CC BY
111
TooTTr^Z^ZTi Оригинальные статьи
© 2002, СПб РО РААКИ
ОПОСРЕДОВАННАЯ ИММУНОКОРРЕКЦИЯ ПОЛИОКСИДОНИЕМ ЧЕРЕЗ ГРУДНОЕ МОЛОКО
Ризопулу А.П., Гариб Ф.Ю.*, Арипова Т.У.
Институт Иммунологии АН РУз,
* НИИ вакцин и сывороток ГАК «Узфармпрома», Ташкент, Узбекистан
Резюме. Работа посвящена изучению опосредованного влияния через грудное молоко полиоксидония, введенного лактирующим самкам, на становление иммунореактивности у крыс-сосунков в период раннего постнаталь-ного онтогенеза. Показан биостимулирующий эффект полиоксидония, который проявился в увеличении массы тела, массы печени, селезенки и тимуса через 6 недель от начала эксперимента. Выявлено иммуностимулирующее действие полиоксидония - достоверно возрастало число лимфоцитов, экспрессирующих CD3, CD4, CD8 и CD 16, усиливалась активность антителогенеза на тимусзависимый антиген. Опосредованная иммунокоррекция Полиоксидонием способствует устранению физиологического дисбактериоза у крыс-сосунков.
Ключевые слова: полиоксидоний, постнаталъный период, лактация, опосредованная иммунокоррекция.
Rizopulu А.Р, Garib F.YU., Aripova T.U.
MEDIATE IMMUNOCORRECTION WITH POLYOXIDONIUM THROUGH BREAST MILK
The study was devoted to studying the mediate influence of Polyoxidonium through the breast milk introduced to lactating females on immunoreactivity development in suckling young rats during early postnatal ontogenesis. The biostimulating effect of Polyoxidonium was observed in 6 weeks after the beginning of the experiment. It manifested itself by increasing body-weight, size of the liver, spleen and thymus. The immunostimulating effect of Polyoxidonium was revealed : the number of lymphocytes expressing CD3, CD4, CD8 and CD 16, significantly increased the activity antibodygenesis to thymusdependent antigen was enhanced. The mediate immunocorrection with Polyoxidonium contributes to the elimination of physiologic disbacteriosis in suckling rats. (MedJmmunol., 2002, vol.4, N 3,pp 467-472)
Введение точные и гуморальные компоненты: макрофаги, Т-
Известно, что иммунная система ребенка форми- и лимфоциты, натуральные киллеры, эпителиаль-
руется в период внутриутробного развития и в пер- иые клетки> иммуноглобулины, в том числе slgA,
вые месяцы жизни [1,8]. Любые воздействия, при- комплемент, лизоцим, бифидум-фактор, интерфе-
водящие к отклонениям в ходе беременности, сокра- Рон’ эпителиальные факторы роста и др. [1, 7, 9,10].
щению сроков вынашивания, гипотрофии и гипок- Причем различные субпопуляции клеток матери не
сии плода, неминуемо вызывают задержку развития
только поступают в кишечник новорожденного, но
иммунной системы и дефицит поступающих от ма- и мигРиРУЮт в его кровь [9, 10]. Макрофаги способ-
тери гуморальных и клеточных факторов иммуни- ны м°ДУлиР0Вать реактивность лимфоцитов в груд-
тета, что в свою очередь ведет к росту детской забо- ном молоке- Передаваемые с молоком матери фак-
леваемости и смертности [1, 2, 5, 12, 13]. торы иммунитета обеспечивают адаптацию новорож-
В раннем постнатальном периоде природой пре- денных к новым условиям вскармливания, участву-
дусмотрено получение новорожденными млекопита- ют в за1Чите желудочно-кишечного тракта от инфек-
ющими грудного молока, которое является источни- ции и способствуют повышению резистентности
ком не только питания, но и иммунологической за- организма к патогенным воздействиям [1, 7].
щиты [1, 7, 9, И]. Так, в молоке присутствуют кле- Реалии сегодняшнего дня демонстрируют рост
________________________________________________ числа соматических, инфекционнных, аллергичес-
Адрес для переписки: КИх, аутоиммунных и других заболеваний, причем
Ризопулу Анна Панаётисовна - докторант наиболее уязвимой частью населения являются бе-
Института иммунологии АН РУз. 700060, ременные женщины, у которых в последнее время
Ташкент, ул. Я.Гулямова, 74 Институт все чаще регистрируются экстрагенитальная патоло-
иммунологии АН РУз. Тел.: (99871) 133-66-64 (раб.), гия и высокая частота иммунодефицитов [1, 2, 5,].
(99871) 152-67-50 (дом.). Факс 998-71-133-08-55 Более того, очень часто не факт инфицирования, а
E-mail: garibfiruz@inbox.ru или ruslan@ immuno.silk.org снижение иммунореактивности служит первопричи-
ной заболевания [2, 6]. Влияние неблагоприятных экологических, социальных, алиментарных и др. факторов способствует недостаточной выработке клеточных и гуморальных компонентов, поступающих в грудное молоко лактирующих матерей и, как следствие, негативно влияет на становление иммунной системы новорожденного и адаптации его к окружающей среде.
Существуют различные подходы для проведения иммунокоррекции: пероральный, парентеральный, интраназальный, лимфотропный, трансдермальный и др. Все они инвазивны, поскольку связаны с непосредственным введением препарата в организм. На наш взгляд, актуальным является поиск нового - физиологичного пути для проведения иммунокоррекции, способствующей восполнению иммунологической недостаточности новорожденных. Поэтому мы предположили возможность проведения иммунокоррекции в раннем постнатальном периоде путем введения препарата не самим сосункам, а лактирую-щим самкам, которые через грудное молоко передадут им иммуноактивные факторы.
Целью исследования явилось доказательство принципиальной возможности проведения иммунокоррекции у крыс-сосунков опосредованно через грудное молоко.
Материалы и методы
В эксперименте было использовано 15 белых лабораторных лактирующих крыс и их потомство - 84 сосунка. В первый день после родов самок с потомством разделили на 2 группы: контрольную и подопытную. Подопытной группе самок инъецировали по-лиоксидоний на физрастворе (0,95 % ЫаС1) п/к, через день, 7 раз, из расчета 15 мкг/крысу (75 мкг/кг массы тела); самки контрольной группы получали инъекции физраствора по вышеприведенной схеме.
Полиоксидоний - низкомолекулярное водорастворимое производное гетероцепных полиаминов -сополимер ]М-окиси 1,4 - этилен пиперазина и 1,4 -этиленпиперазиния бромида с м.м. 60 - 100 кДа. Полиоксидоний обладает выраженной иммунотропной и антитоксической активностью и применяется в качестве высокоэффективного иммунокорригирующего средства при многих болезнях человека, а также в составе нового класса вакцин [3, 4, 5]. Полиоксидоний разработан в ГНЦ - Институте иммунологии М3 России и серийно выпускается в ООО “Им-мафарма” (Москва).
Через 3 недели - по окончании подсосного периода изучали активность антителогенеза, фенотипические характеристики основных субпопуляций лимфоцитов крови, определяли массу тела, селезенки и печени, клеточность селезенки, содержание лейкоцитов и эритроцитов в крови, проводили бактериологический анализ толстого кишечника на нали-
чие дисбактериоза. Через 6 недель определяли массу тела, печени, селезенки и тимуса.
Для этого сосунков декапитировали с учетом требований к эфтаназии, забирали кровь на гепарин, извлекали селезенку и печень, участок толстого кишечника.
Мононуклеарные клетки из периферической крови получали путем разделения на градиенте плотности фиколла-верографина плотностью 1,077 г/мл по A.Boyum (1974).
Фенотип основных субпопуляций лимфоцитов изучали по идентификации на их поверхности диф-ференцировочных рецепторов в иммунофлюорес-центном тесте с применением моноклональных антител против CD-рецепторов человека (пр-ва ГНЦ - Института иммунологии М3 России), относящихся к кластерам: CD3 - Т-лимфоциты; CD4 - Т-хелпе-ры; CD8 - Т-супрессоры/цитотоксические лимфоциты; CD21 - В-лимфоциты; CD 16 - натуральные киллеры. В качестве вторых антител использовали конъюгированные с ФИТЦ-Р(аЬ’)-фрагменты антител к IgG мыши. Флюоресценцию регистрировали с помощью микроскопа «Люмам Р-8».
Активность антителогенеза определяли по числу антителообразующих клеток в селезенке после однократной иммунизации Т-зависимым антигеном -эритроцитами барана (ЭБ) (Jerne N.K., Nordin F.F., 1963).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартных методов вариационной статистики с вычислением средней арифметической (М), ее ошибки (т) и критерия Стъюден-та (t).
Результаты
Известно, что интегральным показателем здоровья новорожденных является динамика массы тела. Через 3 недели от начала проведения опосредованной иммунокоррекции полиоксидонием отмечен 4-кратный прирост массы тела в основной группе, а в контроле - 3- кратный привес (табл 1).
Интересно отметить, что разница между группами сравнения продолжала увеличиваться и через 6 недель от начала эксперимента, несмотря на то что иммунокоррекция была завершена 3 недели назад.
Масса печени и селезенки в опыте также были достоверно выше в сравнении с данными контроля (рис). Так, через 3 недели от начала эксперимента масса печени в основной группе составляла 847+67 мг против 707±64 мг в контроле, через 6 недель масса печени отличалась в 1,3 раза 1783±144 мг против 1327± 125 мг соответственно (Р<0,05). Масса селезенки в основной группе через 3 недели после рождения была 71,4±6,2 мг в контроле против 123+10,5 мг в основной группе и различалась в 1,7 раза (Р<0,05). Через 6 недель от начала исследова-
ния разница с контролем была двухкратной в пользу основной группы (111±10,5 мг против 230,7±25 мг соответственно; Р<0,001). Больший прирост массы селезенки в нашем эксперименте, очевидно, может быть связан с иммунотропным действием полиоксидония.
Интересно подчеркнуть, что 1,4 раза возросла и масса тимуса у крыс-сосунков под влиянием опосредованной иммунокоррекции и через 6 недель после рождения составила 111 ±9,2 мг против 81,4±6,1 мг в контроле (Р<0,05).
Результаты параллельного определения количества CD3, CD4, CD8, CD21, CD16 клеток через 3 недели показали достоверные различия данных опыта с контролем, которые проявились в увеличении под влиянием полиоксидония числа Т-лимфоцитов, Т-хелперов и Т-супрессоров (табл. 2). Одновременно возросла пропорция натуральных киллеров (CD 16). Полученные результаты свидетельствуют об умеренном стимулирующем влиянии опосредованной иммунокоррекции на сосунков, не нарушающего индекса иммунорегуляции.
Суммарным важнейшим показателем работы иммунной системы является иммунный ответ, который проявляется в накоплении антителопродуцентов в селезенке после иммунизации Т-зависимым антиге-
ном. Результаты исследования активности антите-логенеза показали, что под влиянием полиоксидония увеличивается число ядросодержащих клеток в селезенке (ЯСКС) в 1,5 раза и составляет 220±21 млн против 145± 13 млн в контроле (Р<0,05). Из них количество антителообразующих клеток (АОК) составляет 8971 ±485 в опыте против 4407±429-в контроле, т.е. число антителопродуцентов возрастает в 2 раза (Р<0,001). Увеличивается и удельная антителообразующая активность селезенки - число АОК, сформированных каждым млн спленоцитов возрастает в 1,4 раза (табл. 3). Не отмечено достоверных изменений показателей гемопоэза под влиянием опосредованной иммунокоррекции полиоксидонием у сосунков, поскольку число эритроцитов и лейкоцитов не отличается от значений контроля.
Полученные результаты, очевидно, свидетельствуют о том, что опосредованно полученный поли-оксидоний может способствовать становлению и созреванию иммунной системы новорожденных, усиливая экспрессию дифференцировочных рецепторов, активность иммунорегуляторных факторов иммунитета, повышая эффективность межклеточных взаимодействий при реализации иммунного ответа.
Анализ состава микрофлоры толстого кишечника показал, что под влиянием опосредованной им-
Табл. 1. ДИНАМИКА МАССЫ ТЕЛА У КРЫС-СОСУНКОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ ОПОСРЕДОВАННОЙ ИММУНОКОРРЕКЦИИ ПОЛИОКСИДОНИЕМ ЧЕРЕЗ ГРУДНОЕ МОЛОКО (М±т, г).
Группы После рождения Через 1 нед. Через 2 нед. Через 3 нед. Через 6 нед.
Опыт (п=32) Контроль (п=47) Разность 5,9 ± 0,7 6,5 ± 0,7 11,9 + 1,2 11,5 ± 1,1 +0,4 (3%) 17,8 ± 1,8 16,1 + 1,7 +1,7 (11%) 22,5 ± 1,9 19,9 ± 1,6 +2,6 (13%) 37,7 ±2,1* 31,4 ± 2,0 +6,3 (20%)
*Р<0,05.
Табл. 2. СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ У КРЫС-СОСУНКОВ ЧЕРЕЗ 3 НЕДЕЛИ ПОД ВЛИЯНИЕМ ОПОСРЕДОВАННОЙ ИММУНОКОРРЕКЦИИ ПОЛИОКСИДОНИЕМ ЧЕРЕЗ ГРУДНОЕ МОЛОКО (М+т).
Показатели Контрольная группа Основная группа
Лейкоциты, в мкл 5600 ± 695 5950 ±710
Лимфоциты, % 47,1 ± 2,9 50,8 ± 3,5
в мкл 2598 + 288 3022 + 374
CD3, % 52,1 + 2,6 59,3 + 2,8*
в мкл 1350 ± 102 1793 ± 110*
CD4, % 32,5 ± 1,9 38,9 ± 2,0*
в мкл 835 ± 58 1175 ± 81*
CD8, % 19,0 + 1,5 26,1 ± 2,2*
в мкл 513 ± 64 788 ± 74*
Индекс иммунорегуляции (CD4/CD8); 1,7 ±0,1 1,5 ± 0,1
CD21, % 30,8 + 3,5 27,9 ± 2,9
в мкл 800 + 77 847 ± 79
CD16, % 6,8 + 0,7 10,1 ± 0,9*
в мкл 177 ± 20 305 + 28*
* - достоверные различия.
мунокоррекции не возрастает количество микроорганизмов с условнопатогенными свойствами. Более того, физиологический дисбактериоз, характерный для постнатального периода отмеченный в 100 % случаев в контроле, в основной группе был установлен у 65% животных. В основной группе животных достоверно возрастает число Е.соИ с нормальной ферментативной активностью.
Обсуждение
Полученные результаты обосновывают принципиальную возможность воздействия на иммунную систему крыс-сосунков путем введения иммунотроп-ного препарата лактирующим самкам. Опосредованное влияние полиоксидония на организм можно оценить как биостимулирующее и иммуностимулирующее. Биостимулирующее действие проявилось в увеличении массы тела уже через 1 неделю после рождения в среднем на 10% с максимальным увеличением до 20% относительно контроля через 6 недель. Параллельно с массой тела увеличивалась масса печени, селезенки и тимуса, что свидетельствует об отсутствии диспропорции между увеличением массы тела и внутренних органов. В литературе, посвященной изучению действия полиоксидония, мы не встретили работ о его биостимулирующих свойствах. Второй эффект опосредованного влияния полиоксидония можно оценить как умеренную иммуностимуляцию. Это проявилось в возрастании пропорции дифференцированных Т-лимфоцитов, Т-хелперов, Т-супрессоров/цитотоксических клеток, а также натуральных киллеров. Не отмечено достоверного влияния препарата на экспрессию С021 на В-лимфоцитах. Более заметное стимулирующее влияние полиоксидоний оказал на формирование антителообразующих клеток в селезенке, число которых возросло в 2 раза, что очевидно связано, с одной стороны с усилением пролиферативных процессов в селезенке и, с другой стороны, со стимуляцией мак-рофагального и Т-звеньев иммунитета. Можно полагать, что иммуностимулирующее влияние полиоксидония осуществляется посредством активации макрофагального звена иммунитета через стимуляцию хелперов, а также усиление интерфероногене-
за, что вытекает из достаточно большого числа работ, посвященного изучению механизмов действия полиоксидония на систему иммуногенеза. Так, согласно данным [3,4], полиоксидоний при взаимодействии с мононуклеарами периферической крови здоровых доноров индуцирует синтез цитокинов моноцитами: фактора некроза опухолей-а и IL-1(3 как классический митоген - ЛПС. Интересно, что полиоксидоний индуцирует продукцию провоспалитель-ных цитокинов и усиливает цитотоксичность NK-клеток только при исходно их низких или средних уровнях. При исходно повышенных уровнях он не оказывает влияния или даже несколько его снижает. На нормальные или повышенные уровни цитотоксичности препарат влияния не оказывает, т.е. обладает свойствами истинного иммунокорректора.
Известно, что реализация механизмов резистентности организма осуществляется через специфические и неспецифические факторы защиты, которые взамодействуют между собой. Несмотря на то, что в системе in vitro полиоксидоний, по данным литературы, главным образом стимулирует неспецифические факторы защиты - моноциты/макрофаги, нейт-рофилы и NK-лимфоциты, очевидно, его влияние на клеточный и гуморальный иммунитет в организме, поскольку в развитие иммунного ответа включается вся сеть межклеточных взаимодействий [3, 4].
Не вызывает сомнения, что в условиях нашего эксперимента происходит усиление иммунобиологических свойств грудного молока, что, по-видимому, связано не только с прямым переходом полиоксидония через молоко, но и с активацией основных звеньев иммунной системы матери, и последующим переносом новорожденным активированных клеточных и гуморальных факторов, которые не разрушаются в желудочно-кишечном тракте новорожденного, а всасываются в кровь.
Разработанный нами новый подход к опосредованной иммунокоррекции может иметь медицинское применение для восстановления функций иммунной системы у новорожденных, родившихся от матерей группы риска, что может способствовать снижению заболеваемости младенцев и детской смертности. Так, в экспериментальной работе исследователи заражали беременных самок лабораторных мышей урогени-
Табл. 3. АНТИТЕЛОГЕНЕЗ И ГЕМОПОЭЗ У ИММУНИЗИРОВАННЫХ КРЫС-СОСУНКОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ ПОЛИОКСИДОНИЯ, ВВЕДЕННОГО ЛАКТИРУЮЩИМ МАТЕРЯМ (ЧЕРЕЗ 3 НЕДЕЛИ ОТ НАЧАЛА ОПОСРЕДОВАННОЙ ИММУНОКОРРЕКЦИИ) (М±т).
Показатели Контрольная группа Основная группа ИС
1 .Число ЯСКС, млн 145 ± 13 220 ± 21* +1,5
2. Количество АОК на селезенку. 4407 ± 429 8971 ± 485* +2,0
3. Количество АОК на млн. спленоцитов 31 ± 4,1 42,0 ± 4,4* +1,4
4.Число эритроцитов, млн/мкл 9,3 ± 0,4 10,0 ± 0,9 +1,1
5. Число лейкоцитов, тыс/мкл 5,3 ± 0,5 6,0 ± 0,5 +1,1
Примечание: * - различия между группами достоверны. ИС - индекс стимуляции: отношение показателя в основной группе к контрольной.
■ Опыт □ Контроль
Рисунок. Масса тела, печени, селезенки и тимуса у крыс-сосунков под влиянием опосредованной иммунокоррекции полиок-сидонием через 6 недель по отношению к контролю.
тальной инфекцией и оценивали особенности неврологического статуса их потомства. В результате здоровое потомство дали лишь самки, инфицирование которых не сопровождалось выраженными нарушениями в их иммунной системе [11]. Не исключено, что опосредованная иммунокоррекция, проведенная детям с иммунодефицитами будет способствовать повышению эффективности вакцинации. Необходимо также учесть, что введение иммунокорректора матерям повысит качество их здоровья.
Полученные данные свидетельствуют о том, что опосредованная иммунокоррекция является физиологичной и не представляет угрозы для растущего организма.
Таким образом, нами впервые экспериментально обоснована возможность проведения иммунокоррекции физиологического иммунодефицита у крыс-сосунков опосредованно - путем введения полиокси-дония лактирующим самкам. Выявлены следующие эффекты: биостимулирующий, что проявилось в увеличении массы тела и пропорциональном возрастании массы печени, селезенки и тимуса; иммунокорригирующий, что проявилось в увеличении относительного и абсолютного числа лимфоцитов с фенотипом CD3, CD4, CD8, CD21; стимулирующий ан-тителогенез после иммунизации и корректирующий дисбактериоз кишечника.
Список литературы
1. Вельтищев Ю.Е. Онтогенез иммунной системы и факторы, влияющие на иммунобиологическую реактивность детского организма. // Вопросы охр. материнства и детства, 1988, N10, с. 3-12.
2. Кузнецов В.П., Чихладзе М.В., Сепиашвили Я.Р. Тактика иммунокорригирующего лечения при инфекциях. // Аллергология и иммунология,- 2001.-т.2, №1,- с.92-104.
3. Отечественный иммуномодулятор “Полиокси-доний”: механизм действия и клиническое примене-
ние (в помощь практическому врачу). Составители: Пинегин Б.В., Сараф А.Ф., ГНЦ-Институт иммунологии М3 РФ - Москва. - 2000,- 96 с.
4. Петров Р.В., Хаитов P.M., Некрасов А.В., Атта-улаханов Р.И., Пинегин Б.В., Пучкова А.С., Иванова А.С. Полиоксидоний - иммуномодулятор последнего поколения: итоги трехлетнего клинического применения. // Аллергия, астма и клин.иммуноло-гия,- 1999,- №3,- С.3-6.
5. Полетаев А.Б., Будыкина Т.С., Морозов С.Г., Абросимова А.А. Инфекция матери как причина патологии плода и новорожденного (профилактика нарушений с точки зоения иммунолога). // Аллергология и иммунология.- 2001.- т.2,- №1,-с.110-116.
6. Пинегин Б.В., Хаитов P.M. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения. // Клиническая медицина 1996. - №8, с.7-12.
7. Тихонова Л.В., Мухамедиева С.М., Ожигова О.Е. Иммунологические показатели грудного молока и заболеваемость детей неонатального периода // ХП Всесоюзный съезд детских врачей. - М., 1988,- С.279.
8. Шарецкий А.Н., Суринов Б.П. и др. Иммунная реактивность селезенки и лимфатических узлов мышей в раннем периоде постнатального развития. Влияние стимулирующих и супрессирующих факторов. // Иммунология.- 1999, N1. - С.44-48.
9. Durandy A., De Saint Basile G., Lisowska-Grospi-erre B., Gauchat J.-F., Forveille М., Kroczek R.A., Bon-nefoy J.-Y., Fischer A. Undetectable CD40 ligand expression on T cells and low В cell responses to CD40 binding agonists in human newborns. //J. Immunol -1995 - vol.154 - p.1560-1568.
10. Raes М., Alliet P., Gillis P., Zimmermann A., Kortleven J., Magerman K., Peeters V., Rummens J.L. Lymphocyte subpopulations in healthy newborn infants: comparison of cord blood values with values five days after birth // J. Pediatr. - 1993. - vol.123, N3. p.465-467.
11. Cronise K., Kelly S.J. Does a maternal urinary tract infection during gestation produce a teratogenic effects in the Long-Evans rats? // Soc. Neurosci. Abstr. 1999. - vol.25 (pt.2) - P2019
12,Eglinton B.A., Roberton D.M., Cummins A.G. Phenotype of T-cells, their soluble receptors levels and
cytokine profile of human breast milk. // Immunol. Cell Biol. - 1994.- vol.72, №4,- p.306-113.
13. Ckansen-Saphir U., Lindfors., Andersson U. Cytokine production in mononuclear cells of human milk studied at the Single-cell level // Pediatr Res. - 1993.-vol.34, №2.-p.213-216.
поступила в редакцию 07.09.2001 отправлена на доработку 25.01.2002 принята к печати 19.04.2002
All
