CC BY
37УДК 616.002.828____________________________
МОРФОГЕНЕЗ КОНИДИОГЕННОГО АППАРАТА ASPERGILLUS NIGER VAN TIEGHEM. ПО ДАННЫМ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
Степанова A.A., Синицкая И.А.
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования, Санкт-Петербург, Россия
©A.A.Степанова, И.А. Синицкая, 2004
С помощью методов сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии изучены особенности морфогенеза конидиогенного аппарата у штамма A. niger, выделенного от больного отомикозом и выращенного на среде Чапека. В работе предложена модель морфогенеза конидиогенного аппарата.
Ключевые слова: Aspergillus niger, конидиогенный аппарат, конидиогенез, морфогенез, ультраструктура
CONIDIOGENOUS APPARATUS MORPHOGENESIS OF ASPERGILLUS NIGER VAN TIEGHEM. BASED ON THE ELECTRON MICROSCOPY
Stepanova A. A., Sinitskaya I.A.
Kashkin Research Institute of Medical Mycology, Saint Petersburg Medical Academy of Postgraduate Education, Russia
© A. A. Stepanova, I.A. Sinitskaya
The pattern of conidiogenous apparatus morphogenesis of the strain A. niger isolated from otomycosis suffering patient was investigated using scanning and transmission electron microscopy. The model of conidiogenous apparatus development is presented.
Key words: Aspergillus niger, conidiogenous apparatus, morphogenesis, ultrastructure
ВВЕДЕНИЕ
Большое число работ посвящено изучению ультраструктуры конидиогенного аппарата [1-17] у видов рода Aspergillus. Однако такие кардинальные аспекты морфогенеза, как характер ультраструктур-ных преобразований дифференцирующихся клеток конидиогенного аппарата, закономерности развития клеточной стенки конидий, строение и динамика поведения компонентов порового аппарата септ и ряд других остаются до сих пор не решенными. Недостаточно разработана и номенклатура слоев клеточной стенки конидий. При ее описании одни авторы использовали буквенно-цифровые [А. аигео-latum: 6; A. nidulans: 11,16; A. fumigatus: 12], другие
— только буквенные [A. niger: 14; 17] обозначения. Танака с соавт. [1] применяли термин экзоспорий («exosporium») для обозначения всех слоев клеточной стенки конидий Л. niger. Мнения авторов о числе слоев в клеточной стенке конидиоспор расходились даже при ее изучении у одного и того же вида гриба. Весьма противоречивыми были также данные и о последовательности формирования слоев клеточной стенки конидиоспор у видов рода Aspergillus.
Целью настоящей работы было изучить особенности морфогенеза разных типов клеток конидиогенного аппарата A. niger под углом зрения выполняемых ими функций и сравнить их с имеющимися в литературе данными по другим видам рода Aspergillus.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Изучали культуру Л. niger (штамм ВКПГ F - 1124) из коллекции НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СПб МАПО, выделенную от больного отомикозом (И.И., 28.11.97г.) и выращенную на среде Чапека в термостате при 27 °С. Кусочки агаризиро-ванной среды с колониями гриба на разных стадиях развития через 2, 3, 5, 10, 15 и 20 дней после посева фиксировали для целей сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии. Через 2 дня после посева колония гриба имела диаметр 0,5 см и окраску белого цвета. Через 3,5,10,15 и 20 дней после посева колонии гриба достигали соответственно 1, 2, 3, 4 и 5 см в диаметре, а их центральная (по цвету черная) часть находилась на стадии спороношения и имела диаметр соответственно 0,7; 1,8; 2,8; 3,8 и 4,8 см.
Для сканирующей электронной микроскопии материал фиксировали в 3% растворе глутаральдегида на какодилатном буфере (pH 7,2), проводили через серию спиртов возрастающей концентрации (30, 50 и 70 °), высушивали при критической точке на приборе НСР-2 и напыляли золотом на IB-3. Материал изучали под сканирующим электронным микроскопом JSM 35. Метод подготовки образцов для трансмиссионной электронной микроскопии подробно описан нами ранее [18].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
У A. niger зрелый конидиогенный аппарат состоит из конидиеносца, заканчивающегося головкой, на поверхности которой располагаются два ряда стеригм (метул и фиалид); апексы стеригм второго ряда (конидиогенных клеток) формируют цепочки из разновозрастных конидиоспор. Мимс с соавт. [5] предлагают разделить развитие конидиогенного аппарата у Л. nidulans на 5 основных стадий: 1) формирование конидиеносца («stalk») 2) формирование головки («vesicle»); 3) формирование стеригм первого ряда (метул); 4) формирование стеригм второго ряда (фиалид) и 5) формирование конидий (конидиоге-нез). Мы предлагаем включить при описании морфогенеза конидиогенного аппарата также шестую, заключительную стадию его развития — старения и отмирания.
У видов рода Aspergillus формирование конидиогенного аппарата, как и весь цикл развития этих грибов, протекает очень быстро. Так, по наблюдениям некоторых авторов [8], формирование его у штамма A. niger, выращенного в культуре in vitro при 30°, занимало всего 18 часов.
Стадия 1: формирование конидиеносца. Кони-диеносец у A. niger закладывается как латеральный вырост клетки субстратного мицелия (так называемой “foot cell”, Рис. la), растущий вертикально апикальным ростом (Рис. 16; 2а). Апекс растущего конидиеносца имеет конусообразную форму (Рис. 2а). В его содержимом отмечаются одиночные ядра эллипсоидной формы, лишенные конденсированного хроматина (1,9x2,5 мкм, Рис. За). Ядра имеют одно крупное (0,7 мкм) эксцентричное ядрышко, состоящее из гранулярного и фибриллярного компонентов. По мере роста конидиеносца число ядер в нем существенно возрастает. Митохондрии многочисленные, одиночные, разнообразной формы. Они часто имеют большую протяженность (до 3,75 мкм). Матрикс ор-ганелл более плотный, чем цитозоль, содержит многочисленные длинные кристы. При анализе серийных срезов дифференцирующихся конидиеносцев в них выявлен митохондриальный ретикулум, характерный и для клеток субстратного мицелия этого вида [18, 19]. Эндоплазматический ретикулум (ЭР)
- встречается часто, имеет вид коротких прямых, либо сильно искривленных агранулярных цистерн, расположенных продольно и по всей цитоплазме. Большая часть цистерн расширена и содержит многочисленные мелкие плотные гранулы полифосфатов варьирующего диаметра. Довольно часто отмечаются одиночные микротельца округлой (0,25 мкм) или эллипсоидной формы (0,20-0,40 мкм), содержащие плотный фибриллярный матрикс, и ограниченные контрастной мембраной. Иногда в растущем кониди-еносце можно наблюдать одиночные плотные тельца Воронина гексагональной (0,19-0,23 мкм) формы, в основном отмечаемые на периферии клетки. По мере роста конидиеносца (Рис. 16) в нем появляются немногочисленные одиночные мелкие (0,10-0,20 мкм)
светлые липидные капли, сосредоточенные у клеточной стенки. Иногда в толще цитозоля встречаются одиночные длинные продольно ориентированные, микротрубочки. Цитозоль конидиеносца плотный, насыщен свободными рибосомами.
У A. niger высота закончившего рост конидиеносца колебалась в пределах 1,2-2,7 мкм, а толщина соответственно — 1,5-2,5 мкм; его клеточная стенка толстая (0,5 мкм в основании и 0,3 мкм в верхней части), светлая, гомогенная, гладкая, снаружи покрыта темным тонким (0,05 мкм) сплошным электронно-плотным слоем (Рис. Зг), так называемой кутикулы [12]. Другие авторы для описания этого слоя используют другие термины [«hull»: 11; «lamina»: 3; «surface coating»: 13,17]. Танака с соавт. [1] для Л. niger, выращенного также в культуре in vitro, приводит более высокие значения толщины клеточной стенки для закончившего рост конидиеносца — 0,6 мкм в основании и 0,2 в верхней части. Следует отметить, что у A. niger ультраструктура конидиеносца и головки в начальный период конидиального спороноше-ния (колонии гриба диаметром 3 и 5 см) оставалась практически без изменений (Рис. 1и). В дифференцирующихся конидиеносцах конидиогенных аппаратов колоний гриба через 10 и 15 дней после посева, начиная с периода их закладки, обильно откладываются розетки а-гликогена (Рис. 1к) диаметром 0,1-0,2 мкм. Это совпадает по времени с аккумуляцией а-гликоге-на в содержимом многих клеток субстратного мицелия изучаемого штамма Л. niger [18].
Согласно данным литературы [3,5], растущие конидиеносцы конидиогенных аппаратов у штамма A. nidulans, выращенного in vitro, в целом имеют сходную с A. niger ультраструктуру. Они содержат плотный цитозоль, многочисленные ядра, митохондрии, цистерны гранулярного ЭР, тельца Гольджи, свободные рибосомы, а также микротрубочки и мульти-везикулярные тельца. Цистерны ЭР располагаются в толще цитозоля и ориентируются вдоль конидиеносца. В верхней части его скаплавается большое число пузырьков. В отличие от изученного нами A. niger, конидиеносцы конидиогенных аппаратов у A. nidulans не содержат запасных веществ. Проведенное авторами сравнение степени сохранности компонентов клетки при использовании обычных химических и более современных (замораживание-замещение) методов подготовки образцов для трансмиссионной электронной микроскопии показывает, что второй способ фиксации предпочтителен, поскольку при его использовании лучше сохраняются компоненты эн-домембранной системы (пузырьки, тельца Гольджи цистерны ЭР) и микротрубочки.
В содержимом растущего конидиеносца A. flavus [7] также выявляется плотный цитозоль, многочисленные ядра, митохондрии, микротельца, свободные рибосомы и микротрубочки, локализующиеся как в толще цитозоля, так и вблизи плазмалеммы. По данным других авторов [1], в содержимом формирующегося конидиеносца A. niger также отмечают ядра,
митохондрии и элементы ЭР. Другие компоненты клетки, ввиду их плохой сохранности после фиксации перманганатом калия, не различаются.
Таким образом, у изученного штамма А. niger рост конидиеносцев сопровождается увеличением числа ядер, митохондрий (с формированием митохондриального ретикулума), цистерн ЭР, новообразованием цитозоля и свободных рибосом. Все эти признаки являются показателями высокого уровня их метаболизма, сохраняющегося вплоть до окончания ко-нидиогенеза.
Стадия 2: формирование головки. После завершения роста конидиеносца, его апекс пузыревидно вздувается, формируя зачаток головки (Рис. 1в; За). Цитозоль зачатка слегка просветлен, содержит одиночные редкие ядра, небольшое число профилей митохондрий, цистерн агранулярного ЭР и довольно многочисленные свободные рибосомы; в содержимом цистерн ЭР большое число мелких темных гранул полифосфатов (Рис. Зб) разного диаметра. Первоначально зачаток головки подвергается апикальному росту, который позже сменяется на изоди-аметрический. По завершении последнего головка приобретает шаровидную (5-7 мкм) форму (Рис. 1г; 26).
Закончившая рост головка содержит многочисленные (20-25 на срез) ядра округлой (2,0 мкм), либо эллипсоидной (2,0x2,5 мкм) формы, лишенные конденсированного хроматина. В ядрах выявляется одно (0,7 мкм) эксцентричное ядрышко (Рис. Зб) гранулярно-фибриллярного строения. Часто вблизи наружной мембраны оболочки ядра отмечается темное плоское полярное тельце веретена. Профили митохондрий многочисленные (35-45 на срез головки). Размеры этих органелл варьировали в пределах 0,3-0,5 мкм, а их строение сходно с митохондриями растущего конидиеносца. Цистерны ЭР встречаются часто, формируют мелкие светлые вакуоли варьирующего размера, равномерно распределенные по площади среза закончившей рост головки. Довольно часто наблюдаются микротельца округлой (0,2 мкм) или эллипсоидной (0,2x0,3 мкм) формы. Они имеют плотный фибриллярный матрикс и ограничены темной мембраной. Липидные капли редкие одиночные, либо собранные в небольшие группы. В основном они локализуются вблизи плазмалеммы (Рис. 1д). По строению и размерам они сходны с таковыми конидиеносца. В головках, как и в конидиеносцах, колоний гриба через 10 и более дней после посева появляются обильные отложения розеток а-гликоге-на (Рис. 1к), занимающие в них центральное положение.
Клеточная стенка закончившей рост головки толстая (0,6 мкм) двухслойная. Она состоит из светлого толстого гомогенного внутреннего слоя и примыкающего к нему более тонкого (0,1 мкм) слоя фибриллярной структуры и умеренной электронной плотности (Рис. Зв). Снаружи она, как и стенка конидиеносца, покрыта тонкой темной кутикулой.
Согласно данным литературы, толщина клеточной стенки сформированной головки у А. niger [1] в среднем равна 0,4 мкм, а у Л. giganteus [2] и А. с1ауМш [4] соответственно 1,5 и 0,5. Закончившая рост головка у А./1ауш [7] также, как и исследуемый нами А. niger, имеет двухслойную оболочку и содержит ядра, митохондрии, вакуоли, элементы ЭР и микротельца. Однако у этого вида, численность микротелец в головке была намного меньше, чем в конидиеносце. Головка конидиогенного аппарата у А. с1ауМш [4] в период формирования стеригм содержала много ядер, митохондрий и мелких вакуолей с кристаллическими черными включениями. В отличие от исследованного нами вида, у А. тс1и1аж [5] головка конидиогенного аппарата в начальный период кони-диогенеза была сильно вакуолизирована, тогда как на более поздних стадиях, уровень вакуолизации в них был заметно ниже. Отметим, что у А. giganteus [2] головка конидиогенного аппарата в период формирования стеригм имела следующее строение: ее центральная его часть лишена органелл и содержит обильные скопления розеток гликогена, тогда как периферическая — занята многочисленными ядрами и митохондриями. Как считают авторы, это служит показателем большей метаболической активности периферической части, по сравнению с центральной.
Итак, как показывают проведенные нами исследования, по особенностям ультраструктуры сформированный конидиеносец и головка конидиогенного аппарата А. niger в целом сходны. Формируемые в культуре гриба через 10 и более дней после посева конидиеносцы и головки выполняют роль дополнительных резервуаров для временного хранения запасных веществ, впоследствии используемых для формирования конидий.
Стадия 3,4: формирование стеригм. Заложение стеригм первого ряда начинается с появления на поверхности головки расположенных в шахматном порядке многочисленных небольших вздутий, хорошо различимых под сканирующим электронным микроскопом (Рис. 2в). В образовании клеточной стенки зачатков стеригм принимает участие внутренний тонкий (0,15 мкм) светлый слой стенки закончившей рост головки. Зачатки стеригм растут синхронно апикальным ростом (Рис. 1е). В их апексе (рис. Зк) отмечается небольшое число крупных (70-80 нм) светлых пузырьков, ядра отсутствовуют, цитозоль плотный (Рис. Зд), содержит редкие одиночные мелкие митохондрии, короткие агранулярные цистерны ЭР и многочисленные свободные рибосомы.
Отметим, что синхронная закладка и последующий рост характерны для стеригм первого ряда других видов аспергиллов [А. giganteus: 2; А. тс1и1аж: 3,5; и А. с1ауМш: 4]. Растущие стеригмы первого ряда у А. giganteus [2] и А. с1ауМш [4] имеют ультраструктуру, сходную с таковой стеригм у Л. niger.
Закончившие рост стеригмы первого ряда (Рис. 2г) у А. иг^ег имеют цилиндрическую форму [25-35(50-70)х5-7(8-9) мкм]. В них отмечается одно ядро
округлой (1,2 мкм), либо эллипсоидной (1,Ох 1,2 мкм) формы, сосредоточенное в центральной части клетки (Рис. 4а). Ядрышко одно (0,8 мкм), сдвинуто к оболочке ядра, гранулярный компонент в нем преобладает и занимает его центральную часть. Митохондрии в небольшом числе (6-8 на срез), мелкие (0,2-0,5 мкм), равномерно распределяются по площади среза клетки, полиморфные. Элементы ЭР - короткие прямые, либо слегка извилистые агранулярные цистерны располагающиеся по периферии клетки. Цитозоль плотный, насыщен свободными рибосомами. Вакуоли и запасные вещества отсутствуют. Редко встречаются одиночные мелкие ломасомы, характеризующиеся наличием небольшого числа контрастных, концентрически ориентированных, мембран и слабо извилистой ограничивающей мембраны. По данным литературы [12], сформированные стеригмы кони-диогенных аппаратов у A.fumigatus также, как и у исследуемого нами вида, имеют небольшое число митохондрий, плотный цитозоль богатый свободными рибосомами. Они были лишены запасных веществ и вакуолей. У конидиогенных аппаратов A. clavatus [4] вакуоли сформированных стеригм содержат темные кристаллические включения. Одно ядро было описано также другими авторами в зрелых стеригмах у ряда видов аспергиллов [A. giganteus: 2; A. clavatus: 4; A. nidulans: 5; A. fumigatus: 12].
У конидиогенных аппаратов A. niger клеточная стенка закончивших рост стеригм первого ряда тонкая (0,15 мкм), светлая, фибриллярной структуры. Снаружи она несет кутикулу (Рис. 4а), непрерывную с таковой ножки и головки. Аналогичный слой описан и для клеточных стенок стеригм A. fumigatus [12]. Латеральные клеточные стенки закончивших рост стеригм A. giganteus [2] были намного толще (0,2-0,3 мкм), чем у A. niger. Представляют интерес данные Янагита с соавт. [20] согласно которым, число стеригм, формируемых одной головкой A. niger, может колебаться в пределах 500-600.
В основании закончивших рост стеригм первого ряда A. niger закладывается светлая клиновидная отделительная септа (Рис. Зл; 4а), толщина которой вблизи латеральной клеточной стенки составляет 0,43 мкм, а в средней части - 0,21. В центре она имеет сквозную пору диаметром 0,08 мкм. Общий диаметр септы составляет 1,3 мкм. Тельца Воронина вблизи таких септальных пор вплоть до завершения роста стеригм отсутствуют (Рис. 4а-в). Они появляются с началом конидиогенеза (по два тельца с каждой стороны септы). Форма телец Воронина гексагональная, расположены они симметрично относительно друг друга и септальной поры (Рис. 4г). По завершении конидиогенеза тельца Воронина вблизи таких септ перестают выявляться (Рис. 4ж). Септальная пора в этот период закупоривается крупной темной гомогенной пробкой неправильной формы (Рис. 4и). Интересно отметить, что в порах септ клеток вегетативного мицелия этого же штамма A. niger, в условиях культуры in vitro, пробки нами не были обнаружены
[18]. В основании стеригм конидиогенных аппаратов А. giganteus [2], А. с^а1ш [4] и А. тс1и1аж [5] описана септа аналогичного строения. У первого вида она имеет пору диаметром 0,07 мкм. У всех трех видов вблизи такой септы (со стороны стеригмы) отмечается два электронно-плотных тельца Воронина, ограниченные мембраной.
В зрелых стеригмах первого ряда у А. giganteus
[2], формирующих цепочки конидий, помимо одного центрально расположенного ядра, отмечают также редкие митохондрии, цистерны ЭР, розетки гликогена и довольно крупную базальную вакуоль. Отличительной особенностью тонкого строения стеригм первого ряда у А. тс1и1аж [5] было то, что они содержат тельца Гольджи, мультивезикулярные тельца, микротрубочки, а также довольно крупные вакуоли. Авторы использовали метод замораживания-замещения, позволивший выявить, помимо этих компонентов, многочисленные пузырьки в их апексе. По данным другого автора [3], изучавшим этот же вид гриба и использовавшего обычные методы химической фиксации образцов, в апексе растущих стеригм первого ряда, как и в нашем материале, отмечено лишь небольшое число пузырьков.
Закончившие рост стеригмы первого ряда кони-диофоров вскоре вновь подвергаются апикальному росту (Рис. 2ж; 46), в их апексе появляется умеренное число крупных светлых пузырьков. По наблюдениям Мимс с соавт. [5], в растущие стеригмы второго ряда конидиогенных аппаратов А. тс1и1аж мигрируют ядра, митохондрии, тельца Гольджи и микротрубочки. В их апексе отмечали скопление из большого числа пузырьков.
По завершении роста стеригм первого ряда А. т-ger, в их верхней 2/3 части формируются светлые клиновидные септы, отделяющие стеригмы второго ряда (Рис. Зм; 4в). Толщина таких септ у латеральной клеточной стенки равна 0,13 мкм, а в средней части — 0,09. В центре септ присутствует центральная сквозная пора диаметром 0,07 мкм. С началом конидиогенеза вблизи таких септ отмечают четыре симметрично расположенные относительно друг друга тельца Воронина (по два с каждой стороны поры, Рис. Зм; 4 г-з).
Закончившие рост стеригмы второго ряда имели цилиндрическую форму (Рис. Зз), однако по размерам они были меньше (6-9х3-3,5 мкм) стеригм первого ряда, содержали одно ядро эллипсоидной (0,81,5 мкм) формы. По набору и тонкому строению клеточных компонентов они практически не отличались от стеригм первого ряда (Рис. 4в) за исключением лишь в том, что у них более тонкие клеточные стенки (0,09 мкм). По мере формирования стеригм между кутикулой и клеточной стенкой головки откладывалась гранулярно-фибриллярная слизь, постепенно заполнявшая межклетники между стеригмами зрелых конидиогенных аппаратов (Рис. 4 в-з). По завершении конидиогенеза она полностью исчезала, что являлось показателем ее утилизации в качестве
дополнительного источника питательных веществ в ходе процесса конидиогенеза. Не исключено, что описанное для конидиогенных аппаратов А. gigan-1еин [2] скопление темного гранулярного материала в промежутке между клеточной стенкой стеригм и кутикулой, также является слизью. Через 10 и более дней после посева в стеригмах зрелых конидиогенных аппаратов аккумулируются многочисленные розетки а-гликогена (Рис. 3 ж,з) и небольшое число мелких (0,20-0,25 мкм) светлых липидных капель. Эти запасные вещества появлялись изначально в содержимом стеригм первого ряда (Рис. 1и,к), а затем и стеригм второго ряда (Рис. 4з).
Несмотря на начало процесса конидиогенеза сте-ригмами второго ряда (первая генерация), формирование стеригм второго ряда продолжалось (Рис. 4д). Теперь они возникали как латеральные выросты стеригм первого ряда, растущие апикально. Такие выросты богаты цитозолем (Рис. Зе; 4д) и свободными рибосомами, почти лишены органелл. В их апексах отмечали небольшое число крупных (70-80 нм) светлых пузырьков.
Сходная модель формирования стеригм второй и последующих генераций описана в литературе и для конидиогенных структур А. тс1и1аж [3]. Стеригмы второго ряда у этого вида [5,20] также содержат одно ядро. Мимс с соавт. [5] считают, что уменьшение числа ядер, начиная от ценоцитного состояния в клетках мицелия и до одноядерного в стеригмах, связано с уменьшением размеров клеток.
По нашим данным, стеригмы первого и второго рядов в формирующихся конидиальных аппаратах А. niger проходят сходный путь морфогенеза. Формирование их сопровождается увеличением числа митохондрий (без формирования митохондриального ретикулума), новообразованием цитозоля и свободных рибосом, синтезом большого числа розеток а-гликогена. Общим для стеригм обоих рядов было наличие по одному ядру. Стеригмы первого ряда в период выполнения ими образовательной функции (образование стеригм второго ряда) имеют ультраструктуру меристематических клеток. Для них характерно наличие плотного цитозоля, насыщенного свободными рибосомами, небольшого числа митохондрий и элементов ЭР, отсутствие вакуолей и запасных веществ. По завершении роста стеригмы первого ряда зрелых (в период конидиогенеза) конидиогенных аппаратов выполняют роль дополнительных резервуаров для временного хранения запасных веществ, постепенно утилизирующихся в ходе конидиогенеза. Однако функциональная активность ядер стеригм второго ряда была неоспоримо выше, что связано с их высокой митотической и формообразовательной активностью — необходимостью поставлять ядра, цитозоль, митохондрии, элементы ЭР, свободные рибосомы и другие компоненты клетки в формируемые ими конидии. В колониях гриба через 2 и 3 дня после посева стеригмы второго ряда в период конидиогенеза, как и стеригмы первого ряда,
имеют ультраструктуру меристематических клеток. В стеригмах второго ряда конидиогенных структур, сформированных колониями гриба через 10 и более дней после посева, как и в стеригмах первого ряда, появляются обильные скопления розеток а-гликоге-на, заполняющие весь объем клетки, свободный от органелл.
Стадия 5: формирование конидий (конидиоге-нез). Прежде чем перейти к описанию одного из кульминационных моментов в общем цикле развития конидиогенного аппарата Л. niger - конидиогенеза, отметим, что наиболее целесообразно при описании слоев клеточной стенки дифференциирующихся конидий использовать номенклатуру, разработанную в работе Меркус [21] и широко используемую в современной литературе, посвященной изучению спорогенеза у аскомицетов, к которым и относится штамм исследуемого нами вида.
У А. niger конидии формируются стеригмами второго ряда асинхронно (Рис. 1з; 2з). Формирование первой конидии начинается с образования небольшого апикально растущего вздутия (инициаль конидии) в верхней части закончившей рост стеригмы второго ряда (Рис. 4г). Позже апикальный рост инициали конидии меняется на изодиаметрический, по завершении которого она приобретает округлую форму и максимальные размеры (от 4 до 5 мкм). Оболочка инициали конидии - эндоспорий (первичная оболочка) - светлая, однослойная, тонкая (0,10 мкм), фибриллярная, формируется за счет вновь сформированной клеточной стенки в верхней части стеригмы (Рис. 4г).
Согласно наблюдениям многих авторов, у А. gi-ganteus [2], А. тс1и1аж [3], А. с1ауМш [4], А. аигео-1лЬш [6], А. Аауин [7], А. niger [10,15], А. fumigatus [12] и А. 1еггеш [13] клеточная стенка зачатка первой конидии непрерывна с клеточной стенкой, формирующей ее стеригмы, то есть конидия закладывается по голобластическому типу. Клеточная стенка второй и всех последущих конидий имеет другое происхождение. Она закладывается в стеригме внутрь от стенки последней и независимо от нее. Собственно клеточная стенка стеригмы в месте заложения конидии разрушается, формируя так называемый воротничок («со11аге1е»). Иными словами, вторая и все последующие конидии у изученных видов аспергил-лов развиваются по эндобластическому типу, когда в формировании клеточной стенки зачатков конидий принимает участие вновь образованный внутренний слой стенки стеригмы. Последняя закладывается под оболочкой стеригмы и формируется параллельно с ростом конидиоспоры, приобретая форму и размеры дифференцирующихся конидий. Эта часть клеточной стенки конидиоспор более четко выявляется после фиксации перманганатом калия [6]. В нашем материале воротничок был очевиден всегда, как при формировании первой конидии (Рис. 4г,ж; 5а), так и конидии в основании цепочки (Рис. 4ж). Однако, при отсутствии кутикулы снаружи формирующейся
конидии, он был выражен более четко (Рис. 5а). Мы предполагаем, что в этом случае цепочки конидий не образуются и уже первая конидия может отделиться от апекса стеригмы, то есть, скорее всего развиваемое многими авторами представление о том, что для аспергиллов типичен способ конидиогенеза, не укладывающийся в классические представления об этом процессе, скорее всего не верно. Конидиогенез у изученного нами штамма А. niger протекает только по эндо(энтеро)бластическому типу.
По мере роста конидии А. niger эндоспорий утолщается до 0,20 мкм. Снаружи от него формируется эписпорий (Рис. 5г), имеющий сходную фибриллярную структуру и отличающийся от эндоспория повышенной электронной плотностью и неравномерной толщиной (от 0,12 до 0,20 мкм). Вскоре на поверхности эписпория закладываются и формируются элементы слоя орнаментации, имеющие на ультратонких срезах форму шипиков («гос11е1я»), под сканирующим электронным микроскопом они имеют вид радиально ориентирующихся ребер (Рис. 2 е,з). Максимальная высота их — 0,44 мкм, а ширина — 0,23-0,45. По электронной плотности и структуре (наличие фибрилл) элементы слоя орнаментации сходны с эндоспорием. Формирующиеся элементы слоя погружены в светлый бесструктурный периспорий (вторичная оболочка, Рис. 5 в) варьирующей толщины. Завершающим слоем клеточной стенки конидий является тонкая темная кутикула, повторяющая контур слоя орнаментации и непрерывно переходящая в наружный слой клеточной стенки стеригм, конидиеносца и головки (Рис. 5 б-г,е). Наибольшей толщины (0,59 мкм) клеточная стенка конидиоспор достигает после завершения их роста, появления в них ядра и формирования в их основании отделительной септы.
По мере созревания конидий Л. niger, эндоспорий и периспорий становятся светлыми, бесструктурными. Эндоспорий утоньшается и приобретает неравномерную толщину (0,07-0,28 мкм). Эписпорий уплотняется и утоньшается до 0,07 мкм, приобретая слегка извилистый контур. Слой орнаментации становится не видимым (усыхание), а периспорий сильно расширяется и становится неравномерным по толщине. Кутикула становится более широкой (до 0,14 мкм) и неравномерной по толщине. Позже она разрывается и лизируется, освобождая зрелые конидиоспоры. Толщина зрелой клеточной стенки конидий колеблется в пределах 0,14-0,98 мкм и насчитывает только два слоя: более толстый светлый внутренний эндоспорий и тонкий темный наружный эписпорий (Рис. 5д). У A.fumigatus [12] толщина кутикулы в молодых конидиях варьирует в пределах 10-20 нм, а в зрелых — 25-180 нм. Для А. тс1и1аж
[3] также отмечено уменьшение толщины клеточной стенки конидий по мере их созревания. У А. /1ауш [7] кутикула покрывает конидиеносец, головку и цепочки конидий. По мере созревания конидиоспор, она исчезает. У А. 1еггеш [13] кутикула формируется снаружи конидиеносца, головки, стеригм и цепочек
конидий. По автору, в пространство, ограниченное кутикулой, могут выделяться вещества, синтезируемые головкой. Одним из таких веществ, по нашим наблюдениям, может быть слизь.
Данные литературы о числе слоев в клеточной стенке зрелых конидий А. niger не однозначны. Так, согласно наблюдениям МакКин с соавт. [14] и Цукахара с соавт. [15], у А. niger толщина клеточной стенки зрелых конидий варьировала в пределах 0,22-0,80 мкм и она состояла из трех слоев. Тогда как Тайд
[17] у этого же вида определил четыре слоя. В проведенном нами изучении развития клеточной стенки конидий А. niger показано, что в закончивших рост конидиях в ее составе различимы пять слоев, тогда как в зрелых — только два. На снимках прорастающих конидий А. niger, Танака с соавт. [1] выявили двухслойное строение зрелой клеточной стенки конидий у этого вида, хотя в таковой у других видов аспергиллов — А. с1ауМш [4], А. аигеоШш [6], А. т-с1и1аж [11,16], А. fumigatus [12] отмечали наличие только трех слоев, что очевидно, было связано с изучением разновозрастных конидий названных видов: исключительно ранние у А. аигеоШш [6] и зрелые у А. с1ауМш [4],А. тс1и1аж [11,16], А. niger [14] или те и другие вместе [А. fumigatus: 12]. Объяснить такое разногласие между исследователями можно тем, что на ранних стадиях развития конидий многие слои их клеточной стенки еще не сформированы, а на более поздних — многие слои просто исчезают.
По нашим наблюдениям, из содержимого стеригм второго ряда в растущие конидии А. niger переходит плотный цитозоль, небольшое число мелких (0,2-0,4 мкм) митохондрий, одиночных элементов ЭР (Рис. 1з-л; 4е-з), одиночные мелкие вакуоли и многочисленные свободные рибосомы. По завершении роста в нем появлялось одно ядро (Рис. 5б) диаметром 0,8 мкм, образовавшееся в ходе митотического деления ядра формирующей ее стеригмы.
Другими авторами [17,22] в зрелых конидиях А. niger также было отмечено одно ядро. Однако в работе Барачо с соавт. [23], изучавшими этот же вид гриба, показано, что число ядер (одно или два) в конидиях зависит от штамма, температуры и среды выращивания. Так, большая часть штаммов формировала двуядерные конидии при температуре 28 °С, тогда как остальные 5%, соответственно, при 37°. У одних штаммов двухъядерные конидии доминировали при выращивании их на обедненной питательной среде, тогда как у других, напротив, на среде с полным минеральным составом. Для других видов аспергиллов [24, 25] отмечена сходная тенденция. Эти же авторы, сравнивая гаплоидные и диплоидные штаммы, показали, что последние формируют больше двухъядерных конидий, чем первые.
У А. niger, после появления ядра в конидии, в ее основании формируется трехслойная (с крайними темными и светлым центральным слоем) клиновидная отделительная септа (Рис. 4д; 5б). Диаметр ее вблизи латеральной клеточной стенки был равен
0,39 мкм, а в средней части - 0, 26 мкм. В центре такая септа имела пору диаметром 0,1 мкм. Тельца Воронина вблизи такой септы отсутствовали. Не были они отмечены и для А. с1ауаШз [4]. Септа идентичного строения формировалась в основании конидий у А. giganteus [2], А. с1ауа1ш [4], А. пЫи1аж [3, 5,11] и A.fumigatus [12]. У A.fumigatus толщина ее составляла 10-20 нм, а у А. тс1и1аж колебалась в пределах 0,10-0,38 мкм. У А. с1ауа1их[/\\ такая септа была светлая и однослойная. Первое упоминание о наличии такой септы в основании конидии А. niger приведено в статье Тайд [17]. Вскоре форма этой септы меняется на прямую (Рис. 5е), толщина возрастает до 1,4 мкм; трехслойное строение ее сохраняется. Происходит это еще в период, когда конидия связана с апексом формирующей ее стеригмы. В центральной части септы нами впервые для изучаемого вида описана тонкая равномерная по толщине (0,07 мкм) сквозная пора с плотным содержимым (Рис. 5е). Септа аналогичного строения описана и для созревающих конидий А. fumigatus [12] и А £еггеи5 [13]. Она утолщалась также по мере развития конидий и у А. с1а-уМш [4], однако была однослойной. Позже материал такой септы полностью лизирует [А. ¡еггеш: 13], однако зрелые конидии какое-то время сохраняются в цепочке благодаря окружающей их кутикуле. Затем в верхней части цепочки она распадается, освобождая созревшие конидии. Важно отметить, что запасные вещества в конидиях первой генерации, формируемыми конидиогенными аппаратами через 2 и 3 дня после посева, отсутствуют (Рис. 1з; 4д-ж). Однако, конидии А. n¿ger, формирующиеся конидиогенными аппаратами через 5 и более дней после посева, и несущие стеригмы, богатые гликогеном, могут быть нескольких типов: 1) без видимых отложений запасных веществ; 2) с небольшим (3-5 на срез конидии) числом светлых липидных капель (0,20-0,25 мкм) (Рис. 5д); 3) с редкими мелкими вакуолями, содержащими гранулы полифосфатов разного размера (Рис. 5в); 4) с розетками а-гликогена (рис. 5в) и 5) с розетками а-гликогена и небольшим числом липидных капель (Рис. 1и). Такую разнокачественность содержимого конидий по запасным веществам прослеживали не только в пределах одного конидиогенного аппарата (Рис. 1 и-л; 5в), но и одной цепочки конидий (Рис. 5в; 4з).
Созревание конидий в цепочках проходит в ба-зипетальном направлении, то есть в направлении от основания цепочки к ее апексу так, что самые зрелые, готовые к отделению конидии располагались в ее апексе (Рис. 1л,м; 4з). Однако по нашим данным, рост и закладка всех слоев клеточной стенки кони-диоспор А. niger завершаются еще в период, когда они были связаны со стеригмой. Далее, по направлению к апексу, происходит их созревание, сопровождающееся уменьшением размеров конидий (до
0,15x0,20 мкм) за счет дегидратации. Форма конидий становится слабодисковидной (Рис. 5е). Ядро уменьшается в размерах, другие органеллы и свободные
рибосомы сокращаются в числе и перестают выявляться, цитозоль становится электронно-плотным (Рис. 5в-е). По данным литературы [3], формирование конидий у А. тс1и1аж сопровождается лизисом вакуолей и уменьшением числа органелл; в этот период в них можно наблюдать картины локального автолиза цитоплазмы с участием вакуолей. Здесь уместно привести данные из научной литературы [17], согласно которым, созревающие конидии А. niger помимо ядра содержат вакуоли, липидные капли и рибосомы. Отметим, что в формирующихся конидиях Л. тс1и1аж [11] было обнаружено одно ядро, митохондрии, элементы ЭР, мелкие вакуоли, ломасомы, микротельца, пузырьки, а также гранулы а-гликогена представленные на рис. 7, но не описанные авторами. В молодых, содержащих отделительную септу в основании, но еще связанных со стеригмой конидиях A.fumigatus, судя по снимкам, представленным в статье Гиорзе с соавт. [12], содержится одно ядро, плотный цитозоль с небольшим числом митохондрий и мелких вакуолей. С возрастом в них аккумулируются два типа запасных веществ — гликоген и липидные капли. В конидиях А. giganteus [2] выявлено одно ядро, несколько митохондрий, гранулы гликогена, мелкие пузырьки и элементы ЭР.
Таким образом, у А. иг^ег число слоев в клеточной стенке конидий закономерно меняется в зависимости от стадии их развития.
Рост конидий и закладка слоев клеточной стенки конидий завершаются перед миграцией в них ядра в период, когда они еще были связаны с формирующими их стеригмами. Далее в базипетальном направлении проходит процесс их созревания, сопровождающийся уменьшением размеров, изменением формы, усыханием и упрощением строения спородермы, синтезом запасных веществ (в конидиофорах через 10 дней после посева), а также обезвоживанием их содержимого. Полученные нами данные противоречат сложившемуся в литературе мнению многих исследователей [3, 6, 10, 27, 28] о том, что у видов рода Аяре^ИИя увеличение размеров конидиоспор и формирование их клеточной стенки протекает в базипетальном направлении по мере продвижения их к апексу цепочки.
Стадия 6. Старение и отмирание конидиогенного аппарата. По завершении формирования стеригмами второго яруса цепочек конидий, в конидие-носце и головке конидиогенного аппарата начинаются процессы старения: мелкие вакуоли увеличиваются в размерах (Рис. 1л) и сливаются в несколько крупных, заполняющих основной их объем (Рис. 1м). В таких вакуолях появляются обильные скопления темных мелких гранул полифосфатов. В этот период уменьшается число ядер, митохондрий и других органелл (Рис. 1 м), а также запасных веществ, часто отмечаются картины локального автолиза цитоплазмы с участием тонопласта. Последний формирует разные по объему и содержимому инвагинации, содержащие участки цитозоля с различными органеллами,
свободными рибосомами и запасными веществами. Со временем тонопласт вакуолей разрывается, освобождая гидролитические ферменты, вызывающие глобальный автолиз содержимого конидиеносца и головки. Плазмалемма распадается на фрагменты и лизирует. В 15-ти и особенно 20-ти дневных культурах изученного штамма А. niger часто встречаются конидиогенные структуры с полностью опустошенными конидиеносцем и головкой (Рис. 1 н).
Позже аналогичный процесс старения охватывает стеригмы первого, а затем и второго ряда (Рис. 1м,н; Зи). Гликоген в стеригмах первого ряда приобретал вид бесформенных светлых скоплений, которые постепенно уменьшались в объеме и исчезали. Параллельно в стеригмах закладывались апикальная и базальная вакуоли, содержащие многочисленные мелкие темные гранулы полифосфатов. Уменьшение объема гликогена сопровождается ростом этих вакуолей, которые позже сливаются, формируя одну центральную вакуоль (Рис. Зж; 4з), занимающую практически весь объем клетки. Затем аналогичный процесс гидролиза гликогена и вакуолизации имеет место и в стеригмах второго ряда (Рис. Зи). Клеточные стенки полностью опустошенных конидиогенных аппаратов сохраняют присущую им в интактном состоянии форму и несут длинные цепочки зрелых конидий. После отделения конидий от стеригмы, апикальная часть ее клеточной стенки локально утолщается по направлению к плазмалемме (Рис. Зи).
По данным литературы, у А. /1ауш [7] процессы старения конидиогенного аппарата также первоначально имеют место в конидиеносце и головке.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
У изученного штамма А. niger стерильные клетки конидиогенного аппарата имеют, в противовес ранее изученным нами клеткам его вегетативного мицелия
[18], более стабильную ультраструктуру, закономерно меняющуюся в зависимости от стадии их развития. Мнение Танака с соавт. [1] и Оливера [3] о том, что по ультраструктуре растущие конидиеносцы у А. niger и А. тс1и1аж мало чем отличаются от гиф вегетативного мицелия этих же видов, не получило подтверждения в нашем материале. У изученного в настоящей работе штамма А. niger, зрелые клетки мицелия имели только два ядра, сильно различались по уровню вакуолизации, насыщенности митохондриями, а также по наличию или отсутствию запасных веществ, их типу и сочетанию.
На основании сравнения размеров интерфазных ядер у всех изученных в настоящей и ранее опубликованной работе [18] типов клеток Л. иг^ег показано, что самые мелкие ядра были выявлены в конидиях, а самые крупные — в конидиеносце и головке. Ядра стеригм и зрелых клеток вегетативного мицелия имеют сходные размеры, промежуточные между этими двумя крайними типами. Мелкие размеры ядер в конидиях можно увязать не только с небольшими размерами конидий, но и низким уровнем их метабо-
лизма, связанным с переходом в стадию созревания, которая сопровождается их обезвоживанием. Крупные размеры ядер конидиеносца и головки коррелируют с их размерами и высоким уровнем метаболизма. Ядра всех типов клеток конидиогенного аппарата и вегетативного мицелия А. niger [18] характеризуются отсутствием конденсированного хроматина.
Анализом строения септ всех типов клеток исследованного штамма А. niger показано, что для преобладающего их числа характерны клиновидные однослойные светлые септы. Прямые септы формировались только в цепочках между созревающими конидиями. Эти септы отличались трехслойным строением (светлый центральный и темные крайние). Толщина септ коррелировала с толщиной латеральных клеточных стенок. Так, самые толстые септы выявляли в основании стеригм первого ряда и межконидиальных септ, а самые узкие поры отмечали в септах зрелых конидий, тогда как достоверных различий в диаметре септальных пор других изученных типов клеток не было выявлено. Стабильны были размеры и строение телец Воронина, однако их число и топография закономерно менялись в зависимости от стадии развития и типа клетки конидиогенного аппарата.
Судя по ультраструктуре разных типов клеток зрелого конидиогенного аппарата изученного штамма А. n¿ger, наибольшей метаболической активностью обладают конидиеносец и головка. Если наличие плотного цитозоля, богатого свободными рибосомами, а также обилие ядер, митохондрий и других компонентов клеток в период роста конидиеносца и головки можно обяснить необходимостью формирования толстой клеточной стенки и синтеза большого числа конститутивных веществ цитоплазмы, то активный ультраструктурый облик их в период конидиогенеза можно объяснить необходимостью активного транспорта метаболитов из клеток вегетативного мицелия в стеригмы и формирующиеся конидии.
Обнаруженная нами у А. niger разнокачествен-ность конидий по отсутствию и наличию запасных веществ, их типу и сочетанию, объясняет ранее описанную для зрелых гиф его вегетативного мицелия гетерогенность ультраструктуры, которая, по-видимому, детерминирована генетически уже на уровне конидий. Можно ожидать, что, в зависимости от качественного состава конидий инокулюма будет меняться и ультраструктура образуемых ими гиф мицелия. Определенные коррективы в ультраструктуру мицелия, безусловно, внесет и характерный для клеток его гиф гетерокариозис — объединение ядер (дикарион) и слияние содержимого клеток монока-риотического мицелия путем образования анастомозов. В связи с этим интересно проследить в условиях эксперимента насколько стабильной будет ультраструктура гиф мицелия, образованного одной и двумя конидиоспорами этого штамма гриба.
Не исключено, что выявленная особенность может быть основополагающим моментом биологии развития, по-видимому, не только данного штамма и вида гриба, но возможно и всех представителей рода Aspergillus.
ВЫВОДЫ
1. Формирование конидиеносца и головки у изученного штамма A. niger сопровождается увеличением числа ядер, митохондрий (с формированием митохондриального ретикулума) и цистерн ЭР, синтезом цитозоля, свободных рибосом и запасных веществ. Конидиеносец и головка зрелого конидио-генного аппарата в колониях гриба через 2 и 3 дня после посева, бедны запасными веществами, тогда как в аналогичных ситуациях через 5, 10 и 15 дней после посева содержат обильные скопления розеток а-гликогена , начиная с самых ранних стадий своего развития. Конидиеносцы и головки конидиогенных аппаратов сохраняют активный ультраструктурный облик вплоть до завершения конидиогенеза.
2. Формирование стеригм первого и второго рядов на ранних стадиях развития конидиогенного аппарата происходит сходно, тогда как на поздних стадиях - между ними имеются различия, состоящие в том, что в стеригмах второго ряда раньше аккумулируются запасные вещества.
3. У А. niger рост конидий, закладка и формирование слоев их клеточной стенки, а также миграция ядер и других органелл завершаются перед формированием отделительной септы в их основании, те есть в период, когда они находятся в связи с содержимым формирующих их стеригм. Позже в базипетальном направлении происходит процесс их созревания, сопровождающийся синтезом запасных веществ, их обезвоживанием (с уменьшением размеров), упрощением в строении спородермы. Стеригмы второго ряда у Л. яг§ег формируют разнокачественные конидии, различающиеся по наличию или отсутствию, а также типу запасаемых ими веществ. Клеточная стенка закончивших рост конидий состоит из пяти слоев, тогда как зрелых - только из двух. Закладка конидий происходит по эндо- (энтеро)бластическому типу.
4. Из всех изученных стерильных клеток зрелых конидиогенных аппаратов А. niger, конидиеносцы и головки имеют наиболее активную ультраструктуру.
5. Первые признаки старения конидиогенного аппарата отмечаются для конидиеносца и головки, затем они распространяются на стеригмы первого и второго ряда. Общий ход ультраструктурных преобразований (усиление вакуолизации, исчезновение запасных веществ, уменьшение числа органелл и др.) был идентичен при старении для всех изученных типов клеток конидиогенного аппарата.
ЛИТЕРАТУРА
1. Тапака K., Yanagita Т. Electron microscopy on ultrathin sections of Aspergillus niger. II. Fine structure of conidia-bearing
apparatus//J. Gen. Appl. Microbiol. - 1963. - Vol.9, №2. - P. 189-204.
2. Trinci A.P.J, Peat A., Banbury G. H. Fine structure of phialide and conidiospore development in Aspergillus giganteus //Ann.
Bot. - 1968,- Vol. 32, №2. - P.241-249.
3. Oliver P.T.P. Conidiophore and spore development in Aspergillus nidulans/lJ. of Gen. Microbiol. - 1972. -Vol. 73. - P. 45-54.
4. Hanlin R.T. Phialide and conidium development in Aspergillus clavatus!/Amer. J. Bot. - 1976. - Vol. 63. - P. 144-155.
5. Mims C.W., Richardson E.A., Timberlake W.E. Ultrastuctural analysis of conidiophore development in the fungus Aspergillus
nidulans using freeze-substitition//Protoplasma. - 1988. - Vol. 144. - P.132-141.
6. Vujicic R., Muntanjola-Cvetkovic M. A comparative ultrastructural study on conidium differentiation in the Cladosporium-like
mutant 22b of Aspergillus aureolatus!/J. Gen. Microbiol.- 1973. - Vol. 79.- P. 45-51.
7. Bojovic-Cvetic D., Vujicic R. Ultrastructure of conidiophores in Aspergillus flavus!¡Тшш,. Brit. Mycol. Soc. Bot. - 1974. - Vol.
63, №1. - P. 131-135.
8. Deans S.G., Gull K., Smith JE. Ultrastructural changes during microcycle conidiation of Aspergillus niger 11 Trans. Br. Mycol. Soc.
- 1980,- Vol. 73, №3. - P. 493-499.
9. Tanaka K., Yanagita T. Electron microscopy on ultrathin sections of Aspergillus niger. I. Fine structure of hyphal cells//J. Gen.
Appl. Microbiol. - 1963. - Vol. 9, №1. - P. 101-118.
10. Subramanian C.V. Hyphomycetes an account of Indian species except Cercosporae New Dehli: Indian Cone. Agr. Res. - 1971.
- 900 p.
11. Weisberg S.H., Turian G. Ultrastructure of Aspergillus nidulans conidia and conidial lomasomes//Protoplasma. - 1971. - Vol. 72. - P. 55-67.
12. Griose W. C., Edwards M. R. Ultrastructure of Aspergillus fumigatus conidia development and maturation// Protoplasma.
- 1973. - Vol.76. - P. 49-59.
13. Fletcher J. Electron microscopy of genesis, maturation, and wall structure of conidia of Aspergillus terreus! / Trans. Brit. Mycol. Soc.- 1976. - Vol. 66, №1. - P. 27-34.
14. McKeen M.B.E., Jarvie N., Smith R. Electron microscopy studies of conidial walls of Sphaerotheca marularis, Penicillium levi-tium, Aspergillus niger 11 Can. J. Bot.- 1966. -Vol. 12, №3. - P. 427-428.
15. Tsukahara Т., Itagaki T. Micromorphology of conidiospores of Aspergillus niger by electron microscopy //Jap. J. Microbiol.
- 1966 . - Vol. 10,- P. 93-107.
16. Florance E.R., Denison W.C., Allen T.C. Ultrastucture of dormant and germinating conidia of Aspergillus nidulansl I Mycologia.
- 1972.-Vol. 64, №1,- P. 115-123.
17. TiedtL.K. Electron microscopic study of conidiogenesis and wall formation of conidia of Aspergillus niger// Mycol. Res.- 1993.
- Vol. 97, № 12. - P. 1459-1462.
18. Степанова A.A., Синицкая И.А. Ультраструктура клеток Aspergillus niger van Tieghem.BereTaTMBHbifi мицелий 11 Ж. Проблемы мед. микологии . - 2003.-Т.5, №4. - С.32-39.
19. Robinson Р. М., Park D., McClure W.K. Observations on induced vacuoles in fungi//Trans. Brit. Mycol. Soc. - 1969. - Vol. 52, №3. - P. 447-450.
20. Clutterbuck A.J. Cell volume per nucleus in haploid and diploid strains of Aspergillus nidulans//]. Gen. Microbiol. - 1969a.
- Vol. 55 . - P. 291-299.
21. MerkusE. Ultrastructure of the ascospore wall in Pezizales. l.Ascodesmis microscopica andA nigricans 11 Protoplasma. - 1973.
- Vol.7, №3. - P. 351-366.
22. YuillE. The number of nuclei in conidia of Aspergilli!/Trans. Brit. Mycol. Soc.- 1950. - Vol. 23, № 1. - P. 324-331.
23. Baracho I.R., Coelho W.R. Environmental factors affecting proportions of binucleate conidia in Aspergillus niger 11 Trans. Br. Mycol. Soc.- 1980. - Vol.74, №1,- P. 65-68.
24. Hawker L. E. Environmental influence on reproduction. In: The Fungi, New York : Academic Press. - 1966. - Vol. II.
25. Deveral B. J. The physical environment for fungal growth. In: The Fungi. New York : Academic Press. - 1965. -Vol. V.
26. Chang L.T., Carol Т., Tuverson R.W. The influence of heterokaryotic conidia on the selective recovery of somatic diploids in Aspergillus wiffer//Mycologia. - 1974. - Vol. 66, № 1. - P. 67-72.
27. YuillE., Yuill J.L. Cladosarum olivacearum, a new Hyphomycetes//Trans. Brit. Mycol. Soc. - 1938. - Vol. 22. - P. 194-200.
28. RaperK.B, Fennel D.I Heterokaryosis in Aspergillus//]. Elisha Mitchell. Sei. Soc.- 1953. - Vol. 69 - P. 1-29.
29. Clutterbuck A.J. A mutational analysis of conidial development in Aspergillus nidulansl/Genetics. - 1969b.- Vol. 63. - P. 317327.
Поступила в редакцию журнала 20.02.04 Рецензент: А. Е. Васильев
