Omsk: KAN; 2019.
21. OIE Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). Available at: https://www.oie.int/ standard-setting/terrestrial-manual/access-online/
22. Heaton P.R., Johnstone P., McElhinney L.M., Cowley R., O'Sullivan E., Whitby J.E. Heminested PCR assay for detection of six genotypes of rabies and rabies-related viruses. J. Clin. Microbiol. 1997; 35(11): 2762-6.
23. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. 1999; (41): 95-8.
24. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Mol. Biol. Evol. 2018; 35(6): 1547-9. DOI: http://doi. org/10.1093/molbev/msy096
25. Hall B.G. Building Phylogenetic trees from molecular data with MEGA. Mol. Biol. Evol. 2013; 30(5): 1229-35.
DOI: http://doi.org/10.1093/molbev/mst012
26. Elakov A.L., Zaykova O.N., Kochergin-Nikitskiy K.S., Grebennikova T.V., Aliper T.I. Rabies monitoring in wildlife animals from Bryansk region after oral vaccination. Veterinariya. 2015; (1): 11-4. (in Russian)
27. Zaykova O.N., Grebennikova T.V., Elakov A.L., Kochergin-Nikitskiy K.S., Aliper T.I., Chuchalin S.F., et al. Molecular genetic characteristics of the genomes of field isolates of rabies virus circulating in the Kirov region. Voprosy virusologii. 2016; 61(4): 186-92. DOI: http://doi. org/10.18821/0507-4088-2016-61-4-186-192 (in Russian)
28. Zaykova O.N., Grebennikova T.V., Gulyukin A.M., Shabeykin A.A., Polyakova I.V., Metlin A.E. Molecular genetic characteristics of rabies virus field isolates detected in the territory Vladimir, Moscow, Tver, Nizhny Novgorod and Ryazan regions. Voprosy virusologii. 2017; 62(3): 101-8.
DOI: http://doi.org/10.18821/0507-4088-2017-62-3-101-108 (in Russian)
29. Gulyukin A.M. Significance of modern methods for laboratory detection of rabies agents and identification of the zoonose immunological survey. Voprosy virusologii. 2014; 59(3): 5-10. (in Russian)
30. Poleshchuk E.M., Sidorov G.N., Gribencha S.V. A summary of the data about antigenic and genetic diversity of rabies virus circulating in the terrestrial mammals in Russia. Voprosy virusologii. 2013; 58(3): 9-16. (in Russian)
31. Botvinkin A.D., Kuz'min I.V., Khismatullina N.A. The results of the study of antigen diversity of rabies virus in the territory of the former USSR. Veterinarnayapatologiya. 2004; (3): 117-27. (in Russian)
32. Metlin A.E., Rybakov S., Gruzdev K., Neuvonen E., Huovilainen A. Genetic heterogeneity of Russian, Estonian and Finnish field rabies viruses. Arch. Virol. 2007; 152(9): 1645-54.
DOI: http://doi.org/10.1007/s00705-007-1001-6
33. Deviatkin A.A., Lukashev A.N., Poleshchuk E.M., Dedkov V.G., Tkachev S.E., Sidorov G.N., et al. The phylodinamics of the rabies virus in the Russian Federation. PLos One. 2017; 12(2): e0171855. DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0171855
34. Picard-Meyer E., Robardet E., Laurent A., Cliquet F., et al. Bat rabies in France: a 24-year retrospective epidemiological study. PLos One. 2014; 9(6): e98622.
DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0098622
35. Troupin C., Picard-Meyer E., Dellicour S., Casademont I., Kergoat L., Lepelletier A., et al. Host Genetic Variation Does Not Determine Spatio-Temporal Patterns of European Bat 1 Lyssavirus. Genome Biol. Evol. 2017; 9(11): 3202-13.
DOI: http://doi.org/10.1093/gbe/evx236
