CC BY
88
вые производное фентанила, а именно 3-метилфента-нил, было синтезировано подпольно в 1980-е гг. в США; в РФ в нелегальной продаже появился в 1990 году, но пик злоупотребления 3-метилфентанилом в РФ пришелся на 2005-2006 гг., в основном в западных и северо-западных регионах России. Низкие концентрации производных фентанила в биологических жидкостях и недостаточность данных о метаболизме затрудняет их обнаружение.
Г-оксибутират (ГОМК, гамма-оксибутират, GHB) -эндогенное соединение, действие которого подобно нейромедиатору у-аминомасляная кислота (ГАМК). Тем не менее употребление у-оксибутирата представляет определенную опасность из-за значительной дозировки и риска неблагоприятного взаимодействия с другими се-дативными препаратами и алкоголем. Основными причинами роста употребления у-оксибутирата в Санкт-Петербурге и Ленинградской области, возможно, следует считать его очевидную доступность и низкую стоимость.
Данная работа посвящена определению таких производных фентанила, как 3-метилфентанил, карфентанил, ацетилфентанил и их метаболитов в моче; у-оксибутирата в крови и моче методами газовой и жидкостной хромато-масс-спектрометрии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объектов химико-токсикологического исследования использовали кровь и мочу людей, находящихся в состоянии наркотического опьянения, а также пациентов токсикологического отделения ГБУ СПб НИИ СП им. И. И. Джанелидзе, находящихся в состоянии психомоторного возбуждения.
Для определения производных фентанила и у-оксибутирата использовали газовый хроматограф 5890B с масс-спектрометром MSD 5977 (ГХ-МС, Agilent Technologies) и жидкостной хромато-масс-спектрометр (ЖХ-МС/МС) LCMS-8040 (Shimadzu) с тройным квадру-полем, настроенный на режим положительной электрораспылительной ионизаци.
Для идентификации производных фентанила подготовка проб включала жидко-жидкостную экстракцию при щелочных значениях рН или твердофазную экстракцию (ТФЭ) с последующим анализом методами ГХ-МС и ЖХ-МС/МС, а также извлечение ацетонитрилом с анализом методом ЖХ-МС/МС. Жидко-жидкостная экстракция при щелочных значениях рН вполне пригодна для определения производных фентанила методом ЖХ-МС/МС и, в ряде случаев (при больших концентрациях анализируемого соединения в биологических объектах), методом ГХ-МС в режиме SIM, так как позволяет сконцентрировать компоненты образца. ТФЭ на смешанных с кати-ноном патронах позволяет получить достаточно чистые экстракты при значительной степени концентрирования целевых аналитов. Недостатком извлечения ацетонитри-лом является его малая пригодность для концентрирования аналитов, поэтому применение данного способа подготовки проб целесообразно при высоких концентрациях аналитов в биологических объектах, либо при увеличении объема пробы (до 50 мкл), вводимой в хромато-масс-спектрометрическую систему за счет концентрирования аналитов на начальном участке колонки в градиентном режиме.
Спектры и времена удерживания идентифицированных производных фентанила (3-метилфентанил, карфен-танил, ацетилфентанил) и их метаболитов (нор-карфен-танил, нор-ацетилфентанил) использовали в дальнейшем для автоматизированного поиска этих соединений при скрининге. Для определения у-оксибутирата в крови и моче использовали жидкостно-жидкостную экстракцию
этилацетатом в присутствии серной кислоты с последующим анализом методами ГХ-МС (после дериватизации) и ЖХ-МС/МС (без дериватизации), а также извлечение из мочи ацетонитрилом и прямым вводом разбавленной мочи (ЖХ-МС/МС). Найдено, что анализ разбавленной мочи более предпочтителен, нежели иные способы подготовки проб вследствие нивелирования возможных потерь аналита.
ВЫВОДЫ
Для обнаружения производных и метаболитов фента-нила в моче при проведении химико-токсикологического исследования освидетельствуемых целесообразно использовать метод ЖХ-МС/МС ввиду достаточной селективности и низких пределов обнаружения, достигаемых в автоматическом режиме при регистрации спектров, зависимой от получаемых данных. Определение производных фентанила методом ГХ-МС возможно только в режиме SIM при достаточной концентрации аналитов.
Метод ЖХ-МС/МС не проявлял достаточную чувствительность и информативность при обнаружении у-оксибутирата в крови и моче ввиду обедненности спектров ионов-продуктов и малого молекулярного веса аналита. Применение метода ГХ-МС позволяло надежно определять у-оксибутират в крови и моче; при этом интенсивность пика у-оксибутирата на хроматограммах экстрактов мочи значительно превышала пик мочевины -матричного соединения, обычно мешающего определению у-оксибутирата.
ОБНАРУЖЕНИЕ АЦЕТИЛФЕНТАНИЛА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЕГО МЕТАБОЛИТОВ МЕТОДАМИ ГАЗОВОЙ И ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ к.фарм.н. Э.Г. Николаева1, А.М. Григорьев1, Н.А. Крупина1,2
• 1Бюро судебно-медицинской экспертизы Московской области (нач. - д.м.н., проф. В. А. Клевно)
• 2Кафедра судебной медицины (зав. -д.м.н., проф. В. А. Клевно) ФУВ ГБУЗ МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского
• Аннотация: Ацетилфентанил - новое дизайнерское наркотическое вещество, являющееся одним из производных фентанила. Результаты изучения анальгетической активности некоторых аналогов фентанила показывают, что ацетилфентанил наряду с его метилированными производными является одним из наиболее опасных аналогов фентанила из-за узкого диапазона безопасных доз. Сведения о биотрансформации в организме человека ацетилфентанила ограничены. Низкие действующие концентрации в крови и недостаточность сведений о метаболизме этого вещества затрудняют проведение судебно-химических экспертиз и химико-токсикологических исследований. Методами газовой и жидкостной хромато-масс-спектрометрии в образцах мочи и крови мы идентифицировали ряд метаболитов ацетилфентанила. Найденные соединения представляют собой продукты N-дезалкили-рования, N-дезацетилирования, N-дезари-лирования, моно- и дигидроксилирования, O-метилирования и глюкуронидирования гидроксилированных форм. Также обнаружили
исходный ацетилфентанил. Наиболее интенсивные хроматографические пики для образца крови соответствуют самому ацетилфентанилу, его метаболитам фазы I и O-метилирован-ным моногидроксилированным метаболитам, для образца мочи - метаболитам фазы II.
• Ключевые слова: дизайнерские наркотики, ацетилфентанил, метаболиты, ГХ-МС, ЖХ-МС, кровь, моча
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы стремительно растет популярность синтетических наркотических средств, так называемых «дизайнерских наркотиков». В связи с этим введение методик ГХ-МС и ЖХ-МС в скрининговые процедуры, используемые в практической работе при определении наркотических средств синтетического происхождения и их метаболитов, является одной из актуальных задач судеб-но-химической практики. В 2015 г. ацетилфентанил и его метаболиты обнаружены нами в аутопсийном материале.
В соответствии с постановлением Правительства Российской Федерации от 23 ноября 2012 г. № 1215 оборот ацетилфентанила в Российской Федерации запрещен.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объектов исследования для обнаружения ацетилфентанила и идентификации его метаболитов использовали кровь и мочу аутопсийного материала, смыв с внутренней поверхности пустого шприца, доставленного вместе с трупным материалом на исследование. Исследование проводили с помощью газовых и жидкостных хромато-масс-спектрометрических систем.
Газовые системы, используемые для первичного скрининга образцов, состояли из хроматографов 6890N и 7890B с масс-спектрометрами 5975C и 5977A соответственно (Agilent Technologies), настроенными на работу при положительной электронной ионизации в режиме сканирования, диапазон 40-550 Да. Разделение выполняли на колонках HP-5MS (30 м х 0,25 мм х 0,25 мкм) в градиентных условиях. Ввод проб без сброса (splitless). Объем вводимой пробы 1 мкл. Неизмененный ацетилфентанил обнаруживали с помощью библиотеки NIST11.
Жидкостные системы, настроенные на ионизацию в режиме электрораспыления, применяли для подтверждения обнаружения ацетилфентанила и идентификации его метаболитов.
Первая состояла из хроматографа 1260 Infinity с колонкой Zorbax Eclipse Plus C18 (2,1x100 мм, 3,5 мкм) и масс-спектрометра 6520 (QTOF, Agilent Technologies). Разделение выполняли при градиентном элюировании и регистрации спектров МС и МС2 (Target MSMS).
Вторая состояла из хроматографа UltiMate 3000 с колонкой Acclaim RSLC 120 C18 (2,1x100 мм, 2,2 мкм) (Thermo Fisher Scientific) и масс-спектрометра AmaZon Speed (ITrap, ионная ловушка, Bruker Daltonic). Разделение выполняли при градиентном элюировании. Масс-спектрометр использовали в режиме UltraScan с изменением полярности; регистрация спектров МС-МС3 (Target MSMS). Режим фрагментации standard, амплитуда фрагментации 0,8 В, модуляция 40-250 %, время 40 мс.
Пробоподготовку проводили безгидролизными методами, разработанными и принятыми в практике судеб-но-химического отдела для исследования биологических жидкостей на наличие лекарственных и наркотических веществ.
• 1. Для ГХ-МС (без дериватизации). Жидкостно-жид-костная экстракция бутилацетатом из образцов (1 мл) в присутствии трис-буфера (рН 11). Степень концентри-
рования 3,3. На хроматограммах всех образцов, поступивших на экспертизу, наблюдали пик со временем удерживания около 11,0 мин и масс-спектром, соответствующим ацетилфентанилу.
• 2. Для ГХ-МС (с триметилсилилированием). Жид-костно-жидкостная экстракция хлористым метиленом из мочи (1 мл) с добавкой водного раствора аммиака (pH 9) с последующим триметилсилилированием (BSTFA+1 % TMS). Степень концентрирования 10. На хроматограммах наблюдали гидроксилированные и гидроксилированные с метилированием метаболиты ацетилфентанила.
• 3. Для ЖХ-МС (с концентрированием). Последовательная жидкостно-жидкостная экстракция из крови или мочи (1 мл) в присутствии избытка гидрокарбоната натрия: а) смесью 1-хлорбутана и изоамилового спирта (99:1), б) этилацетатом. Пробу (5 мкл) вводили в хроматограф в виде раствора в смеси ацетонитрила и воды (100 мкл, 50 % об.). Степень концентрирования 10.
• 4. Для ЖХ-МС (без концентрирования). Извлечение ацетонитрилом (500 мкл) из образцов крови или мочи (100 мкл) при охлаждении (-18 °C, 15 мин). Пробу (5 мкл) вводили в хроматограф в виде раствора в смеси ацетони-трила и воды (100 мкл) с концентрацией ацетонитрила 50 % и 10 % об. для крови и мочи соответственно.
• 5. Для ЖХ-МС (без концентрирования, минимальная пробоподготовка). Образец мочи центрифугировали, добавляли 10 об.% ацетонитрила и вводили в хроматограф.
Как отмечалось исследователями ранее (Мелен-тьев А. Б. с соавт., Журн. аналит. химии, 2015, Т. 70, № 2, С.1), метаболизм ацетилфентанила заключается в основном в гидроксилировании фенэтильного остатка с возможным O-метилированием, в дезалкилировании и де-зацетилировании. Ряд этих соединений был обнаружен нами также методами ГХ-МС и ЖХ-МС. Однако для ЖХ-МС применяемый безгидролизный способ подготовки проб позволял обнаруживать глюкуронидированные метаболиты. Подобные формы были найдены для всех гидроксилированных метаболитов, экскретируемых с мочой (моногидроксилированных, дигидроксилированных и дигидроксилированных с O-монометилированием). Интенсивности хроматографических пиков глюкурони-дов в моче были значительно выше, чем интенсивности пиков соответствующих им гидроксилированных метаболитов, и (почти в 10 раз) выше, чем пик неизмененного ацетилфентанила. Это проиллюстрировано на рисунке, содержащем хроматограммы образца мочи (ионная ловушка, EIC).
Рис. 1. Масс-хромато-граммы образца мочи. Ацетилфентанил (А); моноги-дроксилированные глюкуро-нидированные метаболиты (Б); глюкуронидированные метаболиты (В); дигидрок-силированные мономети-лированные глюкуронидиро-ванные метаболиты (Г)
В образце крови обнаружили моногидроксили-рованные, дезалкилиро-ванныи и дигидроксилированные с монометилированием метаболиты. Однако пик, соответствующий ацетилфентанилу, был наиболее интенсивным по сравнению с остальными метаболитами.
Фрагментация ацетилфентанила и его метаболитов (QTOF и 1Тгар) сравнительно проста и сводится в основном к разрыву связи между пиперидиновым кольцом
и N-фенилацетамидным остатком с последующим элиминированием фенэтильного остатка. В спектрах глюкуро-нидированных метаболитов, как правило, присутствуют интенсивные ионы, образующиеся при элиминировании остатка глюкуроновой кислоты.
ВЫВОДЫ
Проведенные исследования позволяют сделать вывод о преимуществах обнаружения метаболитов глюкурони-дированных метаболитов в образцах мочи, пробоподго-товка которых не содержала стадии деконъюгирования. Для образцов крови удобно обнаружение как самого фен-танила, так и его метаболитов, что повышает вероятность получения верных результатов. Представленные методики подготовки проб позволяют производить исследования образцов малой размерности (0,1-1 мл).
■ ПРИМЕНЕНИЕ ДВУХКОЛОНОЧНОЙ СХЕМЫ В ГАЗОВОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРЕ ОЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВИИХМЕТАБОЛИТОВ
А. В. Кинд, к.х.н. И. Л. Гринштейн
• ООО «Аналит Продактс», Санкт-Петербург
• Аннотация: для повышения производительности анализа наркотических средств была разработана схема обеспечивающая анализ проб с разными видами дериватизации на двух колонках, установленных в одном термостате газового хромато-масс-спектрометра.
• Ключевые слова: газовая хромато-масс-спектрометрия, дериватизация, силилирование, синтетические каннабимиметики, двухколоноч-ная схема.
Газовая хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС) является одним из широко применяемых методов в скри-нинговом анализе наркотических средств и их метаболитов. Для повышения чувствительности, получения достоверных и воспроизводимых результатов при анализе полярных и труднолетучих соединений методом ГХ-МС их необходимо подвергать дериватизации. Поскольку большинство веществ, представляющих интерес для токсикологического скрининга, соответствуют этим характеристикам, то стадия дериватизации, как правило, является необходимым элементом пробоподготовки. Способ дериватизации определяется полярными группами, входящими в структуру аналитов. Например, для определения соединений, структуры которых включают гидроксильные и/или карбоксильные группы (в том числе, синтетических каннабимиметиков, основного метаболита тетрагидроканнабинола и опиатов) нередко применяется триметилсилилирование, причем методология его использования обычно связана с введением избытка силилирующих агентов в хроматограф. Силилирование материалов хроматографических путей приводит к частичному силилированию недериватизированных (или дериватизированных иным способом) проб, вводимых в хроматограф впоследствии - эффект, известный как де-риватизация «on-line». Дополнительным следствием этого эффекта является некоторая модификация колонки. Как правило, проявления дериватизации «on-line» нежелательны, и хроматографисты стремятся проводить анализ силилированных образцов на отдельном хроматографе или с помощью колонки, специально выделяемой для этих целей. Однако подобный способ решения данных затруднений нельзя назвать оптимальным как из-за высокой стоимости хроматографического оборудования, так из-за трудоемкости смены колонки в ГХ-МС системах.
Предлагаемая нами схема обеспечивает разделение проб с разными видами дериватизации на двух колонках, установленных в одном термостате. Для ее реализации к стандартной комплектации газового хромато-масс-спектрометра дополнительно необходим инжектор, вторая хроматографическая колонка и система позволяющая вводить две колонки параллельно в интерфейс хрома-то-масс-спектрометра. Важнейшим компонентом схемы является применение феррулы, позволяющей соединять обе колонки с интерфейсом масс-спектрометра при отсутствии объединенного газового пути, характерного для сплиттеров, и - следовательно - полностью разделять потоки газа из этих колонок. Для автоматизации процесса применяли автодозатор, позволяющий вводить пробы в обе хроматографические линии в рамках одной последовательности анализов. Данная схема была реализована и отработана на хромато-масс-спектрометрическом комплексе Shimadzu GCMS -QP2010 Ultra c двумя колонками HP-5MS, системой twinline и автодозатором AOC Dual Tower.
ВЫВОДЫ
Реализация предлагаемой схемы обеспечивает высокую производительность при использовании одного хромато-масс-спектрометра для определения различных дериватов и свободных форм наркотических средств и их метаболитов.
ВОЗМОЖНОСТИ ИПС «АИПСИН АНТИНАРКОТИКИ» аЛЯ_РУТИННЫХ_ХТИ_(ПОСТЕР)
В. А. Бычков, к.фарм.н. Т. В. Горбачева • СПб. ГБУЗ «Бюро судебно-медицинской экспертизы» (нач. - д.м.н. И. Е. Лобан)
• Аннотация: Материал посвящен вопросу применения ИПС «АИПСИН АнтиНаркотики» для идентификации токсикологически значимых веществ и их метаболитов в биологических объектах при судебно-химических и химико-токсикологических исследованиях. Показана возможность использования ИПС «АИПСИН АнтиНаркотики» для обработки большого объема скрининговых хроматограмм (метод ГХ-МС), а также возможность идентификации метаболитов токсикологически значимых веществ на примере идентификации а^Р и его метаболита. ИПС «АИПСИН АнтиНаркотики» является постоянно обновляемой системой, позволяющей не только идентифицировать широкий спектр ксенобиотиков и их метаболитов по масс-спектрам, но и получить сведения по токсикокинетике, токсикодинамике, внешнему виду и способах употребления идентифицированных веществ, а также другим методам идентификации.
• Ключевые слова: ИПС «АИПСИН АнтиНаркотики», ГХ-МС, идентификация, а^Р
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы метод хромато-масс-спектроме-трии стал основным методом идентификации токсикологически значимых веществ в биологическом материале. Возможности метода хромато-масс-спектрометрии для судебно-химических и химико-токсикологических исследований во многом определяются программным обеспечением и в первую очередь библиотеками масс-спектров, используемых для обработки хроматогра-
