CC BY
7
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVII, № 2, 2021
Латыпова М.В., Петрова И.А., Грачева Т.Ю., Рябикова Е.С., Морозова Е.В., Мамаев Н.Н., Гиндина Т.Л., Кулагин А.Д.
ВЛИЯНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ АБЕРРАЦИЙ НА РЕЗУЛЬТАТЫ АЛЛО-ТГСК У ПАЦИЕНТОВ С МДС
«Научно-исследовательский институт детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой» Федерального Государственного Бюджетного Образовательного Учреждения высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И.П. Павлова», г.Санкт-Петербург
Введение. Цитогенетические аберрации являются важным прогностическим фактором у пациентов с миелоди-спластическим синдромом (МДС). Однако, существующая схема оценки цитогенетического риска основана на группах пациентов, леченных с помощью поддерживающей терапии, а не аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК).
Цель. Оценить влияние хромосомных аберраций на результаты алло-ТГСК в смешанной когорте пациентов с мие-лодиспластическим синдромом.
Материалы и методы. В исследование включено 70 пациентов с различными вариантами МДС, которым в период с 2008 по 2020 годы была проведена алло-ТГСК в клинике НИИ ДОГиТ им. Р.М. Горбачевой. Возраст больных варьировал от 1 года до 67 лет (медиана - 36 лет). Среди них было 14 (20%) детей и 56 (80%) взрослых с первичным и вторичным МДС (62 и 8 больных соответственно). Трансформация в ОМЛ после алло-ТГСК имела место у 5 (7%) пациентов. Алло-ТГСК от совместимого неродственного и совместимого родственного доноров была проведена у 51 (73%) и 13 (18%) больных соответственно. У 6 (9%) пациентов ТГСК выполнена от гапло-идентичного донора.
Результаты. Численные и структурные хромосомные аномалии были обнаружены у одинакового числа больных (п=19, 27%). Сочетание численных и структурных хромосомных нарушений имело место у 14 (20%) пациентов. Нормальный кариотип был представлен в 18 (26%) наблюдениях. Цитогенетические аномалии на момент алло-ТГСК были выявлены у 45 (64%) больных. По структуре выявленных цитогенетических нарушений когорта пациентов распреде-
лена на 5 групп по прогностической системе оценок IPSS-R. В группы «очень хорошего» и «хорошего» прогноза вошли 2 (3%) и 23 (33%) пациента соответственно. Группа «промежуточного» прогноза состояла из 11 (16%) пациентов, в то время как группы «плохого» и «очень плохого» прогноза были представлены 27 (38%) и 7 (10%) пациентами соответственно. Комплексный кариотип (с тремя и более аберрациями хромосом на метафазу) наблюдался у 8 (11%) пациентов. Один аномальный цитогенетический клон был выявлен у 41 (58%) больных, а два и более - у 11 (16%). Однофактор-ный анализ показал, что вероятность 3-летней общей выживаемости (ОВ) в объединенных группах «очень хорошего и хорошего», «промежуточного», «плохого и очень плохого» цитогенетического риска составила 63%, 45% и 25% соответственно (р=0,015). Вероятность 3-летней ОВ в отдельных цитогенетических группах пациентов: с моносомией 7, перестройкой локуса 3q26, делецией 5q, комплексным кари-отипом, моносомным кариотипом и прочими аберрациями составила 54%, 26%, 25%, 25%, 66%, 69% (р=0,03) соответственно, а 3-летней бессобытийной выживаемости - 38%, 42%, 0%, 25%, 33%, 51% (р=0,016) соответственно. Пациенты без комплексного кариотипа имели ОВ достоверно выше, чем без него (56% против 25%, р=0,015).
Выводы. Исследование показало, что прогностическая ценность хромосомных аберраций сохраняет свое значение в трансплантационной когорте пациентов с МДС. Комплексный, моносомный кариотип, перестройки локуса 3q26, деле-ция 5q оказывают неблагоприятный прогноз на выживаемость этой группы пациентов.
И.Е. Маслюкова1, Т.Н. Субботина1,2, Е.В. Мартынова3
ОПЫТ АНАЛИЗА СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ У ПАЦИЕНТОВ С ОСТРЫМ
МИЕЛОИДНЫМ ЛЕЙКОЗОМ
1Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский федеральный
университет», г. Красноярск 2Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный Сибирский научно-клинический центр ФМБА России», г. Красноярск
3Краевое государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Краевая клиническая больница», г. Красноярск
Введение. Мутации в генах FLT3 и NPM1 чаще остальных обнаруживают при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ): в 30-40 и 25-30 % случаях, соответственно. NPM1 мутации ассоциированы с благоприятным прогнозом и, как правило, не сочетаются с хромосомными перестройками. В свою очередь пациенты с FLT3 мутациями, а именно FLT3-ITD, имеют плохой прогноз, а также их рекомендуют определять при рецидиве ОМЛ. Одновременное присутствие FLT3-ITD и NPM1 мутаций повышает выживаемость, в отличие от FLT3-ITD в отсутствии NPM1. Также обращают внимание на FLT3-TKD мутации, которые могут быть ассоциированы с резистентностью к ингибиторам тирозинкиназ. Данные об эффекте сочетания NPM1 и FLT3-TKD на выживаемость в исследованиях разнятся.
За рубежом и в Европейской части России для обнаружения и количественного анализа FLT3 и NPM1 мутаций используют фрагментный анализ (предел обнаружения от
5-10% мутантного аллеля). В Красноярском крае пациентам с ОМЛ данный вид анализа ранее не проводился.
Цель. Провести анализ соматических мутаций в генах FLT3 и NPM1 у пациентов с ОМЛ в Красноярском крае.
Материалы и методы. Было исследовано 6 пациентов (возраст от 19 до 65 лет) проходивших лечение в 2020 году в КГБУЗ «Краевая клиническая больница». Пациент №1 имел вторичный ОМЛ в исходе из миелодиспластического синдрома с избытком бластов 1, пять остальных пациентов - первичный ОМЛ с разными фенотипами (№2 - М3, №3 - М2, №4 - М4, №5 - М0, №6 - не определен). Мутации FLT3-ITD, FLT3-TKD, NPM1, а также уровень аллельной нагрузки определяли методом фрагментного анализа. Для этого ПЦР-продукты с 5'-FAM флуоресцентными метками смешивали с GeneScan™ 500LIZ™ dye Size Standard (Applied Biosystems, USA) и подвергали капиллярному электрофорезу с помощью прибора «Генетический анализатор 3500» (Applied Biosystems, USA).
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ
Для анализа FLT3-TKD флуоресцентно-меченные ампликоны дополнительно гидролизовали рестриктазой EcoRV (СибЭн-зим, Россия). Положительные образцы секвенировали с использованием BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA).
Результаты. В результате проведения фрагментного анализа, исследуемые мутации были выявлены у троих из шести пациентов с ОМЛ. Наличие мутаций у этих пациентов было подтверждено секвенированием по Сенгеру. У пациента №1 с ранним рецидивом обнаружена FLT3-ITD мутация c.1774_1838-1dup, не представленная в COSMIC. Длина тан-демного повтора (ITD) составила 153 bp и по данным секве-нирования включает часть 14 экзона и весь 14 интрон. Уровень аллельной нагрузки мутации составил 18%. До нашего исследования образец костного мозга пациента был направлен в The Laboratory for Personalized Molecular Medicine (Germany). Диагностический тест методом ПЦР подтвердил наличие FLT3-ITD мутации. Также у этого пациента была обнаружена самая распространенная NPM1 мутация типа А c.860-863dup с аллельной нагрузкой 34%. Данные об анализе исследуемых мутаций у пациента в дебюте заболевания отсутствуют, однако хромосомных аномалии у него нет. У
пациента №2 с поздним рецидивом обнаружена наиболее распространенная FLT3-TKD c.2503G>T с уровнем аллельной нагрузки более 50%. Полученные данные были подтверждены методом аллель-специфичной ПЦР Лабораторией молекулярной гематологии НМИЦ Гематологии (Москва). Также есть данные, что у этого пациента выявлен PML-RARA.
У пациента №6 с ранним рецидивом обнаружена FLT3-ITD мутация с ITD длиной 99 bp и аллельной нагрузкой 5%. Сек-венирование подтвердило наличие мутации, т.к. на секвено-грамме видно окончание фрагмента дикого типа и продолжение мутантного фрагмента. Но из-за аллельной нагрузки, ниже порога обнаружения метода, достоверно определить вариант мутации не представляется возможным. Также есть данные, что в дебюте у этого пациента выявлен RPN1-EVI1.
Выводы. Впервые в Красноярском крае был использован метод фрагментного анализа для обнаружения и количественной оценки FLT3 и NPM1 мутаций у пациентов с ОМЛ. Использованный метод позволил выявить мутации у троих из шести пациентов с ОМЛ и провести количественную оценку уровня аллельной нагрузки. Кроме того, была выявлена новая FLT3-ITD мутация, не представленная в COSMIC и затрагивающая интронную область.
В.А. Мисюрин1, И.В. Ярош 2'3, М.В. Дмитриева1, А.А. Рудакова1, И.И. Краснюк3, М.А. Барышникова1
СИСТЕМА ДОСТАВКИ БЕЛКОВ С ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
В ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ
1Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения России, г. Москва
2Акционерное общество «Р-Фарм», г. Москва
3Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), Москва
Введение. Гранзим B (Гр B) является мощнейшим инициатором каспазного каскада и запуска апоптоза в клетке. Благодаря этому Гр B может использоваться как противоопухолевое средство. В настоящее время для доставки Гр B в опухолевую клетку используются CAR-T-лимфоциты. Подобные вакцины эффективны, но их производство сложно и требует больших затрат.
Цель. Разработать контейнеры для доставки Гр B и других протеолитических белков в опухолевую клетку.
Материалы и методы. В нашем исследовании использовались мышиный Гр B и трипсин. Эти белки были упакованы в липосомы по протоколу, предложенному Бенгхемом. Липо-сомы, содержащие трипсин, были добавлены в культураль-ную среду с клетками меланомы mel Kor и клеткам рака молочной железы SK-BR-3. Цитотоксический тест проводился методом МТТ. Для статистического анализа использовался критерий Уилкоксона.
М.А. Михалева1, И.С. Мартынкевич1, Е.В. Мотыко1, С.В. Петров1, И.А. Булдаков1, А.Ю. Кувшинов1, С.В. Волошин1,23
МУТАЦИОННЫЙ СТАТУС ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА: АПРОБАЦИЯ
ТАРГЕТНОЙ NGS-ПАНЕЛИ
Результаты. Эффективность включения Гр B и трипсина в липосомы составляла более 90%. Размер полученных липо-сом составлял около 320 нм. Клетки линий mel Kor и SK-BR-3 погибали в присутствие липосом с трипсином (p <0,01 для обеих линий). Цитотоксичность 0,5 мг/мл липосом на линии mel Kor составила 22%. IC50 определить не удалось, так как не наблюдалось гибели 50% клеток.
Выводы. Как Гр B, так и трипсин могут быть помещены в липосомы, причём липосомы с трипсином обладали цито-токсической активность. В дальнейших экспериментах мы планируем создать липосомы с рекомбинантным гранзимом B человека, и добавить к поверхности липосом антитела к антигену CD22. Планируется определить цитотоксическую активность полученной лекарственной формы на клетках CD22-экспрессирующих лимфом и B-клеточных лимфоид-ных лейкозов.
1Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии
и трансфузиологии федерального медико-биологического агентства», г. Санкт-Петербург 2Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова Министерства Обороны Российской Федерации», г.Санкт-Петербург 3Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова министерства здравоохранения Российской Федерации», г. Санкт-Петербург
Введение. Технологии секвенирования нового поколения (Next-generation sequencing, NGS) произвели революцию в подходах к молекулярно-генетическим исследованиям, сделав возможным определение мутационного статуса, генетической и
эпигенетической изменчивости хронического лимфолейкоза (ХЛЛ). Идентификация драйверных мутаций позволяет глубже понять патогенез ХЛЛ, стратифицировать пациентов на прогностические группы и выбирать терапию в соответствии
