CC BY
192
УДК: 616.33-018.25-092.
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА БЕСПОРОДНЫХ БЕЛЫХ КРЫС, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В
ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Черанева М.В.
ФГОУ ВПО «Пермская государственная сельскохозяйственная академия
имени академика Прянишникова»
Ключевые слова: неинбредные белые крысы, слизистая оболочка желудка, иммуногистохимические исследования, муцин MUC 5AC, Fas ligand, регуляторный протеин Ki-67.
Key words: intact outbred white rats, gastric mucosa,
immunohistochemical investigations, mucin MUC 5AC, Fas ligand, regulatory protein Ki-67.
Введение. Неэрозивные и эрозивно-язвенные поражения верхних отделов желудочно-кишечного тракта (хронический гастрит,
гастродуоденит, язвенная болезнь) чрезвычайно распространены как в человеческой популяции, так и у домашних животных [6], в связи с чем возникла необходимость в исследовании гистологического строения слизистой оболочки желудка (СОЖ) человека и млекопитающих и, в частности, белых крыс, поскольку неинбредные белые крысы широко используются для воспроизведения в экспериментальных условиях патологии человека и доклинической апробации новых лекарственных препаратов. Кроме того, необходимо детальное исследование процессов пролиферации и апоптоза в эпителии СОЖ, характера муцинов, продуцируемых эпителиоцитами слизистой желудка, закономерностей изменения характера их зонального распределения.
Цель настоящей работы - иммуногистохимическое, гистологическое и гистохимическое исследование слизистой оболочки желудка неинбредных белых крыс.
Материалы и методы исследования. В эксперименте использовано 30 неинбредных белых крыс четырехмесячного возраста обоего пола со средней массой тела 170,5±9,1 г, содержащихся в стандартных условиях вивария, имеющих свободный доступ к пище и воде и 12-14-часовой световой день. Животные получали типовой рацион вивария в соответствии с нормами, утвержденными приказом Министра здравоохранения СССР от 10 марта 1966 г. № 163 и Приказом Минздрава СССР от 10.10.83 № 1179, п. 4.1. Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу
Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г.
Для отбора образцов стенки желудка животных выводили из эксперимента с соблюдением правил эвтаназии. Гистологические препараты готовили в соответствие со стандартными методиками. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и пикрофуксином по ван Гизону. Для гистохимического выявления муцинов использовали ШИК-реакцию с постановкой контрольных реакций, окраску альциановым синим при рН 2,5 (для выявления кислых несульфатированных гликозаминогликанов) и рН 0,5-1,0. Для проведения полуколичественной оценки результатов и расчета среднего цитохимического коэффициента (СЦК) пользовались принципом Астальди и Берга (1967), основанным на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски клеток. Подсчет клеток в гистологических препаратах осуществляли при увеличении микроскопа х 400 на тестовой площади 0,042 мм .
При проведении иммуногистохимических исследований применяли антитела и полный диагностический набор компании Diagnostic BioSystems (USA), предназначенный для проведения экспериментальных исследований. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, заключали в канадский бальзам и исследовали в проходящем свете микроскопа при увеличении х 600. Оценка интенсивности пероксидазной метки и определение индекса пролиферации проводились полуколичественным методом: учитывалось число позитивных результатов на 100 учтенных ядер (при подсчете 500-1000 клеток) [3]. Гибель клеток в форме апоптоза в эпителиоцитах толстой кишки определяли по индексу апоптоза (1АПТ) по формуле: 1АПТ (%) = N (число апоптозных клеток, позитивных к Fas Ligand)/N1 (общее число клеток)*100 [5].
С целью выявления пролиферативной активности в слизистой оболочке желудка использовали моноклональные антитела к регуляторному протеину Ki-67 (Rabbit Monoclonal Antibody to Human Ki-67, Clone SP6, Isotype IgG). Активность апоптоза изучали с помощью иммуногистохимического исследования экспрессии Fas ligand на поверхности эпителиальных клеток (Polyclonal Rabbit Antibody to Fas Ligand). Для идентификации муцинов использовали моноклональные антитела к муцину MUC 5АС (Monoclonal Mouse Antibody to Mucin 5AC / Gastric Mucin, Clone 45M1, Isotype IgG1).
Результаты и их обсуждение. Стенка желудка неинбредных белых крыс представлена слизистой оболочкой, подслизистой основой, мышечной и серозной оболочками. Слизистая оболочка пищеводного отдела образована многослойным ороговевающим эпителием, собственной соединительнотканной пластинкой и мышечной пластинкой слизистой
оболочки (lam. muscularis mucosae). Переход многослойного эпителия в железистую часть хорошо визуализируется. Слизистая оболочка
о / \ о \
железистой (фундальной, кардиальной и пилорической) части представлена однослойным однорядным цилиндрическим эпителием, выстилающим желудочные ямки, в основание которых открываются железы желудка. Подслизистая основа, представленная соединительной тканью, не содержит желез. Мышечная оболочка хорошо развита и состоит из трех слоев. Снаружи желудок покрыт серозной оболочкой, состоящей из однослойного плоского эпителия — мезотелия и слоя соединительной ткани.
Иммуногистохимические исследования выявили экспрессию муцина MUC5АС в цитоплазме клеток ямочного эпителия при отсутствии окрашивания цитоплазмы эпителиоцитов желез.
При гистохимическом исследовании слизистой оболочки желудка при окрашивании по методу ШИК интенсивная реакция обнаружена в эпителиальных клетках в области желудочных ямок и шеек желудочных желез. В теле желез выявляются единичные слабоокрашенные эпителиальные клетки, ШИК-положительный секрет которых сосредоточен в апикальной части клетки. Отношение ШИК-реакции к диастазе и фенилгидразину позволяет считать, что в состав секрета входят нейтральные муцины. Установленный в гистохимических исследованиях СЦК составил 2,4 ± 0,082 (табл. 1).
1. Результаты полуколичественного определения интенсивности окрашивания эпителиальных клеток (значения СЦК) при гистохимической идентификации состава муцинов СОЖ интактных неинбредных белых
крыс
Метод окрашивания Идентифици- руемые мукополиса- хариды Зона максимальной интенсивности окрашивания Значения СЦК в зоне максимальной интенсивности окрашивания
Реактив Шиффа (ШИК-реакция) Нейтральные муцины Эпителий желудочных ямок 2,4 ± 0,082
Альциановый синий, рН-2,5 Кислые муцины Эпителиоциты дна и тела желудочных желез 1,51 ± 0,057
Альциановый синий, рН-1,0 Сульфомуцины Эпителиоциты дна и тела желудочных желез 0,96 ± 0,034
Кислые гликозаминогликаны в эпителии СОЖ животных выявлялись преимущественно в эпителиоцитах дна и частично тела желудочных желез. При полуколичественном определении интенсивности окрашивания СЦК составил 1,51 ± 0,057 (табл. 1).
Сульфатированные гликозаминогликаны в эпителии СОЖ интактных животных также выявлялись только в эпителиоцитах дна и тела желудочных желез. При полуколичественном определении интенсивности окрашивания СЦК составил 0,96 ± 0,034 (табл. 1).
Известно, что нейтральные муцины, гистохимически выявляемые ШИК-реакцией, иммуногистохимически - при идентификации MUC 5AC, выявляются в поверхностных отделах слизистой оболочки желудка, им отводится протективная, защитная роль, а кислые муцины, выявляемые при окраске препаратов альциановым синим с рН-2,5, в норме выявляются в глубоких отделах СОЖ, выполняют протективную роль [4]. Наибольшее количество ШИК-позитивной слизи содержится в ямочном эпителии, в условиях патологии - в эпителиоцитах фундальных желез [2]. Таким образом, локализация MUC5АС и нейтральных и кислых мукополисахаридов в эпителии СОЖ интактных животных соответствует таковой в эпителии СОЖ человека, что позволяет использовать неинбредных белых крыс в качестве экспериментальной модели при исследовании поражений желудка в экспериментах на животных.
Исследование экспрессии регуляторного протеина Ki-67 в слизистой оболочке желудка крыс показало низкий уровень клеточной пролиферации. При этом пролиферирующие клетки выявлялись, в основном, в эпителии шейки и перешейка желудочных желез. Количественная оценка уровня пролиферации эпителиоцитов в этой экспериментальной группе соответствовала индексу пролиферации 12,34±1,16%.
У животных контрольной группы в эпителии желудочных ямок выявлена низкая экспрессия Fas Ligand, количественно оцениваемая как индекс апоптоза=4,52±0,38%, что также согласуется с литературными данными - 3,9±0,32 [1].
Выводы. При проведении морфологического исследования стенки желудка интактных неинбредных белых крыс установлено, что ее строение соответствовало нормальному с учетом особенностей данного вида.
1. Гистохимическими исследованиями в эпителии СОЖ интактных неинбредных белых крыс при окрашивании Шифф-йодной кислотой нейтральные мукополисахариды выявлялись преимущественно в цитоплазме эпителиоцитов желудочных ямок и шеек желудочных желез. Напротив, кислые мукополисахариды, а также сульфомуцины в эпителии СОЖ интактных животных обнаруживались в эпителиоцитах дна и тела желудочных желез.
2. При проведении иммуногистохимических исследований экспрессия муцина MUC5АС была выявлена в цитоплазме клеток ямочного эпителия при отсутствии окрашивания цитоплазмы эпителиоцитов желез, что соответствует типичному зональному распределению муцинов в желудке млекопитающих.
3. В СОЖ интактных животных выявлен низкий уровень клеточной пролиферации; при этом пролиферирующие клетки выявлялись, в основном, в эпителии шеек желудочных желез.
4. В СОЖ интактных неинбредных белых крыс выявлена низкая экспрессия Fas Ligand.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Аскаров, М.Б. Трансплантация аутологичных клеток костного мозга для лечения длительно незаживающих язв желудка: автореф. дис. ... д-ра мед. наук/М.Б. Аскаров - М., 2009. - 46 с. 2. Вусик, М.В. Клинико-морфологическая оценка результатов эндоскопической лазерной терапии у больных раком желудка в ранние сроки после дистальных субтотальных резекций / М.В. Вусик, Н.Г. Крицкая, В.А. Евтушенко // Сибирский онкологический журнал. - 2006. - №3. - Т. 19. -С. 34-40. 3. Корсакова, Н.А. Оценка степени злокачественности
эпителиальных новообразований толстой кишки на основе определения иммунофенотипа опухолевых клеток: автореф. дис. . к-та мед. наук / Н.А. Корсакова. - М., 2007. - 23 с. 4. Лининг, Д.А. Пролонгированная оценка обратного развития морфологических изменений слизистой оболочки желудка в результате эрадикации Helicobacter pylori / Д.А Лининг: автореф. дисс... канд. мед. наук. / Омск, 2006. - 23 с. 5. Осадчук, О.М. Показатели пролиферации и апоптоза в патогенезе и прогнозировании течения заболеваний желудка, ассоциированных с Helicobacter pylori / О.М. Осадчук, Н.Ю. Коган, И.М. Кветной // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2004. - Т. 17, № 4. - С. 20-24. 6. Приворотский, В.Ф. Хронические гастриты и гастродуодениты у детей /
B.Ф. Приворотский, Н.Е. Луппова // Рос. сем. врач. - 2003. - Т. 7. - № 1. -
C. 50-61.
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА
БЕСПОРОДНЫХ БЕЛЫХ КРЫС, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Черанева М. В.
Резюме
Представлена подробная характеристика слизистой оболочки желудка (СОЖ) интактной неинбредной белой крысы, широко применяемой российскими исследователями в экспериментальных целях с использованием современных иммуногистохимических, гистологических и гистохимических методик. Охарактеризовано нормальное распределение муцина MUC 5AC в СОЖ интактных животных, на основании экспрессии проапоптотического белка Fas ligand и экспрессии регуляторного протеина Ki-67 установлены индекс пролиферации (ИП) и индекс апоптоза (!АПТ) в эпителиоцитах СОЖ.
MORPHOMETRIC PARAMETERS OF OUTBRED WHITE RATS’ GASTRIC MUCOSA
USED FOR EXPERIMENTAL PURPOSES
Cheraneva M.V.
Summary
Detailed characteristics of gastric mucosa of intact outbred white rat widely used by Russian investigators for experimental purposes was given using modern histological, histochemical, immunohistochemical techniques. Normal distribution of mucin MUC 5AC in gastric mucosa of intact animals was characterized, proliferation index (PI) and apoptosis index (AI) in epithelial cells of gastric mucosa were established on the basis of proapoptotic protein Fas ligand expression and regular protein Ki-67 expression.
УДК 619:611.136+616-007.44:636.7
ФОРМИРОВАНИЕ АНАСТОМОЗОВ ПРИ УСТРАНЕНИИ ИНВАГИНАЦИИ КИШЕЧНИКА У СОБАК
Коритам А.Ш.
ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»
Ключевые слова: инвагинация, резекция кишки, анастомоз, вид анастомоза, швы.
Key words: intussusception, resection of the bowel, anastomosis, type of anastomosis, the sutures.
Резекция нежизнеспособного участка кишки в пределах здоровых тканей и создание кишечных анастомозов является основной задачей, выполнение которой обеспечивает восстановление проходимости кишечника и сохранение жизни животного при инвагинации (D. Ben^tt 1973;C.R. Bellenger, J.A. Beck 1994;).
Состоятельность анастомоза зависит, как известно, от степени травмирования тканей при их ушивании, развития адекватного воспаления, соблюдения правил асептики и антисептики, профилактики возможных расстройств кровообращения (С.А. Шалимов, 1989), а также применение швов, обеспечивающих их кооптацию и шовного материала, отвечающего предъявляемым к нему требованиям, в том числе биосовместимостью и биодеградацией.
Материал и методы исследований. Исследования проведены на кафедре акушерства и патологии мелких животных Казанской
