CC BY
26
ORIGINAL REsEARcH
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДк 578.824.11:578.53]:577.2.08
Лосич М.А.1'2, Зайкова О.Н.1'2, Непоклонова И.В.2, Гребенникова Т.В.13, Верховский О.А.2, Одноворов А.И.3, Алипер Т.Н.1'2
молекулярно-биологическая характеристика вакцинного
ШТАММА ERA-cB 20M ВИРУСА БЕШЕНСТВА
1Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России,123098, г. Москва; 2АНО «НИИ диагностики и профилактики болезней человека и животных», 123098, г. Москва; 3 ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов», 117198, г. Москва
В статье представлена молекулярная и биологическая характеристика вакцинного вируса бешенства штамм ERA-CB 20M, полученного российским рабиологом, доктором медицинский наук С.В. Грибенча путём адаптации и клонирования штамма ERA и SAD в перевиваемой культуре клеток BHK-21 с1з. Установлен спектр наиболее чувствительных к вирусу бешенства штамм ERA-CB 20M линий клеток, количественно определён уровень гликопротеина. Получена информация о первичной структуре фрагментов генома штамма ERA-CB 20M (гены N и G) и проведён филогенетический анализ. Методами молекулярного анализа установлено, что данный штамм попадает в группу вакцинных штаммов SAD1. При сравнении с рефе-ренсным штаммом SAD1 выявлено 10% нуклеотидных отличий во фрагменте гена N и 15% - во фрагменте гена G.
К л ю ч е в ы е с л о в а: бешенство; штамм ERA-CB 20M; секвенирование; гликопротеин вируса бешенства; титр вируса.
Для цитирования: Лосич М.А., Зайкова О.Н., Непоклонова И.В., Гребенникова Т.В., Верховский О.А., Одноворов А.И., Алипер Т.И. Молекулярно-биологическая характеристика вакцинного штамма ERA-CB 20M вируса бешенства. Вопросы вирусологии. 2018; 63(5): 224-232. DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2018-63-5-224-232
Losich M.A.12, Zaykova O.N.12, Nepoklonova I.V.2, Grebennikova T.V.13, Verkhovsky O.A.2,
Odnovorov A.I.3, Aliper T.I12 MOLECULAR AND BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF VACCINARY ERA-CB 20M
OF RABIES VIRUS
1 D.I. Ivanovsky Institute of Virology, «National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya», Moscow, 109428, Russian Federation;
2Diagnostic and Prevention Research Institute for Human and Animal Diseases, Moscow, 123098, Russian Federation; 3Peoples' Friendship University of Russia, Moscow, 117198, Russian Federation
The molecular and biological characteristics of the vaccine against rabies virus strain ERA-CB 20M obtained by the Russian rabiologist, doctor of medical sciences S.V. Gribencha by adapting and cloning the strain ERA and SAD in a transplantable BHK-21 C13 cell culture are presented. The spectrum of the most sensitive strain of rabies ERA-CB 20M cell lines was determined and the level of glycoprotein was quantitatively determined. Primary nucleotide sequences of fragments of the genome of the strain ERA-CB 20M (genes N and G) were obtained and phylogenetic analysis was carried out. Molecular analysis showed that this strain belongs to the group of vaccine strains SAD1. When compared with the reference strain SAD1, 10% of the nucleotide differences were revealed in the gene fragment N; 15%, in the gene fragment G.
K e y w o r d s: rabies; .strain ERA-CB 20M; .sequencing; rabies virus glycoprotein; virus titer.
For citation: Losich M.A., Zaykova O.N., Nepoklonova I.V., Grebennikova T.V., Verkhovsky O.A., Odnovorov A.I., Aliper T.I. Molecular and biological characteristics of vaccinary ERA-CB 20M of rabies virus. Voprosy Virusologii (Problems of Virology, Russian journal). 2018; 63(5): 224-232. (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2018-63-5-224-232 For correspondence: Milana A. Losich, Candidate of Biological Sciences, Researcher scientist, D.I. Ivanovsky Institute of Virology, «National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya», Moscow, 109428, Russian Federation. E-mail: [email protected] Information about authors:
Grebennikova T.V., http://orcid.org/0000-0002-6141-9361 Verkhovsky O.A., https://orcid.org/0000-0003-0784-9341
Acknowledgments.The publication was prepared with the support of the RUDN University Program 5-100. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 22 December 2017 Accepted 06 March 2018
Для корреспонденции: Лосич Милана Анатольевна, канд. биол. наук, научный сотрудник Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, г. Москва. E-mail:[email protected]
оригинальные исследования
Введение
Бешенство - это острое нейроинфекционное заболевание, возбудитель которого - вирус бешенства (ВБ) -передаётся со слюной больного животного через укус или при ослюнении повреждённых участков кожи. Вирус бешенства относится к порядку Mononegavirales, семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus, и единственный из известных представителей царства Virae поражает всех теплокровных животных, в том числе человека, в глобальном масштабе с летальностью 100% [1].
На сегодняшний день род Lyssavirus насчитывает 14 видов: вирус бешенства (ВБ, G1), Lagos bat lyssavirus (G2), Mokola lyssavirus (G3), Duvenhage lyssavirus (G4), European bat lyssavirus-1 (EBLV-1, G5), European bat lyssavirus-2 (EBLV-2, G6), Australian bat lyssavirus (G7), Aravan lyssavirus (G8), Khujand lyssavirus (G9), Irkut lyssavirus (G10), West Caucasian bat lyssavirus (G11), Shimoni bat lyssavirus (G12), Bokeloh bat lyssavirus (G13), Ikoma lyssavirus (G14), 1 неклассифицированный Lleida bat lyssavirus. Установлено, что 7 генотипов встречались у людей (Rabies, European, Irkut, Duvenhage, Australian, Mokola) [2].
По форме вирион ВБ пулеобразный, имеет длину в среднем 180 нм, диаметр - 75 нм и состоит из несегмен-тированного генома, представленного одной молекулой спиралеобразно скрученной негативной РНК и пятью структурными белками: нуклеопротеином (N), фосфо-протеином (P), матричным белком (М), гликопротеином (G) и РНК-зависимой РНК полимеразой или большим белком (L-large protein). Именно гликопротеин, образуя поверхностные пепломеры, участвует в проникновении вируса в клетку (прикрепление к клеточным рецепторам, слияние мембран и эндоцитоз), индуцирует образование вируснейтрализующих антител и клеточно-опосредованного иммунного ответа. Гликопротеин гликозилирован по N-связям, а также отвечает за гемаг-глютинирующую активность и определяет серотип вируса [3, 4].
В Российской Федерации и в мире проблема бешенства остаётся актуальной. За последние годы стабильно высокий уровень распространения рабической инфекции наблюдался в Центральном и Приволжском федеральных округах. Наибольшее число неблагополучных пунктов в 2016 г. зарегистрировано в Московской области (274). Всего за 2016 г. выявлен 2151 случай бешенства животных на территории РФ, большая часть заболевших - дикие и домашние плотоядные [5, 6].
На сегодняшний день нет гарантированного 100% лечения бешенства, и основным методом борьбы с распространением инфекции является вакцинопрофилак-тика. В настоящее время совершенно очевидно, что без углублённого знания природы возбудителя, включая детальное изучение молекулярной организации генома, невозможно создание высокоэффективных средств специфической профилактики.
ВБ штамм ERA-CB 20M был получен д-ром мед. наук, рабиологом Сергеем Васильевичем Грибенча из штамма ERA и SAD. Культуру клеток заражали вирусом ERA в дозах 50, 250, 1250, 6250 и 31250 LD50, затем через 5, 7, 10 и 13 дней определяли титр вируса в вируссодержащей жидкости путём внутримозгового заражения мышей, а также концентрацию гликопротеина методом твердофазного ИФА. В результате проведённых пассажей удалось получить популяцию вируса с относительно стабильной
высокой экспрессией гликопротеина от 500 до 2400 нг/ мл. Выделенный биологический вариант прошёл 20 последовательных пассажей в культуре клеток ВНК-21 и получил новое обозначение - ERA-CB 20M (С - селекция, В - вариант, 20 - 20 последовательных пассажей, M - Москва) [7, 8].
В работе исследованы молекулярные и биологические свойства вакцинного штамма ERA-CB 20M ВБ.
Материал и методы
Штаммы ВБ. В работе были использованы следующие штаммы ВБ: ERA-CB 20M, депонированный в государственной коллекции вирусов Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ «ВГНКИ»); референс-штаммы, предоставленные рефе-ренсной лабораторией OIE по бешенству ANSES (Нанси, Франция): вирус бешенства CVS-11 мозговой (challenge virus standard); СVS-11 (фиксированный культуральный штамм).
Культуры клеток. Культивирование вируса проводили в стационарном и роллерном монослое клеток ВНК-21 (почка сирийского хомячка), BSR (клон ВНК-21), Vero (почка зеленой мартышки) и ПС (почка сайги), ВНК-O (клон ВНК-21). Культуры клеток получали из лаборатории ANSES и лаборатории культур и тканей ФГБУ «НИ-ЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи». Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча.
Филогенетический анализ фрагментов генома штамма ERA-CB 20M
Выделение РНК. РНК выделяли с использованием коммерческого препарата TRI ® Reagent (« Sigma Aldrich») по методике производителя и ресуспендировали в 30-50 мкл деионизированной Н2О при 550С, периодически перемешивая пробы пипетированием.
Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-РЦР). Обратную транскрипцию и получение кДНК с использованием M-MLV reverse transcriptase («Fermentas») проводили согласно инструкции производителя с использованием 5 мкл РНК. Реакционная смесь для ПЦР содержала: 16 мМ TrisHCl; 50 мМ KCl; 1,5 мМ MgCl2; 1% Triton x-100; по 10 пМ каждого праймера; 2,5 мМ dNTPs; 2 ед. TAQ-полимеразы. В реакционную смесь вносили 5 мкл кДНК. Нуклеотидные последовательности праймеров для ПЦР и секвениро-вания участка гена N были взяты из работы Р. Heaton и соавт. [9]: JW12 (5'-ATGTAACACCYCTACAATG-3'), JW6 (DPL) (5'- CAATTCGCACACATTTTGTG-3'), JW6 (E) (5'-CAGTTGGCACACATCTTGTG-3'), JW6 (M) (5'-CAGTTAGCGCACATCTTATG-3'), JW10 (DLE2) (5'-GTCATCAAAGTGTGRTGCTC-3'), JW10 (ME1) (5'-GTCATCAATGTGTGRTGTTC-3'), JW10 (P) (5'-GTCATTAGAGTATGGTGTTC-3').
Подбор праймеров для секвенирования гена G осуществлялся нами самостоятельно с использованием программного обеспечения Primer Premier 5 («Premier Biosoft») [10]. Праймеры приведены в табл. 1.
Очистка образцов из геля и секвенирование. Образцы очищали из агарозного геля с помощью набора Silica Bead DNA Gel Extraction Kit («Fermentas») согласно инструкции производителя и секвенировали. Реакцию проводили на амплификаторе Mastercycler Gradient («Eppendorf») с применением BigDye® Terminator v. 3.1 Ready Reaction Kit («Applied Biosystems»), затем продукты амплификации переосаждали для последующего
problems of virology. 2018; 63(5)
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2018-63-5-224-232 ORIGINAL REsEARcH
Таблица 1
Олигонуклеотиды (праймеры) для ОТ-ПЦР и секвенирования фрагмента гена G ВБ
Название праймера
Праймеры
F1 F2 R1 R2
CTGCATTTCATCAAAGTCAA AGCGGTGTCTTCTACCTACT TCTACAACAAGGTGCTCAAT GGAGGACTATTGAACCCA
секвенирования с использованием автоматического сек-венатора Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer.
Построение филогенетических дендрограмм и выявление геномных отличий. Для выравнивания нуклеотид-ных последовательностей применяли пакет программ DNASTAR v. 3.12 («Lasergen Inc.», США) и программы Bio Edit 7.0.1. В табл. 2 приведены названия штаммов, использованных для сравнения, и их номера доступа в GenBank.
Результаты
Определение спектра наиболее чувствительной линии клеток для получения вакцинного ВБ штамм ERA-CB 20М
Для определения чувствительности клеток к вакцинному вирусу штамм ERA-CB 20М провели серию опытов для наработки культурального вируссодержащего материала. Для решения этой задачи были выбраны 6 линий клеток BHK-21-13C, ВНК-ф, BSR, ПС, Vero, любезно предоставленных лабораторией культур и тканей ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи». Клеточный монослой отобранных линий клеток заражали ВБ штамм ERA-CB 20М с активностью не менее 1050-55 lg ТЦД 50/ мл Титр ВБ в каждой линии клеток определяли по методу Рида и Менча.
Наиболее интенсивная репродукция ВБ штамм ERA-CB 20М была определена при заражении линии клеток ПС на уровне 3—4-го сбора (пула), и титр вируса соста-
Таблица 2 Штаммы ВБ, используемые для сравнения [11]
Штамм ВБ
Номер доступа
SAD1 variant 1 SAD1 variant 2 CVS-11 RV-97
SAD Bern (Sanafox) SAD Bern (Lysvulpen) SAD B19 (Fuchsoral) SAD P5/88 (Rabifox) ERA
SAD Vnukovo isolate 9503TCH
4aGV7
CTN-1V5
PV-2061-2
EF206717 EF206718 GQ918139 EF542830 EF206720 EF206708 EF206709 EF206715 EF206707 GU992319 JN234414 JN234418 JN234424
ra
u ^
a
a
I-
BSR BHK-21 BHK-Щ BHK-ф Vero Линии клеток
■ 1-й сбор □ 2-й сбор □ 3-й сбор ■ 4-й сбор □ 5-й сбор
Рис. 1. Зависимость репродукции вакцинного ВБ штамм ERA-CB 20М от линии клеток.
вил 7,5 ± 0,15 lg ТЦД 50/мл, а также линии клеток BSR на уровне 1—2-го сбора (пула) (титр вируса 6,5 ± 0,26 lg ТЦД 50/мл) и третьей линии клеток ВНК-21-13С -на уровне 3-го сбора (пула), где титр вируса составил 6,0 ± 0,15 lg ТЦД 50/мл (рис. 1).
Исходя из полученных данных был сделан вывод о том, что перевиваемые линии клеток ПС, BSR и ВНК-21-13С являются наиболее чувствительными к ВБ штамм ERA-CB 20М, в культуральной жидкости которых происходит максимальное накопление вируса.
Количественное определение гликопротеина ВБ
Поскольку G-белок является основным иммуногеном вакцинного ВБ, следующим этапом исследований было количественное определение гликопротеина при культивировании вакцинного ВБ методом ИФА (Институт полиомиелита им. Чумакова, Москва) на следующих линиях клеток: ВНК-О, BHK-Ф, BHK-21 BSR, ПС (рис. 2).
Количественный анализ уровня экспрессии G-белка в линиях клеток, заражённых ВБ штамм ERA-СВ 20М, показал, что наиболее высокий уровень гликопротеина наблюдается в следующих клеточных линиях: BSR (в количестве 285 нг/мл, 1-й пассаж, 1-й сбор), затем ВНК-21 (275 нг/мл, 1-й пассаж,1-й сбор), ВНК-О (270 нг/мл, 1-й пассаж, 1-й сбор).
Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генома штамма ERA-CB 20М ВБ
Проведён филогенетический анализ вакцинного ВБ штамм ERA-CB 20М. Определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов, кодирующих нуклео- и гликопротеин. Полученные данные о первичных последовательностях генома исследуемого штамма сравнивали с данными о первичной последовательности генома штамма Щёлково-51, а также с последовательностями других вакцинных штаммов ВБ из базы данных NCBI.
Было выполнено множественное выравнивание полученных фрагментов генов N и G по наиболее старому из доступных сиквенсов штаммов вируса бешенства -SAD1, зарегистрированному в двух вариантах. Во фрагменте гена, кодирующего N-белок, были обнаружены в основном однонуклеотидные замены (61-я позиция). Также обнаружены двунуклеотидные и трёхнуклеотид-ные замены. При этом выявлено всего 11 аминокислот-
8
7
6
5
4
3
2
0
оригинальные исследования
►»н Уровень гликопротеина 112 2 3 СЛ О СЛ О СЛ О О О О О О О О — —
/Л* —■— — к
\ Ч
// \ \ К
J \ £ *
1-й сбор 2-й сбор 3-й сбор 4-й сбор 5-й сбор 6-й сбор
^ 1-й пассаж 270 265 260 230 115 30
2-й пассаж 20 180 180 200 175 0
—Д— 3-й пассаж 65 220 0 0 0 0
а Уровень гликопротеина 112 2 3 СЛ О СЛ О СЛ О О О О О О О О
/ \
А /
d \
1-й сбор 2-й сбор 3-й сбор 4-й сбор 5-й сбор 6-й сбор
^ 1-й пассаж 275 260 220 90 135 75
2-й пассаж 60 200 190 190 0 0
—Д— 3-й пассаж 30 200 230 0 0 0
а Уровень гликопротеина 112 2 3 СЛ О СЛ О СЛ О О О О О О О О
Р—
/ / ч
^ -»-А А Д
1-й сбор 2-й сбор 3-й сбор 4-й сбор 5-й сбор 6-й сбор
^ 1-й пассаж 240 200 100 45 65 45
2-й пассаж 10 120 120 130 0 0
—А— 3-й пассаж 10 30 0 0 0 0
►»н Уровень гликопротеина 112 2 3 СЛ О СЛ О СЛ О О О О О О О О «t
\ к
у А
А v
К \\ \
\. \
1-й сбор 2-й сбор 3-й сбор 4-й сбор 5-й сбор 6-й сбор
^ 1-й пассаж 265 105 0 0 0 0
2-й пассаж 190 0 0 0 0 0
—А— 3-й пассаж 80 210 0 0 0 0
Уровень гликопротеина 112 2 3 СЛ О СЛ О СЛ О О О О О О О О \
\
/
J
1-й сбор 2-й сбор 3-й сбор 4-й сбор 5-й сбор 6-й сбор
^ 1-й пассаж 285 120 45 25 30 20
2-й пассаж 20 190
—А— 3-й пассаж 120 220
а Уровень гликопротеина 112 2 3 СЛ О СЛ О СЛ О О О О О О О О
-■- -В—_
1-й сбор 2-й сбор 3-й сбор 4-й сбор 5-й сбор 6-й сбор
^ 1-й пассаж 205 265 255 225 235 170
2-й пассаж 150 200 190 200 175 0
—А— 3-й пассаж 120 220 250 230 210 0
Рис. 2. Зависимость уровня гликопротеина ВБ штамм ЕКА-СВ 20М в культуре клеток от пассажа/сбора (в нг/мл): I -
II - ВНК-21; III - ВНК-ф; IV - BSR;V - ПС.
ВНК-О;
ных замен (рис. 3). Для исследования был взят фрагмент размером 601 нуклеотид. Сравнение выявило наибольшее количество замен по отношению к SAD1 вариант 1 в штаммах СУЗ-11, ЯУ-97 и Щёлково.
При сравнении первичной нуклеотидной последовательности гена G вышеуказанных штаммов рассматривался участок размером 1572 нуклеотида. Всего было выявлено 250 позиций с нуклеотидными заменами, которые привели к появлению 87 позиций с заменами аминокислот. Как и в случае с участком гена N, абсолютное большинство замен в гене G (по сравнению с SAD1) содержали штаммы СУЗ-11 и ЯУ-97. В гене штамма ЕЯА-СВ 20М было обнаружено 5 нуклеотидных замен, все
они привели к появлению замен аминокислот (рис. 4).
Выровненные последовательности геномов вакцинных штаммов вируса ВБ были использованы для построения филогенетической дендрограммы с применением программы Mega Align из пакета программного обеспечения Lasergene фирмы DNA-Star (Clustal W Method). Полученные филогенетические дендрограммы представлены на рис. 5 и 6.
Сравнение с референсным штаммом SAD1 выявило 10% нуклеотидных отличий во фрагменте гена N и 1 замену в последовательности аминокислот нуклеопротеи-на (в позиции 95 аминокислота лейцин вместо валина) и 15% нуклеотидных отличий - во фрагменте гена G.
original research
'EF2 0 6717_SAD1_Var1_N.seq' 'EF2 0 6718_SAD1_Var2_N.seq' 'CB_20M_N_gene_(1)_part.seq'
'CVS_11_N.seq'
'ERA_N.seq'
'RV_97_N.seq'
'SAD_B19_N.seq'
'SAD_BERN_Lysvulpen_N.seq'
'SAD_BERN_N.seq'
'SAD_P5_8 8_N.seq'
'SAD_Vnukovo_isolate_9503TCH_n
'Shelkovo_N_gene_(2)_part.seq'
10 20 30 40 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... |
MDADKIVFKVNNQVVSLKPEIIVDQHEYKYPAIKDLKKPCITLGKAPDLN
Y
T...................... Y
....................... Y
....................... Y
....................... Y
....................... Y
60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... |
'EF2 0 6717_SAD1_Var1_N.seq' KAYKSVLSGMSAAKLDPDDVCSYLAAAMQFFEGTCPEDWTSYGIVIARKG
'EF2 0 6718_SAD1_Var2_N.seq' ..................................................
'CB_20M_N_gene_(1)_part.seq' ............................................L.....
'CVS_11_N.seq' ..........N.................................L.....
'ERA_N.seq' ..................................................
'RV_97_N.seq' ..........N.................................L.....
'SAD_B19_N.seq' ...............N..................................
'SAD_BERN_Lysvulpen_N.seq' ..................................................
'SAD_BERN_N.seq' ..................................................
'SAD_P5_8 8_N.seq' ..................................................
'SAD_Vnukovo_isolate_9503TCH_n ............................................L.....
'Shelkovo_N_gene_(2)_part.seq' ..........N.................................L.....
'EF2 0 6717_SAD1_Var1_N.seq' 'EF2 0 6718_SAD1_Var2_N.seq' 'CB_20M_N_gene_(1)_part.seq'
'CVS_11_N.seq'
'ERA_N.seq'
'RV_97_N.seq'
'SAD_B19_N.seq'
'SAD_BERN_Lysvulpen_N.seq'
'SAD_BERN_N.seq'
'SAD_P5_8 8_N.seq'
'SAD_Vnukovo_isolate_9503TCH_n
'Shelkovo_N_gene_(2)_part.seq'
110 120 130 140 150
DKITPGSLVEIKRTDVEGNWALTGGMELTRDPTVPEHASLVGLLLSLYRL
.R.
N
N
'EF2 0 6717_SAD1_Var1_N.seq' 'EF2 0 6718_SAD1_Var2_N.seq' 'CB_20M_N_gene_(1)_part.seq'
'CVS_11_N.seq'
'ERA_N.seq'
'RV_97_N.seq'
'SAD_B19_N.seq'
'SAD_BERN_Lysvulpen_N.seq'
'SAD_BERN_N.seq'
'SAD_P5_8 8_N.seq'
'SAD_Vnukovo_isolate_9503TCH_n
'Shelkovo_N_gene_(2)_part.seq'
160 170 180 190 200
SKISGQNTGNYKTNIADRIEQIFETAPFVKIVEHHTLMTTHKMCANWSTI
V...... I
R R
V...... I
Рис. 3. Сравнение аминокислотных последовательностей фрагмента белка N штамма БКЛ-СВ 20М с последовательностями рефе-
ренсных штаммов, представленных в NCBI.
Исследуемый участок предсказанных аминокислотных последовательностей гликопротерина содержал 525 аминокислот, при сравнении выявлено 0,95% различий в последовательности аминокислот, 5 замен в позициях 148 (вместо аргинина серин), 169 (вместо аспарагиновой кислоты валин), 215 (вместо метионина лизин), 455 (вместо валина аланин), 502 (вместо лейцина фенилаланин).
Обсуждение
Создание высокоэффективных средств специфической профилактики невозможно без углубленного знания природы возбудителя, включая детальное изучение молекулярной организации генома. На рис. 7 представлены штаммы ВБ, применяемые для изготовления анти-рабических вакцин.
оригинальные исследования
'SAD_1_var_1-G.seq'
'SAD_1_var_2 —G.seq'
' ERA_CB_2 0M_G . seq '
'4 aGV7 .seq' 'CTN—1V5.seq'
'CVS_GQ 918 13 9 — G. seq'
'ERA_G.seq' ' PV—2 061 — 2 . seq'
'RV— 9 7_G.seq'
'SAD_B19_complete_G.s
'SAD_Bern_Lysvulpen—C
* SAD_Bern (sanafox) .se
'SAD P 5 88—G.seq'
10 20 30 40 50
~MVPQAL LFVPLLVFPLCFGKFPIYTIPDKLGPWS PIDIHHL
NIPQKTQGK................
NIPQKT*GK.......L. . . .G.S.
.L..G.S.
NIPQKTQGK.
' SAD_1_va r_1—G.seq'
'SAD_1_var_2—G.seq'
'ERA_CB_20M_G.seq'
'4aGV7.seq' 'CTN—1V5.seq'
'CVS_GQ 918139 — G. seq'
'ERA_G.seq' ' PV—2 061—2 .seq' 'RV— 9 7_G.seq'
'S AD_B19_complete_G. sec
'SAD_Bern_Lysvulpen—G.s
* SAD_Bern (sanafox) .seq
'SAD P 5 88—G.seq'
60 70 80 90 100
SC PNNLVVEDE GCTNLSGFS YMELKVGYISAIKMNGFTCTGVVTEAETY?
'SAD_1_var_1—G.seq'
' SAD_1_var_2 —G.seq'
' ERA_CB_2 0M_G . seq'
'4aGV7.seq' 'CTN—1V5.seq'
'CVS_G Q918139 — G. seq'
'E RA_G.seq' 'PV—2 061 — 2 . seq' 'RV— 9 7_G. seq'
'SAD_B19_complete_G.seq'
'SAD_Bern_Lysvulpen—G.seq'
' SAD_Bern (sanafox) .seq'
' SAD_P 5_88—G.seq'
'SAD_1_var_1—G.seq'
' SAD_1_var_2 —G.seq'
' ERA_CB_2 0M_G . seq '
'4aGV7.seq' 'CTN—1V5.seq'
'CVS_GQ 918139 — G. seq'
'E RA_G.seq' 'PV—2 061 — 2 . seq'
'RV— 9 7_G.seq'
'SAD_B19_complete_G.s
'SAD_Bern_Lysvulpen—G
' SAD_Bern (sanafox) .se
'SAD P 5 88—G.seq'
NFVGYVT TT FKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYRWL
160 170 180 190 200
RTVKTTKE S LVIISP SVADLDPYDRS L HSRVFPS GKC S GVAVS STYCSTN
.IT.P.V. .IT.--A.
.IT.....
'SAD_1_var_1—G.seq'
' SAD_1_var_2 —G.seq'
' ERA_CB_2 0M_G . seq'
'4aGV7.seq' 'CTN—1V5.seq'
'CVS_GQ918139—G.seq'
'E RA_G.seq' ' PV—2 061 — 2 . seq'
'RV— 9 7_G.seq'
' SAD_B19_c omplete_G. s
'SAD_Bern_Lysvulpen—G
'SAD_Bern(sanafox).se
'SAD P 5 88—G.seq'
210 220 230 240 250
HDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYK S LKGA
. PRTP.............N. NK .
' SAD_1_va r_1—G.seq'
'SAD_1_var_2—G.seq'
'ERA_CB_2 0M_G.seq'
'4aGV7.seq' 'CTN—1V5.seq'
'CVS_GQ 918139 — G. seq'
'ERA G.seq'
' PV—2 0 61
'RV— 9 7_G
' SAD_B19_c ompl
' SAD_B e
'SAD_Be
'SAD P 5
q
n_Lysvulpen— n(sanafox).s 8 8—G.seq'
260 270 280 290 300
CKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQT SNE TKWC PPDQLVNLHDFRS DEIEHLV
'SAD_1_var_1—G.seq'
' SAD_1_va r_2—G.seq'
'ERA_CB_2 0M_G.seq'
'4aGV7.seq' 'CTN—1V5.seq'
'CVS_GQ 918139 — G. seq'
'ERA_G.seq' ' PV—2 061 — 2 . seq' 'RV— 9 7_G.seq'
'SAD_B19_complete_G.seq
'SAD_Bern_Lysvulpen—G.s
'SAD_Bern(sanafox).seq'
'SAD P 5 88—G.seq'
310 320 330 340 350
VEELVRKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTL
q
q
q
q
q
Рис. 4. Сравнение аминокислотных последовательностей фрагмента белка G штамма ERA-CB 20M с по следовательностями референсных штаммов, представленных в NCBI.
Продолжение рис. 4 см. на стр. 230
problems of virology. 2018; 63(5)
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-20 1 8-63-5-224-232 ORIGINAL RESEARCH
360 370 380 390 400
'SAD_1_var_1-G.seq' MEADAHYKSVRTWNEILPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVL
'SAD_1_var_2-G.seq' ..................................................
'ERA_CB_20M_G.seq' ..................................................
' 4aGV7 . seq ' ...E............I............Y.................H..
' C TN -1V5 .seq' ................I..............................H..
' CVS_GQ9 1 8139-G.seq' ................I......K......................DH . .
'ERA_G.seq' ..................................................
' PV- 2061-2 . seq' ................I.................................
' RV- 9 7_G .seq' ...E............V........E.....................H..
'SAD_B19_complete_G.seq' ..................................................
'SAD_Bern_Lysvulpen-G.seq' ..................................................
* SAD_Bern (sanafox) .seq' ..................................................
' SAD_P 5_88-G.seq' ..................................................
'SAD_1_var_1-G.seq'
'SAD_1_var_2-G.seq'
'ERA_CB_20M_G.seq'
'4 aGV7 .seq' 'CTN-1V5.seq'
'CVS_GQ 918 13 9-G. seq'
'ERA_G.seq' ' PV-2 061-2. seq'
'RV-9 7_G.seq'
'SAD_B19_complete_G.s
'SAD_Bern_Lysvulpen-C
*S AD_B ern (sanafox) .s€
'SAD P 5 88-G.seq'
410 420 430 440 450
IPEMQ S SLLQQHMELLE SSVIPLMHPLADPSTVFKDGDEAEDFVEVHLPD
q
'SAD_1_var_1-G.seq'
' SAD_1_va r_2-G.seq'
'ERA_CB_2 0M_G. seq'
'4aGV7.seq' 'CTN-1V5.seq'
'CVS_GQ918139-G.seq'
'ERA_G.seq'
'PV-2061-2.seq' 'RV-9 7_G.seq'
'SAD_B19_complete_G.seq'
'S AD_B e r n_L y s vulpen-G. seq
* SAD_Be rn (sanafox) .seq'
'SAD_P 5_88-G. seq'
460 470 480 490 500
VHKQVSGVDLGL PNWGKYVL L SAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSE PTQH
...A.............................................
.E.............E.......T.I........I...K..D.P.S..R
................D.. MG ..V......M.........T..A.SI..
Y..I...............MT . . .MIG.V. .FS. - - W. . .A. .P.SK.R
.N...............................................
. ERI.................................W...........
..K..E.........E.......T.I.........I.R.....P.S. .R
.N...............................................
.N...............................................
.N...............................................
.N...............................................
'SAD_1_var_1-G.seq'
'SAD_1_var_2-G.seq'
' ERA_CB_2 0M_G . seq '
'4 aGV7 .seq' ' CTN-1V5 .seq'
'CVS_GQ 918139-G. seq'
'ERA_G.seq' ' PV-2 061-2 . seq' 'RV-9 7_G.seq'
'SAD_B19_complete_G.seq'
'SAD_Bern_Lysvulpen-G.seq'
* SAD_Bern (sanafox) .seq'
' SAD_P 5_8 8-G.seq'
510 520 530 540 550
NLRGTGREVSVTPQS GKIISSWESYKSGGETRL*~~~~~~~~~~~~~~~~ .F...............................
S......N. . . .S. . . .F.P...........G.* RLVI L STLQVLKITSP
S . GE ...K....S ... RV.............
SFG...GN....S....V.P.....R....I.
S.... EMK.........FK . .
. ... .G.*E LAVL STIQVLKIP SP ..D.A.
Рис. 4. Продожение со стр. 229.
100.0
46.3 NA
63.8
J5]
5(L8
85.2 EF206718 SAD1 Var2_N_part.seq SAD B19_N_part.seq SAD BERN _N_part.seq SAD BERN Lysvulpen_N_part.seq SAD P5 88_N_part.seq SAD Vnukovo isolate 9503TCH _N gene lERA-CB 20M N gene.seq Г
4.3
46.Pi EF206717 SAD1 Var1_N_part.seq ERA_N_part.seq
100.01- RV 97_N_part.seq
Shelkovo N gene (2) part.seq - CVS 11_N_part.seq
Nucleotide Substitutions (хЮО) Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
0
4
2
Рис. 5. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе фрагментов гена N вакцинных штаммов ВБ.
С.В. Грибенчей впервые было показано, что популяция штаммов уличного ВБ гетерогенна по составу биологических вариантов, а также установлена возможность выделения биологических вариантов из популяции вируса. Использование нового принципа селекции позволило выделить 16 биологических вариантов, которые прошли
более 20 последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток ВНК-21-13С. Выделенные биологические варианты отличались от родительского вируса штамм ERA более выраженными антигенными свойствами и были обозначены как варианты вируса штамм ERA-CB 20М [7].
оригинальные исследования
N/. 96.4~.
97 66.4
97.S
59.6
100.0
79
71.
6.8_
85.4" SAD Bern Sanafox G protein.seq 5°;J- SAD P5 88 G protein.seq
SAD B19 G proteinl EF206709.seq SAD Bern G protein.seq ERA G protein.seq EF206717 SAD1 Var1 G protein.seq EF206718 SAD1 Var2 G protein.seq ERA-CB 20M G.seq~| PV-2061-2 G Segment.seq CTN-1V5 G segment.seq RV-97 glycoprotein.seq 4aGV7 G segment.seq CVS11 G protein GQ918139.seq
4 2
Amino Acid Substitutions (x100) Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
0
II
100.
69
99.5t
99.!
9.4_
I SAD B19 complete G.seq ^SAD P5 88-G.seq 3SAD Bern(sanafox).seq SAD Bern Lysvulpen-G.seq ERA G.seq 2SAD 1 var 1-G.seq SAD 1 var2-G.seq - ERA-CB 20M G.seq | PV-2061-2.seq 4aGV7.seq RV-97 G.seq CVS GQ918139-G.seq CTN-1 V5.seq
6 4 2
Nucleotide Substitutions (x100) Bootstrap Trials = 1000, seed = 111
0
Рис. 6. Филогенетическая дендрограмма вакцинных штаммов ВБ, построенная с использованием аминокислотных последовательностей (I) гликопротеина от начала открытой рамки считывания до позиции 524 (MegAlign v. 7.0., метод Clustal W), и
фрагментов гена G (II).
Paster
(1882 г., Франция, выделен от коровы, заражённой бешеной собакой)
Десятки пассажей на кроликах, мышах
Пассажи на культуре клеток
SAD
(Street Alabama Dufferin, 1935 г., США, выделен от собаки)
10 пассажей на первичных культурах клеток почки хомяков
VRG
i или свиньи
ERA
CVS-27 CVS-11
(Evelyn, Rokitnicki, Abelseth)
Пассажи на культуре
PM PV-12
клеток BH
SAD-Bern
Щёлково-51
SAD-B19 SAG
Рис. 7. Штаммы ВБ, применяемые для изготовления антирабических вакцин.
Биологические варианты вируса штамм ERA-CB 20М, как и родительский штамм ERA, размножались без цитопатического действия в перевиваемой культуре клеток ВНК-21-13С и накапливались в головном мозге
молодых мышей в титре до 8,0 ± 0,5 lg L^/мл [7].
Ранее было установлено, что вакцинный вирус штамм ERA-CB 20М обладает выраженными антигенными свойствами: в опытах на лабораторных, домашних и диких животных индуцирует выработку вируснейтрали-зующих антител в титрах, значительно превосходящих защитный пороговый уровень антител (> 0,50 МЕ/мл). Так, у мышей (n = 50) средний титр вирус-нейтрализующих антител варьирует от 1,50 до 2,87 МЕ/мл; у белых крыс (n = 30) средний титр антител варьирует от 0,87 до 2,1 МЕ/мл; у песцов (n = 30) средний титр антител составил 2,87 МЕ/мл; у кошек (n = 20) средний титр антител составил 6,01 МЕ/мл, у собак (n = 20) - 3,46 МЕ/мл [7, 8, 12].
При изучении патогенности вакцинного вируса штамм ERA-CB 20М установили, что данный штамм является патогенным при интрацеребраль-ном заражении мышей, слабопатогенным при применении периферических методов заражения белых крыс и морских свинок и непатогенным при применении периферических методов заражения кроликов, собак, кошек и песцов [7, 8].
B ходе предыдущих исследований было установлено, что вакцинный штамм ERA-CB 20М является высо-коиммуногенным и индуцирует формирование напряжённого (не менее 1,0 МЕ/мл), стабильного антирабиче-ского иммунитета при определении методом NIH (рекомендованного КЭБ ВОЗ) на белых беспородных мышах. Обеспечивает защиту после внутри-мозгового заражения рефференс-штаммом CVS-11 (мозговой) в опытах на белых мышах (иммуногенность составляла от 1,50 до 2,2 МЕ/мл) и сохраняет свои иммуногенные свойства на протяжении 12 мес. [7, 8].
К ВБ чувствителен целый ряд перевиваемых культур клеток, например Vero, ПС, BHK и ее клоны (BSR и другие). Результаты, полученные в ходе экспериментов, говорят о том, что культуры клеток существенно различаются по чувствительности к штамму ВБ ERA-CB 20М. Несмотря на то что линии клеток BHK-O, BHK-21 и BSR имеют общий источник происхождения - линию клеток почки золотистого хомячка, они существенно отличаются друг от друга, во-первых, по морфологии и, во-вторых, по выходу вирусного гликопротеина после заражения. Необходимо отметить, что наименьший уровень выхода белка наблюдался при использовании линии клеток Vero. Однако учитывая различия по данному параметру между клонами BHK, можно допустить суще-
Flury
(1939 г., США, выделен от женщины, укушенной собакой)
136 пассажей на 1-дневных цыплятах
40—50 пассажей на куриных эмбрионах: LEP
I
220—227 пассажей на куриных эмбрионах: HEP
Kelev
( 1950 г., Израиль, выделен от собаки)
I
70 пассажей на куриных эмбрионах
I
6
0
8
problems of virology. 2018; 63(5)
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2018-63-5-224-232 ORIGINAL RESEARCH
ствование и клонов Vero, более чувствительных к ВБ. В частности, антиген вакцины против бешенства на основе штамма Пастер получают именно на клетках Vero.
Раннее мы предполагали, что накопление вируса и уровень гликопротеина коррелируют между собой. Однако полученные результаты демонстрируют более сложную картину. Поскольку в предыдущих исследованиях была установлена исключительно важная корреляционная связь между уровнем патогенности (или апатогенности) и уровнем экспрессии G-белка на модели уличного бешенства и модели вакцинных штаммов (ERA и ERA-CB 20M) [7, 8], для характеристики накопления вакцинного штамма предлагается использовать именно уровень экспрессии гликопротеина.
Одним из важных этапов изучения свойств штамма ERA-CB 20M был молекулярно-генетический анализ фрагментов его генома в сравнении с другими вакцинными штаммами, используемыми в производстве различных антирабических вакцин. Так, ранее А. Метлин и соавт. [13] исследовали российский вакцинный штамм RV-97. Было установлено, что данный штамм образует отдельную филогенетическую ветвь на дендрограмме, имеет уникальные замены и не ревертирует к полевым изолятам.
Филогенетический анализ фрагментов генов N и G вакцинного ВБ штамм ERA-CB 20M показал, что данный штамм попадает в группу вакцинных штаммов SAD1. Сравнение с референсным штаммом SAD1 показало только 1 аминокислотную замену в последовательности аминокислот нуклеопротеина (в позиции 95 аминокислота лейцин вместо валина) и на участке гли-копротеина (525 аминокислот); при сравнении выявлено 0,95% различий. Необходимо отметить, что на заданном участке гена N штамм ERA-CB 20M полностью соответствует штамму SAD Vnukovo isolate 9503TCH. По-видимому, это связано с тем, что штамм Внуково, как и штаммы SAD Bern, SAD B19 и SAG, а также штамм ERA-CB 20M берут своё начало от штамма ERA. Как известно, ген ВБ достаточно консервативен, в особенности в пределах одного генотипа.
Финансирование. Публикация подготовлена при поддержке Программы «5-100».
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 2, 3, 9, 10, 13 см. REFERENcES)
1. Львов Д.К., ред. Руководство по вирусологии: Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. М.: МИА; 2013.
4. Васильев Д.А., Луговцев В. Ю., ред. Курс лекций по вирусологии. Часть вторая. Вирусы, вызывающие болезни общие для многих видов сельскохозяйственных животных. Ульяновск; 2004
5. Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору. Available at: http://www.fsvps.ru
6. Всемирная организация здравоохранения. Available at: http:// www.who.int/ru
7. Грибенча С.В., Лосич М.А., Грибенча Л.Ф., Непоклонова И.В. Новый принцип селекции вакцинного вируса на основе количественного уровня экспрессии G-белка- главного иммуногена вируса бешенства. Вопросы вирусологии. 2012; 57(2): 44-7.
8. Грибенча С.В., Алипер Т.И., Непоклонова И.В. Происхождение и характеристика вакцинного вируса бешенства штамм ERA-CB-20M. В кн.: Труды и материалыXIIМеждународного ветеринарного конгресса. Москва, Измайлово; 2002.
11. Национальный центр биотехнологической информации. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
12. Лосич М.А., Непоклонова И.В., Верховский О.А., Грибенча С.В., Мухин А.Н., Раев С.А. и др. Иммунобиологические свойства новой вакцины РАБИКС. Ветеринария. 2011; (12): 17-21.
REFERENCES
1. L'vov D.K., ed. Guidelines for Virology: Viruses and Viral Infections of Humans and Animals [Rukovodstvo po virusologii: Virusy i virusnye infektsii cheloveka i zhivotnykh]. Moscow: MIA; 2013. (in Russian)
2. International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV. Available at: http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp
3. Cox J.H., Dietzschold B., Schneider L.G. Rabies Virus Glycoprotein II. Biological and Serological Characterisation. Infect. Immun. 1977; 16(3): 754-9.
4. Vasil'ev D.A., Lugovtsev V.Yu., eds. Course of Lectures on Virology. Part II. The Virus Causes Disease Common to Many Species of Animals [Kurs lektsiy po virusologii. Chast' vtoraya. Virusy vyzyvayushchie bolezni obshchie dlya mnogikh vidov sel'skokhozyaystvennykh zhivotnykh]. Ul'yanovsk; 2004. (in Russian)
5. The Federal Service for Veterinary and Phytosanitary Surveillance. Available at: http://www.fsvps.ru (in Russian)
6. World Health Organization. Available at: http://www.who.int/
7. Gribencha S.V., Losich M.A., Gribencha L.F., Nepoklonova I.V. A new principle of vaccine virus selection based on the quantitative expression level of G-protein, the main immunogen of the rabies virus. Voprosy virusologii. 2012; 57(2): 44-7. (in Russian)
8. Gribencha S.V., Aliper T.I., Nepoklonova I.V. Origin and characteristics of vaccine rabies virus strain ERA-CB-20M. In: Proceedings and Materials of XII Veterinary Congress [Trudy i materialyXIIMezhdunarodnogo veterinarnogo kongressa]. Moscow, Izmaylovo; 2002. (in Russian)
9. Heaton Pr., Johnstone P., Mcelhinney L.M., Cowley R., O'sullivan E., Whitby J. Heminested PCR assay for detection of six genotypes of rabies and rabies-related viruses. J. Clin. Microbiol. 1997; 35(11): 2762-6.
10. PREMIER Biosoft. Available at: http://www.premierbiosoft.com/
11. National Center for Biotechnology Information. Available at: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/ (in Russian)
12. Losich M.A., Nepoklonova I.V., Verkhovskiy O.A., Gribencha S.V., Mukhin A.N., Raev S.A. Immunobiological properties of the new vaccine RABIX. Veterinariya. 2011; (12): 17-21. (in Russian)
13. Metlin A., Paulin L., Suomalainen S., Neuvonen E., Rybakov S., Mikhalishin V., et al. Characterization of Russian rabies virus vaccine strain RV-97. Virus Res. 2008; 132(1-2): 242-7.
Поступила 22.12.17 Принята в печать 06.03.18
