CC BY
24
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование проводили с помощью трех жидкостных хромато-масс-спектрометрических систем, настроенных на ионизацию в режиме электрораспыления.
Первая состояла из хроматографа 1260 Infinity с колонкой Zorbax Eclipse Plus C18 (2,1x100 мм, 3,5 мкм) с масс-спектрометром 6520 (QTOF, Agilent Technologies). Разделение выполняли при градиентном элюировании регистрация спектров МС и МС2 (Target MSMS). Температура газа-осушителя (азот) 320 °C.
Вторая состояла из хроматографа UltiMate 3000 с колонкой Acclaim RSLC 120 C18 (2,1x100 мм, 2,2 мкм) (Thermo Fisher Scientific) и масс-спектрометра AmaZon Speed (ITrap, ионная ловушка, Bruker Daltonic). Разделение выполняли при градиентном элюировании. Масс-спектрометр использовали в режиме UltraScan с изменением полярности; регистрация спектров МС-МС3 (Target MSMS). Режим фрагментации standard, амплитуда фрагментации 0,8 В, модуляция 40-250 %, время 40 мс. Температура газа-осушителя (азот) 320 °C.
Третья представляла собой модифицированый вариант второй системы при замене обычного источника для ионизации электрорапылением на источник IonBuster. Температура завесочного газа (азот) 320 °C.
Объектами для исследования были образцы мочи и крови человека с симптомами отравления при показаниях на обнаружение дисульфирама и его производных. Растворы дисульфирама получали суспендированием измельченных таблеток тетурам в смеси ацетонитри-ла и воды (1:1 об.) с последующим центрифугированием и разведением полученного раствора этой же смесью до необходимой концентрации.
Пробоподготовку биообразцов проводили безгидролизными методами.
1. Для ЖХ-МС (кровь, с концентрированием). Последовательная жидкостно-жидкостная экстракция из крови (1 мл) в присутствии избытка гидрокарбоната натрия: а) смесью 1-хлорбутана и изоамилового спирта (99:1); б) эти-лацетатом. Пробу (5 мкл) вводили в хроматограф в виде раствора в смеси ацетонитрила и воды (100 мкл, 50 % об.). Степень концентрирования 10.
2. Для ЖХ-МС (моча, без концентрирования). Извлечение ацетонитрилом (500 мкл) из образцов мочи (100 мкл) при охлаждении (-18 °C, 15 мин). Пробу (5 мкл) вводили в хроматограф в виде раствора в смеси ацетонитрила и воды (100 мкл) с концентрацией ацетонитрила 10 % об.
к увеличению распада дисульфирама и, соответственно, к снижению чувствительности.
Согласно справочнику Clarke's Analysis of Drugs and Poisons, ed. by A. Moffat, 4-е издание, дисульфирам мета-болизируется с образованием ряда летучих продуктов, а также диэтилдитиокарбаминовой кислоты, присутствующей как в свободной форме, так и в виде конъю-гатов (метилата и глюкуронида). В экспертном образце мочи мы обнаружили и идентифицировали два метаболита дисульфирама (рис. 2), структурные формулы которых указаны на рис. 1. Неизмененный дисульфирам и метилат диэтилдитиокарбаминовой кислоты в моче не обнаружили.
к
"Г
Ч1Г
Рис. 1. Структурные формулы дисульфирама и его метаболитов: дисульфирам-М (дитиокарбоно-вая кислота) и дисульфирам-М (дитиокарбоновая кислота) глюку-ронид (Gu - остаток глюкуроновой кислоты)
Дисульфирам (рис. 1) подвержен деградации и частичной фрагментации в ионном источнике. Наиболее интенсивные фрагменты образуются при разрыве связей между атомом серы и тионовой группой (C5H10NS+, m/z 116), при распаде дисульфидной группы (C5H10NS2+, m/z 148) а также при образовании аддукта продуктом распада дисульфидной группы и молекулой дисульфирама (C15H30N3S6+, m/z 444). Деградация дисуль-фирама сравнительно ограничена при использовании элюентов с присутствием метанола в качестве органического модификатора и, наоборот, увеличена в случае присутствия ацетонитрила. Основными продуктами деградации являются, по-видимому, полисерные соединения. Применение источника IonBuster ожидаемо приводит
Рис. 2. Метаболиты дисульфирама в моче (ЖХ-МС, QTOF, диапазон m/z ±5 мДа). (А) Дисульфирам-М (дитиокарбоновая кислота); (Б) дисульфирам-М (дитиокарбоновая кислота) глюкуронид.
Дисульфирам и его метаболиты в образце крови не обнаружили; отсутствие исходного соединения, возможно, связано с его высокой липофильностью и быстрым распределением в жировую ткань.
Фрагментация дисульфирама и его метаболитов (QTOF и ITrap) проста и сводится к ступенчатому распаду цепи.
ВЫВОДЫ
При обнаружении неизмененного дисульфирама методом ЖХ-МС в биообразцах рекомендуется применение элюентов с добавками метанола для снижения степени деградации в ионном источнике. Использование источника IonBuster недопустимо из-за малой термической стабильности молекулы. Присутствие в моче метаболитов (диэтилдитиокарбаминовой кислоты и ее глюкуронида), обнаруженных методом ЖХ-МСп, может быть основанием для заключения о предполагаемом приеме дисуль-фирама.
ОБНАРУЖЕНИЕ РОКУРОНИЯ ПРИ ПРОВЕаЕНИИ СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ОБЪЕКТОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖаЕНИЯ(ПОСТЕР) М.В. Ковальская1, А.М. Григорьев1, Н.А. Крупина1,2
• 1Бюро судебно-медицинской экспертизы Московской области (нач. - д.м.н., проф. В. А. Клевно)
• 2Кафедра судебной медицины (зав. -д.м.н., проф. В. А. Клевно) ФУВ ГБУЗ МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского
• Аннотация: Представляемый доклад посвящен методам изолирования и обнаружения рокурония в биологических жидкостях и тканях. Подготовку проб выполняли методом жидкостной экстракции с протеазным гидролизом тканей. Анализ проводили методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии с использованием масс-спектрометра типа ионная ловушка. Приведены результаты обнаружения рокурония в биологических жидкостях (кровь и моча) и тканях(печень, почка) человека.
• Ключевые слова: рокуроний, подготовка проб, ЖХ-МС, ионная ловУшка, кровь, моча, печень, почка
ВВЕДЕНИЕ
Рокуроний - недеполяризующий периферический миорелаксант со средней продолжительностью действия. Блокирует н-холинорецепторы скелетных мышц и препятствует деполяризующему действию ацетилхолина. Препарат применяется в качестве дополнительного средства при общей анестезии - для обеспечения релаксации скелетной мускулатуры во время хирургических вмешательств, для облегчения интубации трахеи. Связывается с белками плазмы на 30 %. Элиминируется в основном с желчью (70 %), в меньшей степени почками (30 %). Степень выведения с мочой достигает 40 % в течение 12-24 ч, 47 % выводится с калом. Примерно 50 % дозы выводится в виде рокурония.
Рокуроний (рис. 1) является четвертичным аммониевым основанием, однако он легко экстрагируется из водных растворов, благодаря значительному гидрофобному вкладу стероидной структуры. Значительный молекулярный вес рокурония, а также наличие четвертичного атома азота, не позволяет определять его методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС). В данной работе описывается идентификация рокурония в биологических объектах методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Анализ проводили на жидкостном хроматографе Ultimate 3000 (Thermo Scientific) с масс-спектрометром AmaZon speed (ионная ловушка, Bruker Daltonics) в градиентном режиме (фаза А: 0,1% муравьиной кислоты, 2мМ формиата аммония, 1% ацетонитрила в воде; фаза В: 0,1% муравьиной кислоты, 2мМ формиата аммония, 1% воды в ацетонитриле). Колонка - Acclaim RSLC 120 C18 120А (2,1x100 мм, 2,2 мкм, Dionex), предколонка VanGuard ACQUITY UPLC BEH C18, (2,1x5 мм, 1,7 мкм). Масс-спектрометр настраивали для работы в условиях электрораспыления при быстрой смене полярности и сбором данных в информационно-зависимом режиме. Идентификацию выполняли на основе сравнения получаемых спектров MS2 и MS3 с содержимым масс-спектрометрических библиотек Toxtyper 1_1 Library Custom и MWW 2014.
Для анализа мочи использовали пробоподготовку, заключающуюся в извлечении с помощью холодного аце-тонитрила и последующего охлаждения (-18 °C и ниже) в течение 10 минут. Пробоподготовка крови и тканей предусматривала последовательную жидкостно-жидкост-ную экстракцию образцов смесью хлорбутан - изоамило-вый спирт (99:1) и этилацетатом. Ткани предварительно подвергались ферментативному гидролизу трипсином. В качестве внутреннего стандарта использовали раствор 5-(4-метилфенил)-5-фенилгидантоин с концентрацией 10 мг/л. Рокуроний обнаружили в моче, крови, печени
Рис. 1. Структурная формула рокурония
Первичной стадией фрагментации рокурония является дезацетилирова-ние, в результате чего формируется интенсивный ион, m/z 487, хорошо заметный в MS2 спектре. Поскольку данное направление фрагментации является малохарактеристичным, а остальные ионы
в спектре Ы82 малоинтенсивны, окончательное заключение о наличие в образцах рокурония принимали на основании спектров М83. Ввиду наличия большого числа алифатических групп спектр М83 сложен для расшифровки, тем не менее содержит достаточное число интенсивных ионов для уверенного опознания рокурония.
ВЫВОДЫ
Внедрение в практическую работу судебно-химиче-ского отдела метода жидкостной хромато-масс-спектро-метрии с использованием масс-спектрометра типа ионная ловушка с базой данных более 900 токсикологически значимых веществ позволило при рутинном скрининге обнаруживать в объектах биологического происхождения рокуроний - лекарственное вещество, ранее не встречающееся в экспертных случаях отдела, идентификация которого методом газожидкостной хроматографии затруднена.
МОНИТОРИНГ СЛУЧАЕВ ОБНАРУЖЕНИЯ СТИМУЛЯТОРОВ АМФЕТАМИНОВОГО РЯДА В ТРУПНОМ МАТЕРИАЛЕ В 2015 ГОДУ (ПОСТЕР)
• М.В. Марченко1, Н.А. Крупина1,2, С.А. Кучук12
• 1Бюро судебно-медицинской экспертизы Московской области (нач. - д.м.н., проф. В. А. Клевно);
• 2Кафедра судебной медицины (зав. -д.м.н., проф. В. А. Клевно) ФУВ ГБУЗ МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского
• Аннотация: Доклад посвящен обзору случаев с летальным исходом, произошедших на территории Московской области в 2015 году, в которых при проведении судебно-химических исследований (СХИ) были определены стимуляторы амфетаминового ряда (САР).
• Ключевые слова: стимуляторы амфетаминового ряда, САР, причина смерти
ВВЕДЕНИЕ
В 2015 году число исследований аутопсийных объектов на наличие наркотических средств, в т.ч. САР, проведенных в судебно-химическом отделе (СХО) ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» остается стабильно высоким. Так, с целью обнаружения САР было проведено исследование объектов биологического происхождения от 4865 трупов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Количественное определение САР проводилось методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором. В 100 случаях были проведены количественные определения САР в крови: из них в 93 случаях определен амфетамин, в четырех - метамфетамин, в двух - медилен-диоксиметамфетамин (МДМА) и в одном - метилендиок-сиамфетамин (МДА).
По статистическим данным ГБУЗ МО «Бюро СМЭ», в восьми случаях обнаружены только САР, из них в семи -амфетамин (диапазон концентраций (ДК) от 0,1 мг/л до 5,4 мг/л, среднее значение (СЗ) - 1,1 мг/л), в одном -МДМА (концентрация 1,2 мг/л). В этих случаях в статистических картах судебно-медицинского исследования трупа (СК) указаны следующие причины смерти: механическая травма - 2 случая и отравление производными амфетамина - 6 случаев.
В 6 случаях, где в результате СХИ наряду с амфетамином (ДК в крови от 0,1 мг/л до 2,2 мг/л, СЗ - 0,7 мг/л) был обнаружен этиловый спирт (ДК в крови от 1,1 %о до 3,5 %о, СЗ - 2,1 %о), в статистических картах (СК) указаны следу-
