Научная статья на тему 'Моделирование НПВП-гастропатии в эксперименте на животных'

Моделирование НПВП-гастропатии в эксперименте на животных Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
194
73
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ НПВП-ГАСТРОПАТИЯ / «НАЙЗ®» / ГИСТОЛОГИЯ / МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА / ЭКСПРЕССИЯ РЕГУЛЯТОРНОГО ПРОТЕИНА KI-67 / МОРФОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ / ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ / РЕГУЛЯТОРНЫЙ ПРОТЕИН / “NISE” / EXPERIMENTAL NON-STEROID ANTIINFLAMMATORY PREPARATION -GASTROPATHY / HISTOLOGY / MONOCLONAL ANTIBODIES / REGULATORY PROTEIN KI 67 EXPRESSION / MORPHOMETRIC ANALYSIS / IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDIES / REGULATORY PROTEIN

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Самоделкин Е. И., Татарникова Н. А., Кульневская М. Н., Неклюдова В. В., Черанева М. В.

Разработана оригинальная модель НПВП-гастропатии у экспериментальных животных, получавших перорально нестероидный противовоспалительный препарат «Найз®» в сочетании с 5%-ным раствором аскорбиновой кислоты, В железистой части СОЖ (слизистая оболочка желудка) отмечались дистрофические изменения ямочного эпителия, увеличение количества париетальных клеток в дне желез фундального и кардиального отделов, появление в собственной пластинке слизистой оболочки большого количества гладких миоцитов, ее отек, краевое стояние лейкоцитов в просвете сосудов, гипертрофия мышечной пластинки слизистой оболочки, что выявлено при проведении морфометрических исследований. Иммуногистохимические исследования выявили активацию процессов апоптоза, аномальную пролиферацию эпителиоцитов в желудочных ямках и аномальную секрецию муцина MUC 5AC в эпителии желез, также характерную для НПВП-гастропатии.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Самоделкин Е. И., Татарникова Н. А., Кульневская М. Н., Неклюдова В. В., Черанева М. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

MODELLING JO THE NPVP-GASTROPATIA IN EXPERIMENT ON ANIMALS

In article the example of experimental modeling of Gastropatia is offered

Текст научной работы на тему «Моделирование НПВП-гастропатии в эксперименте на животных»

МОДЕЛИРОВАНИЕ НПВП-ГАСТРОПАТИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА ЖИВОТНЫХ

Е. И. САМОДЕЛКИН, доктор медицинских наук, профессор, Н. А. ТАТАРНИКОВА, доктор ветеринарных наук, профессор,

М. Н. КУЛЬНЕВСКАЯ,кандидат ветеринарных наук,

В. В. НЕКЛЮДОВА, соискатель,

М. В. ЧЕРАНЕВА, соискатель, Пермская ГСХА,

П. В. КОСАРЕВА, кандидат медицинских наук, заведующая патоморфологическим отделом ЦНИЛ ПГМА,

Л. А. ЧЕТВЕРТНЫХ, кандидат медицинских наук, доцент, Пермская ГМА

614045, г. Пермь, ул. Кирова, дом 124, кв. 11; тел. дом. 8-(343)-236-41-31; моб. 8-912-888-40-57.

Ключевые слова: экспериментальная НПВП-гастропатия, «Найз®», гистология, моноклональные антитела, экспрессия регуляторного протеина Ю-67, морфометрический анализ, иммуногистохимическое исследование, регуляторный протеин.

В современных условиях методологические подходы к экспериментальному моделированию различной патологии человека и животных определяются необходимостью обеспечить в эксперименте как можно более точное воспроизведение патологического процесса, лишенное побочных эффектов, искажающих результаты эксперимента. На сегодняшний день моделированию хронического гастрита посвящено достаточно большое количество научных работ. Тем не менее, поиск новых экспериментальных моделей продолжает идти по нескольким основным направлениям, и большое внимание уделяется воспроизведению в эксперименте хронического гастрита, обусловленного приемом нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП).

Актуальность изучения НПВП-гас-тропатии объясняется тем, что нестероидные противовоспалительные препараты относятся к числу наиболее распространенных лекарственных средств, часто назначаемых для лечения многих заболеваний воспалительного характера у людей и животных [1, 4]. При этом прием НПВП приводит к развитию острого гастрита через неделю после начала лечения практически в 100 % случаев [2].

В ветеринарной медицине ситуация в этой области еще более неблагоприятная, поскольку у животных во всех случаях для облегчения боли используются НПВП, так как применение наркотических анальгетиков в ветеринарной практике запрещено. Между тем, большая часть используемых в ветеринарии НПВП предназначена для лечения людей, и лишь некоторые специально разработаны для животных. Но и те, и другие НПВП обладают способностью индуцировать развитие НПВП-гастропатии. В связи с этим в современных условиях становится весьма актуальной моделирование

НПВП-гастропатии и апробация в эксперименте новых способов профилактики этой патологии.

Цель методика исследования.

Цель исследования - разработать экспериментальную модель НПВП-га-стропатии с помощью эксперимента на животных.

В эксперимент было взято 40 не-инбредных белых крыс. НПВП-гастро-патию моделировали по оригинальной методике («Способ моделирования гастропатии», положительное решение от 18.12.2009 г. о результате формальной экспертизы по заявке № 2009145268/14 от 12.11.2009 г.). В соответствии с задачей исследования сформированы следующие экспериментальные группы: I - интактные животные, в течение всего эксперимента находящиеся в стандартных условиях экспериментально-биологической клиники (вивария) и получавшие стандартный рацион, n=20 (контрольная группа); II - животные, получавшие в течение 21 дня per os смесь 5 % раствора аскорбиновой кислоты с препаратом «Найз®», (нимесулид; «Д-р Редди'с Лабораторис Лтд.», Индия, г. Хайдерабад) n=20 (опытная группа).

Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу N 755 Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г.) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.03.1986 г. в Центральной научно-исследовательской лаборатории Государственного учреждения высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е. А. Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», имеющего раз-

решение на работу с экспериментальными животными.

Забор гистологического материала осуществляли на 22 день эксперимента. Желудок забирали целиком, выдерживали в изотоническом растворе NaCl в течение 30 мин., затем фиксировали в 10 % забуференном по Лилли формалине (рН-7,2) в расправленном состоянии и наколотым на пробку. Для проведения гистологического исследования забирали образцы в пищеводном, кардиальном, фундальном и пилорическом отделах. Гистологические препараты готовили по стандартным методикам с заливкой в гистамикс, окрашивали гематоксилином, эозином и пикрофуксином по ван Гизону.

Для выявления пролиферативной активности в слизистой оболочке желудка (СОЖ) использовали моноклональные антитела к регуляторному пептиду Ki 67 (Rabbit Monoclonal Antibody to Human Ki 67), для идентификации муцина - моноклональные антитела к муцину 5АС (Monoclonal Mouse Antibody to Mucin 5AC / Gastric Mucin, Clone 45M1, Isotype IgG1, kappa), для идентификации клеток, находящихся в состоянии апоптоза, - по уровню экспрессии про-апоптотического белка Fas ligand (Polyclonal Rabbit Antibody to Fas Ligand). Также применялся полный диагностический набор компании Diagnostic BioSystems (USA), предназначенный для проведения экспериментальных исследований. Иммуногистохимические исследования проводили по стандартным протоколам [6] в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, заключали в канадский бальзам и исследовали в проходящем свете микроскопа при увеличении х 400.

Оценка интенсивности пероксидаз-ной метки и определение индекса пролиферации на основе экспрессии регуляторного протеина Ki 67 проводи-

№ 11-1 (77), 2010 г.

Аграрный вестник Урала

37

Таблица 1

Среднее количество обкладочных клеток в ячейке сетки «5х5» при увеличении микроскопа х600. Программный пакет BioVision

Экспериментальная группа Среднее количество (M±m) обкладочных клеток в ячейке сетки «5х5»

Контрольная группа (интактные животные) 1,625±0,272

Моделирование химического гастрита (найз) 2,684±0,203*

*p<0,05 по сравнению с контролем

Таблица 2

Индекс апоптоза в ямочном эпителии СОЖ, определяемый на основании выраженности экспрессии проапоптотического протеина Fas Ligand

Экспериментальная группа Индекс апоптоза (ІАПТ), %

Контрольная группа (интактные животные) 4,52±0,38

Моделирование химического гастрита (найз) 15,86±2,58*

*p<0,05 по сравнению с контролем

Таблица 3

Индекс пролиферации в эпителии СОЖ, определяемый на основании выраженности экспрессии регуляторного протеина Ю-67

Экспериментальная группа Индекс пролиферации (ИП), %

Контрольная группа (интактные животные) 12, 34± 1,16

Моделирование химического гастрита (найз) 29,54±2.46*

лись полуколичественным методом: учитывалось число позитивных на 100 учтенных ядер (при учете 500-1000 клеток) [3]. Гибель клеток в форме апоп-тоза в покровно-ямочном эпителии СОЖ определяли по индексу апоптоза (1АПТ) по формуле 1АПТ (%) = N (число апоптозных клеток, позитивных к Fas Ligand) / N1 (общее число клеток) ? 100 [5].

Морфометрический анализ включал измерение толщины слизистой оболочки, толщины мышечной пластинки слизистой оболочки, длины желудочных желез. Измерение гистологических объектов осуществляли при помощи окуляр-микрометра при увеличении микроскопа х 280. В целях обеспечения достоверности результатов, измерения проводили только в участках с продольно срезанными железами, в препарате осуществляли от 4 до 10 измерений. Кроме того, определяли количество обкладочных клеток в фун-дальных железах желудка крысы при помощи функции «Сетка» программного пакета BioVision, version 4,0 (Австрия).

Результаты исследований подвергнуты статистической обработке с применением программного пакета Biostat.

Результаты исследований.

Ни в одной из групп во время эксперимента не зафиксировано гибели животных. При проведении гистологического исследования образцов установлено, что стенка желудка интакт-ных животных во всех отделах имеет типичное гистологическое строение с учетом особенностей данного вида.

Морфометрические исследования в данной экспериментальной группе показали, что ширина слизистой оболочки в кардиальной части составляет в среднем 0,599 ± 0,076 мм, в пилорической части - 0,430 ± 0,128 мм; длина желудочных желез в кардиальной части составляет в среднем 0,494 ±

0,077 мм, в пилорической - 0,374 ±

0,091 мм; в фундальных железах желудка в ячейке сетки «5х5» при увеличении микроскопа х 600 в среднем обнаруживается 1, 625 ± 0, 272 клеток (табл. 1).

Иммуногистохимическое исследование образцов выявило в группе ин-тактных животных экспрессию муцина MUC5AC в цитоплазме клеток ямочного эпителия при отсутствии

Experimental non-steroid antiinflammatory preparation -gastropathy, “Nise”, histology, monoclonal antibodies, regulatory protein Ki 67 expression, morphometric analysis, immunohistochemical studies, regulatory protein.

*р<0,05 по сравнению с контролем

окрашивания цитоплазмы эпителиоци-тов желез. Известно, что поверхность слизистой оболочки желудка покрыта толстым слоем слизи, в состав которой входят муцины - гликопротеиды с высокой молекулярной массой, действующие как защитный буфер против соляной кислоты желудочного сока и различных внешних агентов [8]. В нормальной слизистой оболочке желудка присутствуют муцины МиС1, МиС5АС, МиСб, которые имеют характерную зональную схему распределения; в частности, распределение МиС5АС ограничивается цитоплазмой клеток поверхностного и ямочного эпителия и отсутствует в эпителиоцитах желудочных желез [11].

При исследовании экспрессии регуляторного протеина Ki 67 в слизистой оболочке желудка интактных крыс установлено, что у животных отмечался низкий уровень клеточной пролиферации: 12,34 ± 1,16 %. При этом пролиферирующие клетки выявлялись, главным образом, в эпителии шейки и перешейка желудочных желез. У животных контрольной группы в эпителии желудочных ямок выявлена низкая экспрессия Fas Ligand, количественно оцениваемая как индекс апоптоза, равный 4,52 ± 0,38%. Полученные результаты согласуется с литературными данными [5, 7].

Стенка желудка животных опытной группы также имела типичное строе-

ние. При проведении гистологического исследования мы не выявили каких-либо патологических изменений в без-железистой части желудка, исключая расширение и полнокровие сосудов собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы. В слизистой оболочке железистой части также отмечались сосудистые расстройства в форме отека соединительной ткани собственной пластинки СОЖ и подслизистой основы и полнокровия сосудов; в клетках ямочного эпителия выявлялась вакуолизация цитоплазмы, вакуолизация и гиперхромия ядер, а также ограниченные участки десква-мации и некроза эпителиальных клеток. В дне желез слизистой оболочки фундального отдела выявляли преобладание обкладочных (париетальных) клеток над главными: в среднем 2,684 ± 0,203 клеток в ячейке морфометрической сетки «5х5» (табл. 1), что является морфологическим эквивалентом гиперацидного состояния, а также дистрофические изменения эпителиальных клеток (вакуолизацию ядер и цитоплазмы). Слизистые клетки на отдельных участках СОЖ практически не выявлялись. В собственной пластинке слизистой оболочки желудка выявляли увеличение количества гладкомышечных клеток, отек и краевое стояние лейкоцитов в капиллярах и венулах. На ограниченных участках в собственной пластинке СОЖ находили скудную воспалительную инфильтрацию, представленную, главным образом, полиморфноядерными лейкоцитами и лимфоцитами.

Кроме того, в препаратах обнаруживалась гипертрофия мышечной пластинки слизистой оболочки желудка (результаты морфометрического ис-

следования в тексте).

При проведении иммуногистохи-мических исследований в данной экспериментальной группе выявлено нарушение зонального распределения муцина MUC5AC: данный антиген выявлялся, в основном, в эпителиоци-тах желудочных желез и практически не выявлялся в ямочном эпителии. Известно, что при НПВП-гастропатии более чем в 80 % случаев наблюдается аномальная экспрессия MUC5AC в пилорических железах [11]. Подобное распределение объясняется, по-видимому, тем, что в генезе НПВП-гастро-патии задействованы механизмы регулирования экспрессии различных видов муцина, которые могут контролироваться нестероидными противовоспалительными препаратами [11, 9]. При исследовании экспрессии про-апоптотического белка Fas Ligand (табл. 2) выявлена его выраженная экспрессия (1АПТ = 15,86 ± 2,58) в эпителии желудочных ямок, особенно в участках десквамации эпителиальных клеток с поверхности слизистой оболочки. Индекс пролиферации в СОЖ у животных данной экспериментальной группы составил 29,54 ± 2.46 %, причем большое количество пролиферирующих клеток выявлялось в ямочном эпителии. При НПВП-гастропатии отмечается экспрессия ядерного антигена пролиферирующих клеток Ki 67 в глубине ямок (табл. 3). По-видимому, усиление пролиферации происходит в ответ на повышение уровня гастрина в крови [10].

Выводы.

У экспериментальных животных, получавших в течение 21 дня перорально нестероидный противовоспалительный препарат «Найз®» в дозе 5

мг/кг в сочетании с 5 % раствором аскорбиновой кислоты, мы наблюдали развитие химического гастрита, а именно одной из его наиболее часто встречающихся форм - так называемой НПВП-гастропатии. При этом в слизистой оболочке желудка отмечались патоморфологические изменения, типичные для данной формы гастрита и идентичные гистологическим признакам поражения СОЖ, отмечаемым в клинике.

1. У экспериментальных животных с НПВП-гастропатией в СОЖ доминировали сосудистые расстройства, в железистой части отмечались дистрофические изменения ямочного эпителия, увеличение количества париетальных клеток в дне желез фундального и кардиального отделов; в собственной пластинке слизистой оболочки отмечалось появление большого количества гладких миоцитов, ее отек, краевое стояние лейкоцитов в просвете сосудов; гипертрофия мышечной пластинки слизистой оболочки.

2. При проведении морфометрических исследований установлено, что у животных опытной группы отмечалось достоверное увеличение средних показателей толщины слизистой оболочки желудка за счет увеличения ширины мышечной пластинки СОЖ и статистически достоверное увеличение числа обкладочных клеток в эпителии желез.

3. Иммуногистохимические исследования выявили активацию процессов апоптоза, аномальную пролиферацию эпителиоцитов в желудочных ямках и аномальную секрецию муцина Мис 5АС в эпителии желез, также характерную для НПВП-гастропатии

Литература

1. Алексеева А. В., Муравьев Ю. В. Подходы к прогнозированию риска возникновения гастропатий, вызванных нестероидными противовоспалительными препаратами // Тер. архив. Т. 72. № 5. 2000. С. 25-28.

2. Дроздов В. Н. Гастропатии, вызванные нестероидными противовоспалительными препаратами: патогенез, профилактика и лечение // Consilium medicum. Т. 7. № 1. 2005.

3. Корсакова Н. А. Оценка степени злокачественности эпителиальных новообразований толстой кишки на основе определения иммунофенотипа опухолевых клеток. Автореф. ... дисс. канд. мед. наук. Москва, 2007. 23 с.

4. Насонова В. А. Рациональное применение нестероидных противовоспалительных препаратов в ревматологии // Русский медицинский журнал. Т. 10. № 6. 2002. С. 302-307.

5. Осадчук О. М., Коган Н. Ю., Кветной И. М. Показатели пролиферации и апоптоза в патогенезе и прогнозировании течения заболеваний желудка, ассоциированных с Helicobacter pylori // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатоло-гии, колопроктологии. Т. 17. № 4. 2004. С. 20-24.

6. Петров С. В., Киясов А. П. Иммуногистохимическая диагностика опухолей человека / Руководство для врачей-морфологов. Казань, 1998.

7. Раскин Г. А. Онкоген HER2 в раке молочной железы: механизм влияния на поведение опухоли (сравнительное количественное иммуногистохимическое исследование). Автореф. . дисс. канд. мед. наук. Казань, 2007. 24 с.

8. Byrd J. C., Yan P., Sternberg L. et al. Aberrant expression of gland-type gastric mucin in the surface epithelium of Helicobacter pylori-infected patients // Gastroenterology. Vol. 113. 1997. P. 455-464.

9. Gaemers I. C., Vos H. L., Volders H. H. et al. A stat-responsive element in the promoter of the episialin/MUC1 gene is involved in its overexpression in carcinoma cells // J. Biol. Chem. Vol. 276. 2001. P. 6191-6199.

10. Kanda N., Seno H., Kawada M. et al. Involvement of cyclooxygenase-2 in gastric mucosal hypertrophy in gastrin transgenic mice // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. Vol. 290. № 3. 2006. P. 519-527.

11. Mino-Kenudson M., Tomita Sh., Lauwers G. Y. Mucin Expression in Reactive Gastropathy: An Immunohistochemical Analysis // Archives of Pathology and Laboratory Medicine. Vol. 131. № 1. P. 86-90.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.