CC BY
64
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Вернигородский С.В., Мнихович М.В., 2014 УДК 616-003.972-071:616.342-002:616.33-002.44-022
ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ И ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ
КИШЕЧНОЙ МЕТАПЛАЗИИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА СВ. ВЕРНИГОРОДСКИЙ1, М.В. МНИХОВИЧ2,3
Винницкий национальный медицинский университет им. Н.И. Пирогова, г. Винница, Украина (1)
Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН, г. Москва (2) Рязанский государственный медицинский университет им.акад. И.П. Павлова, г. Рязань (3)
DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC EVALUATION
OF IMMUNOHISTOCHEMICAL MARKERS OF INTESTINAL METAPLASIA OF THE GASTRIC MUCOSA
S.V. VERNIGORODSKY1, M.V. MNIKHOVICH2,3
Vinnytsia National N.I. Pirogov Medical University, Vinnytsia, Ukraine (1) Research Institute of Human Morphology of the Russian Academy of Medical Sciences, Moscow (2)
Ryazan State I.P. Pavlov Medical University, Ryazan (3)
На основе патоморфологического анализа гастробиопсий изучена экспрессия иммуногистохимических маркеров при кишечной метаплазии (КМ) слизистой оболочки желудка (СОЖ). Показано, что наибольшую прогностическую и диагностическую ценность имеют транскрипционный фактор кишечной дифференциации (CDX2), цитокератин 7 (CK7), муцин (MUC 5 AC) и
маркер пролиферативной активности Ю-67. Предложен алгоритм патомор-фологической диагностики КМ СОЖ с использованием данных иммуноги-стохимических маркеров.
Ключевые слова: иммуногистохимические маркеры, кишечная метаплазия слизистой оболочки желудка.
The expression of molecular and biological markers in the intestinal metaplasia (IM) of the gastric mucosa on the basis of pathomorphological analysis was studied. It is shown that the follow useful prognostic and diagnostic value have been used: differentiation of intestinal transcription factor (CDX2), cytokeratin 7 (CK7), mucin (MUC 5 AC) and a marker of proliferative activity - Ki-67. The algorithm for pathomorphological diagnosis of gastric mucosa IM with using of im-munohistochemical markers was suggested.
Keywords: molecular and biological markers, intestinal metaplasia of the gastric mucosa.
В структуре злокачественных новообразований рак желудка (РЖ) занимает одно из ведущих мест, уступая только раку легкого. Удельный вес этой патологии в структуре онкологических заболеваний составляет 12,3% (у мужчин рак желудка занимает 2-е место -14,2%, у женщин 3-е место - 10,4%). Наиболее часто РЖ выявляется у лиц в возрасте 45-59 лет, хотя основной пик заболеваемости приходится на возрастную группу 70-74 года. Мужчины болеют почти в 2 раза чаще, чем женщины, причем эта разница с возрастом увеличивается [5]. Несмотря на некоторое снижение уровня заболеваемости раком желудка во всех странах мира, своевременная диагностика и лечение опухолей желудка остаются сложной и актуаль-
Введение
ной проблемой современной онкологии. Решение ее невозможно без определения основных факторов риска данного заболевания, выявления предраковых состояний и изменений СОЖ. Прогнозирование течения диспластических и метапластических процессов в СОЖ и формирование групп риска по РЖ позволит улучшить качество диагностики и снизить число больных им.
Предраковые изменения давно привлекают особое внимание исследователей, однако возможность морфологической диагностики предрака до настоящего времени дискутируется. Это объясняется тем, что понятие предрака является прогностическим, а постановка подобного диагноза конкретному пациенту может повлечь за собой лечебные мероприятия, оправ-
данность которых должна быть полностью аргументирована. Как известно, предупредить опухолевую прогрессию можно только при раннем выявлении злокачественного новообразования или своевременном лечении предопухолевых заболеваний, поэтому столь важную роль должно играть рациональное формирование групп онкологического риска.
В настоящее время к основным предраковым состояниям относят ХАГ и инфекцию Helicobacter pylori, а к основным предраковым морфологическим изменениям - кишечную метаплазию и дисплазию эпителия СОЖ [1, 7]. Центральное место в проблеме предраковых состояний желудка занимает ХАГ.
При целенаправленном эндоскопическом скрининге населения ранний РЖ обнаруживается в среднем на 10 лет раньше, чем местно распространенные опухоли. Рутинные методы обследования пациентов с РЖ и предраковыми состояниями практически не позволяют распознать патологический процесс на ранних стадиях [2, 3]. Это делает актуальным поиск чувствительных и специфичных методов диагностики, базирующихся на выявлении вовлеченных в формирование и прогрессию РЖ и предраковых состояний молекулярно-биологичеких маркеров.
Цель исследования
Изучение закономерностей экспрессии молекулярно-биологических
маркеров в клетках СОЖ при кишечной метаплазии для обоснования их диагностической и прогностической ценности.
Материалы и методы
В течение 6 лет обследовано 336 пациентов, которые были направлены в эндоскопические отделения и кабинеты для уточнения клинического диагноза. Мужчин среди них было 192 (57%), женщин - 144 (43%). За основную группу принято 68 больных с ХАГ и наличием КМ из-за подавляющей ассоциации последней с ХАГ. В группу сравнения вошли 30 человек, больных ХАГ без КМ. Средний возраст пациентов, которые были обследованы в динамике, составил 52,96 ± 1,13 года, средняя продолжительность заболевания на момент диагностики КМ - 2,6±0,63 года. В процессе фиб-роэзофагогастродуоденоскопии и хромоэндоскопии с 0,5% водным раствором метиленового синего выполняли множественные биопсии (по 2 биоптата из тела и антрального отдела желудка и 1 из области угла желудка) с учетом требований модифицированной Сиднейской системы диагностики хронического гастрита и из прокрашенных участков СОЖ с последующим гистологическим изучением биоптатов. Биопсийный материал фиксировали в 10% нейтральном формалине и после общепринятой обработки изготовляли парафиновые блоки, а из них - срезы 5-7 мкм тол-
щиной. Для определения метапласти-ческих изменений СОЖ использовали следующие методики: гистологические (окраска гематоксилином и эозином), гистохимические (окраска железистым диамином по Спайсеру, орсе-ином в сочетании с альциановым синим, альдегид фуксином по Гомори, альциановым синим при pH 1,0 и 2,5 в сочетании с ШИК-реакцией). Определение персистенции Н. руЬп в СОЖ проводилось с использованием быстрого уреазного теста, цитологического метода по Папенгейму, гистологического - окраской по Романовскому-Гимзе и толуидиновым синим. Имму-ногистохимические исследования выполняли на парафиновых срезах с использованием стрептавидин-биотинового метода (DAKO, Дания, LSAB2 Systems, HRP). Демаскировки антигена проводили в цитратном буфере с рН 6,0. В качестве первичных антител применяли мышиные и кроличьи моноклональные антитела. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера течение 15-60 секунд. Пролиферативную активность клеток оценивали с помощью мышиных мо-ноклональных антител к ядерному антигену Ki-67 (DAKO, клон MIB-1, Дания) по методу T. Scholzen, 2000 [8]. В препаратах при 400-кратном увеличении микроскопа определяли индекс пролиферации (ядерная метка Ki-67) и индекс апоптоза (перинукле-арная или цитоплазматическая метка
CPP32 - caspase-3) в 5 случайно выбранных полях зрения (>500 клеток) как долю в процентах положительно окрашенных ядер эпителиоцитов СОЖ в трех компартментах (1-й - поверхностный и ямочный эпителий; 2-й - перешеечная зона, 3-й - основа желез, средняя и нижняя треть желез базальных отделов). Аналогичным образом определяли индекс метки р53 - маркера повреждения ДНК, bcl-2 -супрессора апоптоза и CDX2 - транскрипционного фактора кишечной дифференциации. Для оценки экспрессии муцинов (MUC1, MUC2, MUC 5AC), цитокератинов (CK7, CK20) и карциноэмбрионального антигена (CEA) в СОЖ в аналогичных участках использовалась полуколичественная шкала оценки интенсивности окраски: 0 (отсутствует) - отсутствие положительной реакции в клетках, 1 (слабая) - до 30% клеток, которые отреагировали позитивно, 2 (умеренная) - 31-60%, 3 (сильная) - 60% и более окрашенных клеток [6].
Результаты и их обсуждение
Среди иммуногистохимических маркеров, которые были использованы нами, наиболее эффективными в динамике оказались CDX2, CK7, CK20, MUC 5AC, MUC2, HER2, Ki 67, p53, CEA.
MUC1 и bcl-2 не показали существенных изменений на протяжении 6 лет (p<0,05). Нами отмечены преобладание пациентов с CDX2-
положительным фактором при полной 1) и достоверное ф<0,05) уменьшение КМ (ПКМ) и неполной КМ (НКМ) во экспрессии CDX2 при повторных об-время первичного обследования (рис. следованиях.
Рис. 1. Сильная экспрессия CDX2 в ядрах абсорбтивных эпителиоцитов, бокаловидных клеток и желудочного эпителия. Хронический атрофический гастрит с полной кишечной метаплазией. Иммуногистохимическая окраска CDX2. А х 400, Б х 200
Экспрессия цитокератина 7 усиливалась со временем преимущественно в случаях с НКМ и при изменении гистологического фенотипа с полной на неполную КМ, экспрессия CK20 также усиливалась, однако преобладала у пациентов с ПКМ и при появлении тонкокишечного фенотипа у больных c НКМ. Весьма информативной в динамике оказалась экспрессия MUC 5 AC. Так, в течение 6 лет у пациентов с диспластическими изменениями, формирующимися микроаденомами его маркировка уменьшалась от выраженной (+++) к слабой (+). После эрадикации H. pylori наблюдалось незначительное повы-
шение экспрессии MUC 5AC (рис. 2), но выявленные изменения были недостоверными (p>0,05).
Маркировка MUC2 со временем усиливалась и не зависела от инфицирования H. pylori. Экспрессия трансмембранного рецептора тирозинкина-зы HER2 была характерной для НКМ и усиливалась на протяжении всего периода наблюдения. Положительная экспрессия р53 проявлялась преимущественно у пациентов с НКМ и дис-плазией тяжелой степени. Карцино-эмбриональный антиген встречался только в щеточной каемке больных с ПКМ и определялся в цитоплазме призматических клеток при прогрес-
Рис. 2. Выраженная экспрессия MUC 5AC в желудочных эпителиоцитах и призматическом эпителии в участках полной и неполной кишечной метаплазии после эрадикации H. pylori. Иммуногистохимическая окраска MUC 5AC. х 200
сировании НКМ. В динамике отмечали появление как ПКМ, так и НКМ, а у 53% пациентов присутствовали оба типа КМ в СОЖ. При динамическом наблюдении в случаях ПКМ гистологический тип не менялся у 41% больных в течение 6 лет, как у H. pylori положительных (+),так и у отрицательных (-) пациентов. Дисплазия легкой степени в участках, прилегающих к ПКМ, развилась в 6% случаев. В 59% у H. pylori (+) больных наряду с полным типом КМ был обнаружен неполный. У пациентов с НКМ отмечали прогрессирование диспластических изменений с возникновением диспла-зии тяжелой степени в 30%, аденом - в 15% случаев в течение 2 лет. У 3 больных с НКМ и 1 у одного с ПКМ был обнаружен РЖ при повторном обследовании через 5 месяцев в течение 1
года с момента первичной диагностики КМ, однако им выполняли повторную биопсию после диагностики КМ через 3 и 5 месяцев и проводили забор 6 гастробиоптатов для гистологического исследования. Это означает, что вскоре после постановки первоначального диагноза нужно проводить тщательную эндоскопическую и гистологическую оценку и в случае эндоскопически видимых поражений необходима резекция либо при помощи эндоскопии (эндоскопическая резекция слизистой) либо хирургическая. Наряду с неполным и полным типом КМ у 53% больных присутствовали оба типа КМ в СОЖ.
Из 30 пациентов с ХАГ без КМ у 3% отмечали появление дисплазии. Формирования аденом и возникновения рака не наблюдали.
В нашем исследовании распространение КМ коррелировало с возрастом больных и инфицированием H. pylori. Так, КМ наблюдалась преимущественно у пациентов старше 45 лет (средний возраст - 57,23±1,59 года). Мы не обнаружили определенной зависимости между степенью активности ХАГ и распространенностью КМ. По нашим данным, распространение КМ останавливалось у больных, которым была проведена эрадикация H. pylori, и прогрессировала у пациентов без таковой. При этом у последних на протяжении 6 лет площадь КМ увеличилась на 25% и у 18% пациентов перешла из субтотального в тотальный тип. Регрессивных изменений КМ после эрадикации инфекции мы не зарегистрировали.
Сопоставление результатов эндоскопической диагностики при общепринятой гастроскопии и хромогастро-скопии с метиленовым синим доказало достоверно (р<0,05) большую эффективность хромогастроскопии. Информативность метода очень высока, о чем свидетельствует совпадение результатов хромоэндоскопии c данными пато-гистологического исследования биоп-татов в 98% случаев против 75,5% при эндоскопии. Использование магнифи-кационной (НМЕ) и узкоспектральной (NBI) эндоскопии по сравнению с хро-могастроскопией позволяет определить макроскопические дифференциально-диагностические критерии КМ: для
ПКМ характерна ворсинчатая структура поверхности СОЖ, для НКМ -преимущественно сетчатая. Степень распространенности КМ имеет решающее значение для прогноза диспла-стических и неопластических изменений СОЖ. При ее объеме, который превышает 20% поверхности СОЖ, создаются условия для развития дис-плазии и аденокарциномы желудка.
Таким образом, динамическое наблюдение за пациентами с ХАГ с КМ позволяет выявить диспластиче-ские изменения эпителия и появление неопластических изменений на ранних этапах. В соответствии с нашими данными, наряду с прогрессировани-ем диспластических изменений у больных с неполной КМ, а именно распространение КМ из антрального отдела на тело и кардиальный отдел, является прогностически неблагоприятным в плане дальнейшей опухолевой трансформации.
Полученные результаты позволили предложить следующий алгоритм патоморфологической диагностики кишечной метаплазии СОЖ с использованием иммуногистохимиче-ских маркеров (рис. 3, 4).
1. Определение транскрипционного фактора кишечной дифференциации CDX2.
2. Определение дополнительных прогностических молекулярно-биологических маркеров в очагах КМ (СК7, MUC5AC, Хь67).
Рис. 3. Алгоритм определения транскрипционного фактора кишечной дифференциации у больных ХАГ с КМ. ЖЭ - желудочный эпителий. ПЭ - призматические эпителиоциты. БК - бокаловидные клетки
Рис. 4. Дополнительные прогностические маркеры прогрессии КМ
Выводы
Анализ литературы и наших исследований позволил выделить среди больных с ХАГ и КМ группу риска в плане развития РЖ, и определить программу их наблюдения с целью более глубокого и всестороннего клинико-инструментального исследования.
1. Пациенты, страдающие хроническим атрофическим гастритом с явлениями кишечной метаплазии СОЖ. Для наблюдения может быть использована общая схема при полной (тонкокишечной) слабой (занимает до 5% поверхности желудка) и умеренной (до 20%) метаплазии.
2. Общая схема наблюдения: чередование хромоэндоскопического исследования с морфологическим изучением многочисленных биоптатов любых очаговых изменений СОЖ с кратностью 1 раз в 2 года у лиц в возрасте 35-49 лет и ежегодно у лиц старше 50 лет. Ежегодное не реже 1 раза в год эндоскопическое наблюдение с гистологическим и цитологическим исследованием нескольких биоптатов при прогрессировании процесса - переходе от умеренной до тяжелой полной метаплазии (более 20%) или выявлении очагов неполной метаплазии.
3. Пациенты с хроническим атро-фическим гастритом и явлениями дис-плазии СОЖ. Для наблюдения может быть использована общая схема при слабой дисплазии. Прогрессирование процесса (появление признаков уме-
ренной дисплазии) требует перехода к схеме с ежегодным (1 раз в год) гистологическим исследованием нескольких биоптатов. Дальнейшее ухудшение степени дисплазии (тяжелая) не исключает онкотрансформацию, поэтому решается вопрос о дальнейшем наблюдения (эндоскопическое исследование 1 раз в 3 месяца, не менее 2 раз в год). Легкую и умеренную дисплазию рассматривают как регенераторную ати-пию, а не предрак. Ухудшение степени дисплазии свидетельствует о прогрес-сировании малигнизации, что повышает вероятность возникновения рака. Схема зависит от результатов гистологического исследования [4].
Таким образом, группы риска необходимо формировать по морфологическим критериям, общим для всех предраковых состояний желудка. Наличие неполной метаплазии, тяжелой дисплазии эпителия на фоне атрофического гастрита является, по данным многих авторов, абсолютным показанием к динамическому наблюдению за больными, включению их в группы высокого риска развития РЖ. Необходимо более тесное сотрудничество врачей патогистологических лабораторий с клиницистами, что будет способствовать улучшению диагностики и дальнейшей тактики ведения пациентов с предраковыми состояниями и изменениями СОЖ.
Использование иммуногистохи-мических маркеров наряду с хорошо
известными и широко применяемыми гистохимическими прогностическими факторами позволит более точно проводить диагностику кишечной метаплазии СОЖ, прогнозировать течение заболевания и своевременно осуществлять коррекцию лечения.
Литература
1. Бабак О.Я. Хронический атрофический гастрит - точка отсчета начала канцерогенеза / О.Я. Бабак, Ю.В. Протас // Сучасна гастроентеро-лопя. - 2005. - № 5 (25). - С. 9-14.
2. Поддубный Б.К. Современное состояние эндоскопической диагностики и лечения ранних форм рака пищевода и желудка / Б.К. Поддубный, Ю.П. Кувшинов, О.Н. Ефимов // Современная онкология. - 2000. - № 2. - С. 68-72.
3. Заридзе Д.Г. Эпидемиология и этиология злокачественных заболеваний / Д.Г. Заридзе // Канцерогенез. - М.: Научный мир, 2000. - С. 26-30.
4. Формирование групп риска по раку желудка / Л.Е. Денисов [и др.] // Кремлевская медицина. Клинический вестник. - 1999. - № 1. - С. 13-17.
5. Шаназаров Н.А. Рак желудка: учеб. пособие / под ред. А.В. Ва-женина. - Челябинск, 2001. - 29 с.
6. Indefinite for non-invasive neoplasia lesions in gastric intestinal metaplasia: the immunopheno-type / M. Cassaro [et al.] // J. Clin. Pathol. - 2007. -Vol. 60. - P. 615-21.
7. Stanley R. Hamilton. World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of the Digestive System / R. Stanley Hamilton, Lauri A. Aaltonen // IARC Press. - Lyon, 2000. - 314 p.
8. The Ki-67 protein interacts with members of the heterochromatin protein 1 (HP1) family: a potential role in the regulation of higher-order chromatin structure / T. Scholzen [et al.] // J. Pathol. - 2002. - Vol. 196. - P. 135-44.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Вернигородский С.В. - канд. мед. наук, доц. кафедры патологической анатомии с курсами судебной медицины и права Винницкого национального медицинского университета им. Н.И. Пи-рогова, г. Винница.
E-mail: vernsot@rambler.ru.
Мнихович М.В. - канд. мед. наук, вед. науч. сотрудник Центральной патологоанатомиче-ской лаборатории Научно-исследовательского института морфологии человека РАМН, РФ, г. Москва; сотрудник научного отдела ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань.
E-mail: mnichmaxim@yandex.ru.
