CC BY
172
УДК 616.33-018.25-092.9
гистологическая и гистометрическая характеристики
слизистой оболочки желудка интактных неинбредных
белых крыс
Е. И. Самоделкин', П. В. Косарева', Л. А. Четвертных', О. В. Шинкарик', В. В. Неклюдова2, С. В. Никитин3, М. В. Черанева4
'Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е. А. Вагнера, 2Пермская государственная сельскохозяйственная академия им. ак. Д. Н. Прянишникова, 3Пермская краевая клиническая больница, г. Пермь, 4Ярославская областная ветеринарная лаборатория, г. Ярославль
С использованием современных гистологических, гистохимических, иммуногистохимических методик дана подробная характеристика слизистой оболочки желудка (СОЖ) интактной неинбредной белой крысы, широко применяемой российскими исследователями в экспериментальных целях. Охарактеризовано нормальное распределение муцина MUC 5AC в СОЖ интактных животных. На основании экспрессии проапоптотического белка Fas ligand и экспрессии регуляторного протеина Ki-67 установлены индекс пролиферации и индекс апоптоза в эпителиоцитах сОж.
Ключевые слова: интактные неинбредные белые крысы, слизистая оболочка желудка, иммуногисто-химические исследования, муцин MUC 5AC, Fas ligand, регуляторный протеин Ki-67.
Введение
В настоящее время в структуре хронических заболеваний органов пищеварения одно из первых мест занимают неэрозивные и эрозивно-язвенные поражения верхних отделов желудочно-кишечного тракта [4], в связи с чем в последние годы обозначились новые направления в исследовании гистологического строения слизистой оболочки желудка (СОЖ) человека и млекопитающих и, в частности, белых крыс, поскольку неин-бредные белые крысы являются основной моделью для воспроизведения в экспериментальных условиях патологии человека и доклинической апробации новых лекарственных препаратов.
Так, в последние годы были достигнуты значительные успехи в понимании биохимии муцинов. Установлено, что в состав му-
цинов, вырабатываемых эпителиоцитами СОЖ человека и белых крыс, входит муцин типа MUC 5AC, что было выявлено на основании анализа олигосахаридного состава муцинов и иммуногистохимическими исследованиями [8]. Показано, что при регенерации СОЖ после воздействия повреждающих агентов могут иметь значение сиаломуцины и сульфомуцины [8]. Немаловажное значение имеет выявление в СОЖ маркеров апоптоза, поскольку при различных видах гастрита имеют место как избыточная пролиферация эпителиоцитов, так и их усиленный апоптоз, который сопровождается изменением фактора некроза опухоли альфа (TNF-a), проапоптотического протеина Fas ligand, белка p53 [9, 11].
Тем не менее, на сегодняшний день информация в данной области еще очень неполная. Требуют уточнения и даже детально-
го исследования вопросы, касающиеся уровня пролиферации и апоптоза в эпителии СОЖ. Вопрос о характере муцинов, продуцируемых эпителиоцитами слизистой желудка, закономерностях изменения характера их зонального распределения до настоящего времени остается неизученным.
Цель исследования — гистологическое, гистохимическое, иммуногистохимическое исследования слизистой оболочки желудка интактных неинбредных белых крыс.
Материалы и методы
ИССЛЕДОВАНИЯ
В эксперименте использованы 25 неин-бредных белых крыс четырехмесячного возраста обоего пола, имеющих среднюю массу тела 177,5±9,7 г и содержащихся в стандартных условиях экспериментально-биологической клиники (вивария): свободный доступ к пище и воде и 12—14-часовой световой день. Животные получали типовой рацион вивария в соответствии с нормами, утвержденными приказом министра здравоохранения СССР от 10.03.1966 г. № 163 и Приказом Минздрава СССР от 10.10.1983 г. № 1179, п. 4.1. Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к Приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.03.1986 г.
Животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии, и осуществляли забор образцов исследуемого материала. Желудок забирали целиком, фиксировали в 10% забуференном по Лилли формалине (рН 7,2). Гистологические препараты приго-
товлены в соответствии со стандартными гистологическими методиками. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и пикро-фуксином по Ван Гизону. Для гистохимического выявления муцинов использовали ШИК-реакцию с постановкой контрольных реакций, окраску альциановым синим при рН 2,5 (для выявления нейтральных муцинов и кислых несульфатированных гликозами-ногликанов) и рН 0,5—1,0 (селективная идентификация сульфомуцинов) [10].
При проведении полуколичественной оценки результатов и расчете среднего цитохимического коэффициента (СЦК) пользовались принципом Астальди и Берга (1967) [7], основанным на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски клеток. В зависимости от интенсивности окрашивания эпителиоциты относили к четырем группам: с отрицательной реакцией (-), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++) [3]. Подсчет клеток в гистологических препаратах осуществляли при увеличении микроскопа ><400 на расстоянии 0,126 мм от собственной пластинки слизистой оболочки желудка при окрашивании препаратов аль-циановым синим и на расстоянии 0,126 мм от поверхности слизистой оболочки при окрашивании Шифф-йодной кислотой (учитывая преимущественную локализацию позитивно реагирующих на окрашивание клеток).
Для выявления пролиферативной активности в слизистой оболочке желудка использовали моноклональные антитела к регуля-торному протеину Ki-67, экспрессируемого клетками, находящимися в G1-, G2- и S-фазах митотического цикла (Rabbit Monoclonal Antibody to Human Ki-67, Clone SP6, Isotype IgG). Активность апоптоза изучали с помощью иммуногистохимического исследования экспрессии Fas ligand на поверхности
эпителиальных клеток (Polyclonal Rabbit Antibody to Fas ligand). Для идентификации муцинов использовали моноклональные антитела к муцину MUC 5АС (Monoclonal Mouse Antibody to Mucin 5AC/Gastric Mucin, Clone 45M1, Isotype IgG1). Для проведения иммуно-гистохимических исследований применяли полный диагностический набор компании Diagnostic BioSystems (USA), предназначенный для проведения экспериментальных исследований. Иммуногистохимические исследования проводили по стандартным протоколам, использовали позитивные и негативные контроли, рекомендованные фирмой-производителем. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, заключали в канадский бальзам и исследовали в проходящем свете микроскопа при увеличении *600. Оценка интенсивности пероксидазной метки и определение индекса пролиферации проводились полуколичественным методом: учитывалось число позитивных результатов на 100 учтенных ядер (при подсчете 500—1000 клеток) [2]. При определении экспрессии Ki-67 ядерная реакция любой интенсивности фиксировалась как позитивная; уровень пролиферации расценивался как низкий, если <15% клеток имели позитивную реакцию; как умеренный, если 15—30% ядер были позитивны на Ki-67; как высокий — при позитивной реакции более 30% клеток [6]. Гибель клеток в форме апоптоза в эпителиоцитах толстой кишки определяли по индексу апоптоза (1АПТ) по формуле: 1АПТ (%) = N (число апоптозных клеток, позитивных к Fas ligand)/N1 (общее число клеток)х100 [5].
Результаты и их обсуждение
Стенка желудка интактных неинбредных белых крыс имеет типичное строение и представлена слизистой оболочкой, подслизи-
стой основой, мышечной и серозной оболочками. Слизистая оболочка пищеводного отдела (безжелезная часть) образована многослойным ороговевающим эпителием, в котором визуализируется от 3 до 6 слоев плоских эпителиальных клеток без признаков ороговения, собственной соединительнотканной пластинкой и мышечной пластинкой слизистой оболочки (lam. muscularis mucosae). В эпителиальных пластах блестящий слой определяется не четко и лишь в части препаратов. Переход многослойного эпителия в железистую часть хорошо визуализируется. Слизистая оболочка железистой (фундальной, кардиальной и пилорической) части представлена однослойным однорядным цилиндрическим эпителием, выстилающим желудочные ямки, в основание которых открываются железы желудка.
В собственной пластинке слизистой желудка крысы местами определяются диффуз-но расположенные лейкоциты, среди которых преобладают лимфоциты и полиморф-ноядерные нейтрофилы. Мышечная пластинка и мышечная оболочка желудка образованы гладкомышечными клетками. Клетки мышечной пластинки расположены в один слой. Подслизистая основа, представленная соединительной тканью, не содержит желез. В ней находятся сосудистые сплетения и нервное подслизистое сплетение Мейсснера. Мышечная оболочка хорошо развита и состоит из трех слоев. Снаружи желудок покрыт серозной оболочкой, состоящей из однослойного плоского эпителия — мезотелия — и слоя соединительной ткани.
Гистохимическое изучение слизистой оболочки ДПК интактных животных показало, что при окрашивании по методу ШИК интенсивную реакцию обнаруживают эпителиальные клетки в области желудочных ямок и шеек желудочных желез (рис. 1). Наиболее интенсивно окрашены эпителиоциты желу-
дочных ямок. В теле желез выявляются единичные слабоокрашенные эпителиальные клетки, ШИК-положительный секрет которых сосредоточен главным образом в апикальной части клетки. Отношение ШИК-реакции к диастазе и фенилгидразину позволяет считать, что в состав секрета входят нейтральные муцины. Установленный в гистохимических исследованиях СЦК составил 2,4±0,082.
Установлено, что кислые гликозамино-гликаны в эпителии СОЖ интактных животных выявлялись только в эпителиоцитах дна и частично тела желудочных желез (рис. 2). При полуколичественном определении интенсивности окрашивания СцК составил 1,51±0,057.
Сульфатированные гликозаминогликаны в эпителии СОЖ интактных животных выявлялись только в эпителиоцитах дна и тела желудочных желез. При полуколичественном определении интенсивности окрашивания СЦК составил 0,96±0,034.
При проведении иммуногистохимиче-ских исследований экспрессия муцина МиС 5АС была выявлена в цитоплазме клеток ямочного эпителия (рис. 3) при отсутствии окрашивания цитоплазмы эпителиоцитов желез. Как известно, в нормальной слизистой оболочке желудка присутствуют муцины МиС1, МиС 5АС, МиСб, которые имеют характерную зональную схему распределения; в частности, распределение МиС 5АС ограничивается цитоплазмой клеток поверхностного и ямочного эпителия и отсутствует в эпи-телиоцитах желудочных желез [9]. Таким образом, локализация МиС 5АС в эпителии СОЖ интактных животных соответствует таковой в эпителии СОЖ человека, что позволяет использовать неинбредных белых крыс в качестве экспериментальной модели при исследовании поражений желудка в экспери-
Рис. 1.Выявление нейтральных гликозаминогликанов в СОЖ интактных животных. ШИК-реакция. у 600
Рис.2.Локализация кислых несульфатированных гликозаминогликанов (кислых мукополисахаридов) в эпителии СОЖ интактных неинбредных белых крыс. Окраска альциановьм синим,рН 2,5. у-600
Рис. 3. Экспрессия муцина МиС 5АС в цитоплазме эпителиоцитов желудочных ямок интактной неинбредной белой крысы. у-600
ментах на животных. При исследовании экспрессии регуляторного протеина Ki-67 в слизистой оболочке желудка интактных крыс установлено, что у животных отмечался низкий уровень клеточной пролиферации. При этом пролиферирующие клетки выявлялись в основном в эпителии шейки и перешейка желудочных желез. Количественная оценка уровня пролиферации эпителиоцитов в этой экспериментальной группе соответствовала индексу пролиферации 12,34±1,16%.
У животных контрольной группы в эпителии желудочных ямок выявлена низкая экспрессия Fas ligand, количественно оцениваемая как индекс апоптоза = 4,52±0,38%, что согласуется с литературными данными — 3,9±0,32 [1].
Выводы
При проведении морфологического исследования стенки желудка интактных неин-бредных белых крыс установлено, что ее строение соответствовало нормальному, с учетом особенностей данного вида.
Гистохимическими исследованиями в эпителии СОЖ интактных неинбредных белых крыс при окрашивании Шифф-йодной кислотой нейтральные мукополисахариды выявлялись исключительно в цитоплазме эпителиоцитов желудочных ямок и шеек желудочных желез. Кислые мукополисахариды, а также сульфомуцины в эпителии СОЖ ин-тактных животных выявлялись только в эпи-телиоцитах дна и тела желудочных желез.
При проведении иммуногистохимиче-ских исследований экспрессия муцина MUC 5АС была выявлена в цитоплазме клеток ямочного эпителия при отсутствии окрашивания цитоплазмы эпителиоцитов желез, что соответствует типичному зональному распределению муцинов в желудке млекопитающих. В СОЖ интактных животных выявлен
низкий уровень клеточной пролиферации; при этом пролиферирующие клетки выявлялись в основном в эпителии шеек желудочных желез. В СОЖ интактных неинбредных белых крыс выявлена низкая экспрессия Fas ligand.
Библиографический список
1. Аскаров М. Б. Трансплантация аутологич-ных клеток костного мозга для лечения длительно незаживающих язв желудка: ав-тореф. дис. ... д-ра мед. наук/М. Б. Аскаров.— М., 2009.— 46 с.
2. Корсакова Н. А. Оценка степени злокачественности эпителиальных новообразований толстой кишки на основе определения иммунофенотипа опухолевых клеток: ав-тореф. дис. ... канд. мед. наук/Н. А. Корсакова.- М., 2007.— 23 с.
3. Кост Е. А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования/ Е. А. Кост— М.: Медицина, 1975.— 87 с.
4. Осадчук М. А. Хронический гастрит с функциональной диспепсией: патогенетические особенности клинических проявлений/М. А. Осадчук, А. Л. Пахомова, И. М. Кветной///Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол.— 2002.— № 5.— С. 35—39.
5. Осадчук О. М. Показатели пролиферации и апоптоза в патогенезе и прогнозировании течения заболеваний желудка, ассоциированных с Helicobacter pylori/ О. М. Осадчук, Н. Ю. Коган, И. М. Кветной// Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., ко-лопроктол.— 2004.— Т. 17.— № 4.— С. 20— 24.
6. Раскин Г. А. Онкоген HER2 в раке молочной железы: механизм влияния на поведение опухоли (сравнительное количественное иммуногистохимическое исследование): автореф. дис. ... канд. мед. наук/ Г. А. Раскин— Казань, 2007.— 24 с.
7. Шубич М. Г. Значение ШИК-метода в гистохимическом анализе углеводных и углеводсодержащих биополимеров/ М. Г. Шубич, Г. М. Могильная//Архив анат., гистол. и эмбриол.— 1982.— № 5.— С. 90—93.
8. Goso Y. Evaluation of conditions for release of mucin-type oligosaccharides from glycoproteins by hydrazine gas treatment/ Y. Goso, D. Tsubokawa, K. Ishihara//Journal of Biochemistry.— 2009.— Vol. 145.— № 6.— P. 739—749.
9. Mino-Kenudson M. Mucin expression in reactive gastropathy: an immunohisto-chemical analysis/M. Mino-Kenudson, Sh. Tomita, G. Y. Lauwers//Archives of Pathology and Laboratory Medicine.— 2006.— Vol. 131.— № 1.— P. 86—90.
10. Pearse A Histochemistry. Theoretical and applied/A. Pearse.— London, 1968.— 962 р.
11. Tsuji S. Helicobacter pylori eradication to prevent gastric cancer: Underlying molecular and cellular mechanisms/S. Tsuji, M. Tsuji, H. Murata et al.//World J. Gastroenterol.— 2006.— Vol. 21.— № 12.— P. 1671—1680.
12. Von Herbay A. Role of apoptosis in gastric epithelial turnover/A. von Herbay, J. Rudi// Microscopy Research and Technique.— 2008.— Vol. 48.— № 5.— P. 303—311.
E. I. Samodelkin, P. V. Kosareva,
L. A. Chetverthykh, O. V. Shinkaric, V. V. Neklyudova, S. V. Nikitin, M. V. Cheraneva
HISTOLOGICAL AND HISTOMETRIC CHARACTERISTICS OF INTACT
NONINBRED WHITE RAT STOMACH MUCOSA
Modern histological, histochemical, immunohistochemical methods were used to give a detailed characteristics of stomach mucosa (SM) of noninbred white rat widely applied by Russian investigators for experimental purposes. Normal distribution of mucin MUC 5AC in the stomach mucosa of intact animals was characterized; proliferation index and apoptosis index in SM epithelyocytes were established on the basis of proapoptotic protein Fas ligand and regular protein Ki-67 expression.
Keywords: intact noninbred white rats, stomach mucosa, immunohistochemical investigations, mucin MUC 5AC, Fas ligand, regular protein Ki-67.
Контактная информация: Самоделкин Евгений Иванович, доктор мед. наук, профессор кафедры патологической физиологии Пермской государственной медицинской академии им. ак. Е. А. Вагнера, 614000, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26, тел. 8 (342) 236-41-31
Материал поступил в редакцию 06.12.2010
