CC BY
12
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ
Для анализа FLT3-TKD флуоресцентно-меченные ампликоны дополнительно гидролизовали рестриктазой EcoRV (СибЭн-зим, Россия). Положительные образцы секвенировали с использованием BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA).
Результаты. В результате проведения фрагментного анализа, исследуемые мутации были выявлены у троих из шести пациентов с ОМЛ. Наличие мутаций у этих пациентов было подтверждено секвенированием по Сенгеру. У пациента №1 с ранним рецидивом обнаружена FLT3-ITD мутация c.1774_1838-1dup, не представленная в COSMIC. Длина тан-демного повтора (ITD) составила 153 bp и по данным секве-нирования включает часть 14 экзона и весь 14 интрон. Уровень аллельной нагрузки мутации составил 18%. До нашего исследования образец костного мозга пациента был направлен в The Laboratory for Personalized Molecular Medicine (Germany). Диагностический тест методом ПЦР подтвердил наличие FLT3-ITD мутации. Также у этого пациента была обнаружена самая распространенная NPM1 мутация типа А c.860-863dup с аллельной нагрузкой 34%. Данные об анализе исследуемых мутаций у пациента в дебюте заболевания отсутствуют, однако хромосомных аномалии у него нет. У
пациента №2 с поздним рецидивом обнаружена наиболее распространенная FLT3-TKD c.2503G>T с уровнем аллельной нагрузки более 50%. Полученные данные были подтверждены методом аллель-специфичной ПЦР Лабораторией молекулярной гематологии НМИЦ Гематологии (Москва). Также есть данные, что у этого пациента выявлен PML-RARA.
У пациента №6 с ранним рецидивом обнаружена FLT3-ITD мутация с ITD длиной 99 bp и аллельной нагрузкой 5%. Сек-венирование подтвердило наличие мутации, т.к. на секвено-грамме видно окончание фрагмента дикого типа и продолжение мутантного фрагмента. Но из-за аллельной нагрузки, ниже порога обнаружения метода, достоверно определить вариант мутации не представляется возможным. Также есть данные, что в дебюте у этого пациента выявлен RPN1-EVI1.
Выводы. Впервые в Красноярском крае был использован метод фрагментного анализа для обнаружения и количественной оценки FLT3 и NPM1 мутаций у пациентов с ОМЛ. Использованный метод позволил выявить мутации у троих из шести пациентов с ОМЛ и провести количественную оценку уровня аллельной нагрузки. Кроме того, была выявлена новая FLT3-ITD мутация, не представленная в COSMIC и затрагивающая интронную область.
В.А. Мисюрин1, И.В. Ярош 2'3, М.В. Дмитриева1, А.А. Рудакова1, И.И. Краснюк3, М.А. Барышникова1
СИСТЕМА ДОСТАВКИ БЕЛКОВ С ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
В ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ
1Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения России, г. Москва
2Акционерное общество «Р-Фарм», г. Москва
3Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), Москва
Введение. Гранзим B (Гр B) является мощнейшим инициатором каспазного каскада и запуска апоптоза в клетке. Благодаря этому Гр B может использоваться как противоопухолевое средство. В настоящее время для доставки Гр B в опухолевую клетку используются CAR-T-лимфоциты. Подобные вакцины эффективны, но их производство сложно и требует больших затрат.
Цель. Разработать контейнеры для доставки Гр B и других протеолитических белков в опухолевую клетку.
Материалы и методы. В нашем исследовании использовались мышиный Гр B и трипсин. Эти белки были упакованы в липосомы по протоколу, предложенному Бенгхемом. Липо-сомы, содержащие трипсин, были добавлены в культураль-ную среду с клетками меланомы mel Kor и клеткам рака молочной железы SK-BR-3. Цитотоксический тест проводился методом МТТ. Для статистического анализа использовался критерий Уилкоксона.
М.А. Михалева1, И.С. Мартынкевич1, Е.В. Мотыко1, С.В. Петров1, И.А. Булдаков1, А.Ю. Кувшинов1, С.В. Волошин1,23
МУТАЦИОННЫЙ СТАТУС ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА: АПРОБАЦИЯ
ТАРГЕТНОЙ NGS-ПАНЕЛИ
Результаты. Эффективность включения Гр B и трипсина в липосомы составляла более 90%. Размер полученных липо-сом составлял около 320 нм. Клетки линий mel Kor и SK-BR-3 погибали в присутствие липосом с трипсином (p <0,01 для обеих линий). Цитотоксичность 0,5 мг/мл липосом на линии mel Kor составила 22%. IC50 определить не удалось, так как не наблюдалось гибели 50% клеток.
Выводы. Как Гр B, так и трипсин могут быть помещены в липосомы, причём липосомы с трипсином обладали цито-токсической активность. В дальнейших экспериментах мы планируем создать липосомы с рекомбинантным гранзимом B человека, и добавить к поверхности липосом антитела к антигену CD22. Планируется определить цитотоксическую активность полученной лекарственной формы на клетках CD22-экспрессирующих лимфом и B-клеточных лимфоид-ных лейкозов.
1Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии
и трансфузиологии федерального медико-биологического агентства», г. Санкт-Петербург 2Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова Министерства Обороны Российской Федерации», г.Санкт-Петербург 3Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова министерства здравоохранения Российской Федерации», г. Санкт-Петербург
Введение. Технологии секвенирования нового поколения (Next-generation sequencing, NGS) произвели революцию в подходах к молекулярно-генетическим исследованиям, сделав возможным определение мутационного статуса, генетической и
эпигенетической изменчивости хронического лимфолейкоза (ХЛЛ). Идентификация драйверных мутаций позволяет глубже понять патогенез ХЛЛ, стратифицировать пациентов на прогностические группы и выбирать терапию в соответствии
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVII, № 2, 2021
с молекулярным профилем заболевания. Кроме того, данные исследования способствуют созданию и внедрению в клиническую практику новых таргетных препаратов и их комбинаций для лечения ХЛЛ.
Цель. Апробировать «Лимфоидную таргетную NGS панель генов» у пациентов с ХЛЛ, оценить мутационный профиль и изучить его возможную корреляцию с клиническими характеристиками заболевания.
Материалы и методы. В исследование было включено 27 пациентов с ХЛЛ: нелеченые (n=19) и рецидивирующие/рефрактерные (n=8). Всем пациентам диагноз ХЛЛ был верифицирован в соответствии с критериями iwCLL (iwCLL, Hallek et al., 2018). Согласно цитогенетическому анализу, пациенты были разделены на три прогностические группы: благоприятная (n=16), нейтральная (n=2) и неблагоприятная (n=9). При этом, 20 из 27 пациентов были разделены на две прогностические группы с учетом данных о мутационном статусе вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (IGHV): благоприятная (n=8) и неблагоприятная (n=12). У семи пациентов данные о мутационном статусе IGHV отсутствуют. Все пациенты имели показания к началу лечения. Схемы лечения: стандартные ритуксимаб-содержащие (n=16) и таргетные препараты (ибру-тиниб (n=3), венетоклакс (n=1), акалабрутиниб (n=5), комбинация венетоклакс и акалабрутиниб (n=2). Секвенирование. «Лимфоидная таргетная NGS панель генов» была разработана как комплексная панель генов 117 генов, часть из которых играет ключевую роль в сигнальных клеточных путях. Образцы ДНК пациентов были получены из В-лимфоцитов крови стандартным фенол-хлороформным методом. Секвенирование проводилось на платформе MiSeq (Illumina, USA) со средней глубиной прочтения 1000х. При анализе полученных данных применялся 2% порог частоты встречаемости аллеля (VAF). Клиническая значимость выявленных мутаций оценивалась с помощью баз данных COSMIC, ClinVar, gnomAD с применением in silico анализа (Cscape, Cancer Genome Interpreter, SNPs&Go).
Результаты. Было выполнено секвенирование 18 образцов пациентов. Генетические аберрации были обнаружены во всех образцах ДНК. Мы идентифицировали 776 вариантов в 85/117 генах. Частыми мутациями были KMT2C (13,7%), FAT1 (13,2%), и RYR1 (4,3%). Клиническая значимость 81,9% вариантов была определена как вероятная доброкачественная (n=370) и доброкачественная (n=258). Значение 16% (n=123) мутаций определено как неизвестное. Патогенные и вероятные патогенные мутации были идентифицированы у 72,2% пациентов (13/18) с неблагоприятным прогнозом (неблагоприятный прогноз по цитогенетике/FISH с мутированным IGHV или без него). Патогенные мутации 1,7% (n=13): SF3B1 K700E (n=3), SF3B1 G742D, TP53 Lys120Glu, NOTCH1 P2514fs*4, NOTCH1 Q2404*, BRAF D594G, BRAF K601N, PTEN (c.1321-2A> T), MGA R1246X, JAK3 V722L, IDH2 T352P. Вероятно патогенными вариантами (n=3) были ATM Y2080, CNF1 M2217V и XPO1 E571K. Обнаруженный вариант мутации (Lys120Glu) в гене TP53 часто связан с наличием делеции 17p13, что подтверждено методом FISH и коррелирует с неблагоприятным клиническим течением заболевания у пациента CLL-024. У трех пациентов с del13q14 была патогенная мутация SF3B1 K700E, которая ускоряет развитие ХЛЛ за счет альтернативного сплайсинга РНК и активации mTORC1. Следует отметить, что у двух пациентов (CLL-023, CLL-024) с неблагоприятным прогнозом были обнаружены мутации в генах BCR и NOTCH2 неопределенной значимости. Существующий подход к интерпретации результатов не позволяет сделать однозначный вывод о клинической значимости вариантов в генах IDH2 и JAK3, несмотря на известное патогенное действие вариантов.
Выводы. Полученные данные демонстрируют апробацию «Лимфоидной таргетной NGS панели генов» и возможность применения NGS в рутинной клинической практике. Учитывая, что клиническое значение части мутаций в настоящее время не определено, необходимы дальнейшие исследования с использованием технологии NGS.
Е.В. Морозова, Ю.Ю. Власова, М.В. Барабанщикова, Т.А. Рудакова, К.С. Юровская, Д.К. Жоголев, И.О. Туртанова, Т.Л. Гиндина, И.М. Бархатов, И.С. Моисеев, А.Д. Кулагин
РОЛЬ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ С АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИЕЙ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
«Научно-исследовательский институт детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М.Горбачевой»
Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И.П. Павлова», г. Санкт-Петербург
Введение. Дополнительные хромосомные аберрации (ДХА) высокого риска служат одним из предикторов развития бластного криза и входят в число неблагоприятных прогностических факторов у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ). Многие пациенты приобретают ДХА на «продвинутых» фазах заболевания, большинству из них показано проведение аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК).
Цель. Оценить эффективность алло-ТГСК в ретроспективной когорте пациентов с ДХА.
Материалы и методы. В исследованную когорту включены 42 пациента, у которых на этапе до алло-ТГСК были выявлены ДХА. В 37 (88%) случаях были выявлены ДХА, ассоциированные с высоким и в 5 (12%) случаев - с низким риском. После выявления ДХА терапия менялась в 41 (98%) случае. В 38 (91%) случаях ДХА были выявлены в Р^положительных, и в 4 (9%) - в Р^отрицательных клетках. У большинства (26, 62%) пациентов определялся комплексный кариотип. Все пациенты получили алло-ТГСК с режимом кондиционирования со сниженной интенсивностью доз , состоящим из флудараби-на в дозе 180 мг/м2 и бусульфана (8-12 мг/кг) или мелфалана (140 мг/м2).
Хромосомные аберрации описывались согласно критериям ISCN 2016. Стратификация ДХА по группам риска выполнялась согласно рекомендациям R. НеЫтапп и соавт.( 2020 г.). Общая выживаемость (ОВ) определялась как число дней от даты алло-ТГСК до даты смерти, а безрецидивная выживаемость (БРВ) - как число дней с момента проведения алло-ТГСК до рецидива или смерти.
Результаты. Медиана срока наблюдения после алло-ТГСК составила 31 (1-123) месяц. Приживление трансплантата зафиксировано у 38 (91%) пациентов. Кумулятивный риск смерти, не связанной с рецидивом заболевания, к дню +100 и через 1 год после алло-ТГСК составил 10% и 20% соответственно. Острая реакция трансплантат-против-хозяина (оРТПХ) 2-4 степени была зафиксирована у 9 (21%), оРТПХ 3-4 степени -у 7 (17%), а легкая, средняя или тяжелая форма хронической РТПХ - у 2 (5%), 5 (14%) и 1 (3%) пациента соответственно. Трехлетний кумулятивный риск рецидива составил 46%. В 4 случаях развился молекулярный ( МР), в 3 -цитогенетический ( ЦР) и в 10 - гематологический рецидив (ГР). В 7 случаях при рецидиве были зафиксированы ДХА, аналогичные в 5 случаях с теми, что выявлялись перед алло-ТГСК. Во всех случаях кроме одного ДХА выявлялись при ГР. В этих случаях в даль-
