CC BY
43
фической информации. Постоянно расширяющейся спектр новых синтетических наркотиков предъявляет к библиотекам масс-спектров ряд специальных требований:
1. Постоянное обновление баз данных с внесением масс-спектров новых веществ;
2. Совместимость с программным обеспечением масс-спектрометрических систем разных производителей;
3. Наглядность предоставления результатов идентификации для иллюстрации выводов по исследованиям;
4. Быстрота обработки хроматографической информации.
Одним из таких продуктов, заслуживающих внимания специалистов судебно-химических и химико-токсикологических лабораторий, является ИПС «АИПСИН АнтиНаркотики».
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ИПС «АИПСИН АнтиНаркотики» (ЗАО «БелХард-Групп», Беларусь) состоит из 28 информационных модулей, содержащих информацию по целому спектру областей знаний, которые связаны с идентификацией наркотических веществ, их использованием и вызываемыми ими последствиями. Хромато-масс-спектрометры Agilent различных моделей.
Основным приложением ИПС «АИПСИН АнтиНаркотики» является «Хромато-масс-спектральный идентификатор», позволяющий в режиме «Обработать все» получать предварительную идентификационную информацию за максимально короткое время. Далее применяя режим «Продолжить с выбранной», используя другие модули системы, провести идентификацию вещества по времени удерживания и Mach-фактора, получить картину сравнения спектров (сопоставление, различие, наложение, спектр исследуемого пика, библиотечный спектр), информацию о веществе (физико-химические свойства, структурная формула, основные направления фрагментации, синонимы) и его токсикологическом и фармакологическом действии.
В практике работы нашего отделения ИПС «АИПСИН АнтиНаркотики» используется прежде всего для обработки скрининговых хроматограмм. В начале рабочего дня проводится пакетный анализ хроматограмм, полученных на каждом приборе в ночное время, который занимает не более 5 минут для 25 хроматограмм. Затем для более аргументированной идентификации используются другие возможности ИПС «АИПСИН АнтиНаркотики» или другие библиотеки масс-спектров.
За шесть месяцев применения ИПС «АИПСИН АнтиНаркотики» по данной схеме в нашем отделении было проанализировано более 10 000 хроматограмм.
Наглядным примером возможностей ИПС «АИПСИН АнтиНаркотики» для идентификации ксенобиотиков в биологических объектах являются случаи определения a-PVP (a-пирролидиновалерофенон) и его метаболита -2-оксо-РУР.
ВЫВОДЫ
Практический опыт применения ИПС «АИПСИН Антинаркотики» в практике работы нашего отделения свидетельствует о том, что данный программный продукт позволяет проводить быструю предварительную оценку хроматограмм, ориентировать экспертов на последующую целевую идентификацию ксенобиотиков и получать всестороннюю информацию для максимальной аргументации заключений. ИПС «АИПСИН Антинаркотики» по объему информации, необходимой для решения задач
судебно-химических и химико-токсикологических исследований, в настоящее время не имеет аналогов в нашей стране.
ЖХ-МСМ ПИСУЛЬФИРАМА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ (ПОСТЕР)
А. П. Солошенко, А. М. Григорьев
• Бюро судебно-медицинской экспертизы Московской области (нач. - д.м.н., проф. В. А. Клевно)
• Аннотация: Тетурам (дисульфирам) - соединение, применяемое в фармации для лечения алкоголизма путем формирования гиперчувствительности и по механизму действия являющееся блокатором ацетальдегидроге-назы. Превышение количества дисульфирама при его приеме в условиях значительного содержания этанола в крови может приводить к тяжелым токсическим реакциям и к смерти. Ввиду малой термической стабильности самого дисульфирама и значительной полярности его метаболитов метод жидкостной хромато-масс-спектрометрии представляются наиболее приемлемым инструментом для их обнаружения. В данной работе сообщается
о результатах оптимизирования метода ЖХ-МС для снижения степени деградации дисульфирама в ионном источнике масс-спектрометров при электрораспылительной ионизации. Было найдено, что предпочтительным органическим модификатором является метанол, а использование устройств, повышающих эффективность ионизации и транспорта вещества в масс-спектрометр (IonBuster, Вгикег Dаltonics), приводит к снижению чувствительности. Кроме того, приведены характеристики двух идентифицированных метаболитов дисульфирама, образованных в результате его восстановления и последующего глюкуро-нидирования.
• Ключевые слова: дисульфирам, ЖХ-МС, метаболиты, глюкурониды
ВВЕДЕНИЕ
Дисульфирам (тетурам, антабус, бис(диэтилтио-карбамоил) дисульфид) - соединение, ингибирующее окисление ацетальдегида, образующегося при биотрансформации алкоголя посредством блокирования ацеталь-дегидрогеназы. Предназначен для лечения хронического алкоголизма через вырабатывание гиперчувствительности и отрицательного условного рефлекса. Разовый прием значительных количеств дисульфирама (более 1 г) может приводить к смерти при высоком содержании алкоголя в крови.
Дисульфирам характеризуется малой термической стабильностью, что приводит к существенным затруднениям при его элюировании в условиях газовой хро-мато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) на капиллярных колонках; для обнаружения его метаболитов методом ГХ-МС необходимо проведение деконъюгирования и дериватизации. Этих недостатков лишен метод жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МСп). Цель нашей работы - оптимизация условий ЖХ-МСп определения дисульфирама и идентификация его метаболитов в моче.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование проводили с помощью трех жидкостных хромато-масс-спектрометрических систем, настроенных на ионизацию в режиме электрораспыления.
Первая состояла из хроматографа 1260 Infinity с колонкой Zorbax Eclipse Plus C18 (2,1x100 мм, 3,5 мкм) с масс-спектрометром 6520 (QTOF, Agilent Technologies). Разделение выполняли при градиентном элюировании регистрация спектров МС и МС2 (Target MSMS). Температура газа-осушителя (азот) 320 °C.
Вторая состояла из хроматографа UltiMate 3000 с колонкой Acclaim RSLC 120 C18 (2,1x100 мм, 2,2 мкм) (Thermo Fisher Scientific) и масс-спектрометра AmaZon Speed (ITrap, ионная ловушка, Bruker Daltonic). Разделение выполняли при градиентном элюировании. Масс-спектрометр использовали в режиме UltraScan с изменением полярности; регистрация спектров МС-МС3 (Target MSMS). Режим фрагментации standard, амплитуда фрагментации 0,8 В, модуляция 40-250 %, время 40 мс. Температура газа-осушителя (азот) 320 °C.
Третья представляла собой модифицированый вариант второй системы при замене обычного источника для ионизации электрорапылением на источник IonBuster. Температура завесочного газа (азот) 320 °C.
Объектами для исследования были образцы мочи и крови человека с симптомами отравления при показаниях на обнаружение дисульфирама и его производных. Растворы дисульфирама получали суспендированием измельченных таблеток тетурам в смеси ацетонитри-ла и воды (1:1 об.) с последующим центрифугированием и разведением полученного раствора этой же смесью до необходимой концентрации.
Пробоподготовку биообразцов проводили безгидролизными методами.
1. Для ЖХ-МС (кровь, с концентрированием). Последовательная жидкостно-жидкостная экстракция из крови (1 мл) в присутствии избытка гидрокарбоната натрия: а) смесью 1-хлорбутана и изоамилового спирта (99:1); б) эти-лацетатом. Пробу (5 мкл) вводили в хроматограф в виде раствора в смеси ацетонитрила и воды (100 мкл, 50 % об.). Степень концентрирования 10.
2. Для ЖХ-МС (моча, без концентрирования). Извлечение ацетонитрилом (500 мкл) из образцов мочи (100 мкл) при охлаждении (-18 °C, 15 мин). Пробу (5 мкл) вводили в хроматограф в виде раствора в смеси ацетонитрила и воды (100 мкл) с концентрацией ацетонитрила 10 % об.
к увеличению распада дисульфирама и, соответственно, к снижению чувствительности.
Согласно справочнику Clarke's Analysis of Drugs and Poisons, ed. by A. Moffat, 4-е издание, дисульфирам мета-болизируется с образованием ряда летучих продуктов, а также диэтилдитиокарбаминовой кислоты, присутствующей как в свободной форме, так и в виде конъю-гатов (метилата и глюкуронида). В экспертном образце мочи мы обнаружили и идентифицировали два метаболита дисульфирама (рис. 2), структурные формулы которых указаны на рис. 1. Неизмененный дисульфирам и метилат диэтилдитиокарбаминовой кислоты в моче не обнаружили.
к
"Г
Ч1Г
Рис. 1. Структурные формулы дисульфирама и его метаболитов: дисульфирам-М (дитиокарбоно-вая кислота) и дисульфирам-М (дитиокарбоновая кислота) глюку-ронид (Gu - остаток глюкуроновой кислоты)
Дисульфирам (рис. 1) подвержен деградации и частичной фрагментации в ионном источнике. Наиболее интенсивные фрагменты образуются при разрыве связей между атомом серы и тионовой группой (C5H10NS+, m/z 116), при распаде дисульфидной группы (C5H10NS2+, m/z 148) а также при образовании аддукта продуктом распада дисульфидной группы и молекулой дисульфирама (C15H30N3S6+, m/z 444). Деградация дисуль-фирама сравнительно ограничена при использовании элюентов с присутствием метанола в качестве органического модификатора и, наоборот, увеличена в случае присутствия ацетонитрила. Основными продуктами деградации являются, по-видимому, полисерные соединения. Применение источника IonBuster ожидаемо приводит
Рис. 2. Метаболиты дисульфирама в моче (ЖХ-МС, QTOF, диапазон m/z ±5 мДа). (А) Дисульфирам-М (дитиокарбоновая кислота); (Б) дисульфирам-М (дитиокарбоновая кислота) глюкуронид.
Дисульфирам и его метаболиты в образце крови не обнаружили; отсутствие исходного соединения, возможно, связано с его высокой липофильностью и быстрым распределением в жировую ткань.
Фрагментация дисульфирама и его метаболитов (QTOF и ITrap) проста и сводится к ступенчатому распаду цепи.
ВЫВОДЫ
При обнаружении неизмененного дисульфирама методом ЖХ-МС в биообразцах рекомендуется применение элюентов с добавками метанола для снижения степени деградации в ионном источнике. Использование источника IonBuster недопустимо из-за малой термической стабильности молекулы. Присутствие в моче метаболитов (диэтилдитиокарбаминовой кислоты и ее глюкуронида), обнаруженных методом ЖХ-МСп, может быть основанием для заключения о предполагаемом приеме дисуль-фирама.
ОБНАРУЖЕНИЕ РОКУРОНИЯ ПРИ ПРОВЕаЕНИИ СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ОБЪЕКТОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖаЕНИЯ(ПОСТЕР) М.В. Ковальская1, А.М. Григорьев1, Н.А. Крупина1,2
• 1Бюро судебно-медицинской экспертизы Московской области (нач. - д.м.н., проф. В. А. Клевно)
• 2Кафедра судебной медицины (зав. -д.м.н., проф. В. А. Клевно) ФУВ ГБУЗ МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского
• Аннотация: Представляемый доклад посвящен методам изолирования и обнаружения рокурония в биологических жидкостях и тканях. Подготовку проб выполняли методом жидкостной экстракции с протеазным гидролизом тканей. Анализ проводили методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии с использованием масс-спектрометра типа ионная ловушка. Приведены результаты обнаружения рокурония в биологических жидкостях (кровь и моча) и тканях(печень, почка) человека.
