CC BY
24УДК 616.002.828____________________________
УЛЬТРАСТРУКТУРА КЛЕТОК ASPERGILLUS NIGER VAN TIEGHEM. ВЕГЕТАТИВНЫЙ МИЦЕЛИЙ
А. А. Степанова, И. А. Синицкая
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования, Санкт-Петербург, Россия
© A.A. Степанова, И.А. Синицкая, 2003
Изучена ультраструктура воздушного и погруженного мицелия A. niger. Штамм, выделенный от больного отоми-козом, культивировали in vitro и исследовали через 2, 3, S и 10 дней после посева на среду Чапека. Особое внимание уделено апикальному сегменту гиф и поровому аппарату септ.
Ключевые слова: Aspergillus niger, вегетативный мицелий, тельца Воронина, ультраструктура
ULTRASTRUCTURE OF ASPERGILLUS NIGER VAN TIEGHEM. VEGETATIVE MYCELIUM
A. A. Stepanova, I. A. Sinitskaya
Kashkin Research Institute of Medical Mycology, Saint Petersburg Medical Academy of Postgraduate Education, Russia
© A. A. Stepanova, I.A. Sinitskaya, 2003
The ultrastructure of A. niger aerial and submerged mycelia have been studied. The strain isolatedfrom otomycoses suffering patient was studied in 2, 3, S and 10 days after inoculation and cultiwating in Czapek medium. Particular attention was given to the apical segment ofhyphae and septal pore apparatus.
Key words: Aspergillus niger, ultrastructure, vegetative mycelium, Woronin bodies
ВВЕДЕНИЕ
A. niger — широко распространен в природе, является контаминантом пищевых продуктов и жилых помещений, активным биодеструктором промышленных субстратов, широко используется в утилизации различных отходов. Он — продуцент лимонной кислоты и ряда ферментов, а также потенциальный возбудитель заболеваний человека [1-7]. Согласно Шустер (Schuster Е.) с соавторами [4], 3-10% протестированных штаммов этого вида синтезировали афлатоксин, охротоксин А и нитрогиллин. У человека этот вид может вызывать инвазивный аспергил-лез легких и ЦНС [5], легочную аспергиллему [6], перитонит [7], аллергическое состояние у больных, ослабленных туберкулезом, поражает горло, ушную раковину и слуховой проход [2, 3, 5]. Этот патоген также выделен из костного трансплантата человека [3]. В пораженных тканях человека A. niger встречается в виде разветвленного мицелия из гиф диаметром 2,5-3 мкм, иногда формирующего в легких конидиальное спороношение [2].
Изучение ультраструктуры клеток вегетативного мицелия A. niger, выделенного из какого-либо материала (в том числе — от больных), важно для его достоверной идентификации. Имеющаяся в литературе информация о тонком строении гиф вегетативного мицелия A. niger в культуре in vitro довольно скудна и касается лишь строения содержимого кончика апикальных [8-10] и других сильно вакуо-лизированных клеток [11-12]. Мы представляем результаты электронно-микроскопического изучения клеток вегетативного мицелия A. niger, выращенного в стационарной культуре in vitro на агаризированной питательной среде.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследовали штамм ВКПГ I--1124 A. niger из коллекции НИИ медицинской микологии им. П. Н. Кашкина СПб МАПО, выделенный от больного (И. И., 28.11.97 г.) отомикозом. Культуру гриба выращивали на агаре Чапека в термостате при температуре 27 °С. Кусочки среды с воздушным и субстратным мицелием из периферической, средней и центральной частей колонии гриба фиксировали через 2, 3, 5 и 10 дней роста смесью глутаральдегид-па-раформальдегидом и постфиксировали осмием. В качестве буфера использовали какодилат натрия (pH 7,2). Материал заливали в смесь эпоксидных смол эпон-аралдит по общепринятой методике [16]. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-V, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца. Изучение срезов проводили на электронном микроскопе трансмиссионного типа JEM 100СХ-2.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
Колония A. niger через два дня после посева имела диаметр 0,5 см и представляла собой белый хорошо развитый мицелий. Через три дня после по-
сева диаметр колонии возрос до 1,0 см. Центральная черная часть этой колонии (диаметр 7 мм) состояла из элементов конидиального спороношения на разных стадиях развития. Периферическая (более молодая) часть колонии была сформирована белыми гифами мицелия. Пятидневная колония (диаметр 2 см) имела сходное строение. В ней зона конидиального спороношения занимала больший диаметр (1,8 см). Колония гриба через десять дней после посева разрослась до 3 см, из которых 2,8 см было занято зоной конидиального спороношения.
Воздушный мицелий. Средний диаметр гиф воздушного мицелия А. niger колебался в пределах 1,0-2,0 мкм. Воздушный мицелий в двухдневной культуре состоял из невакуолизированных клеток с темным цитозолем и плохо различимыми редкими органеллами (Рис. 1.2 а; 2 а). В трех и пятидневной культуре появлялись клетки со светлым цитозолем (Рис. 1.2 б; 2 б), в них становились четко различимыми два ядра эллипсоидной формы (1,Ох 2,0 мкм), расположенные в разных концах клетки. Нуклеоп-лазма была светлее цитозоля и содержала хроматин диффузного типа, а также 1 мелкое (0,3 мкм) ядрышко, сдвинутое к оболочке ядра. Ядрышко состояло из гранул и фибрилл, занимающих на срезе ядрышка одинаковую площадь. Хондриом был умеренно развит. Составляющие его элементы занимали пристенное положение, имели длинные профили. Матрикс органелл плотный, содержал большое число крист. Вакуоли — многочисленные, в их светлом содержимом вблизи тонопласта отмечали средних размеров (0,3-0,4 мкм) темные глобулы. Из запасных веществ в цитозоле наблюдали редкие крупные (1,0-1,5 мкм) одиночные липидные включения, имеющие неправильный контур и светлую периферическую кайму. Компоненты эндомембранной системы и другие органеллы не выявляли. Плазмалемма ровная, плотно примыкала к тонкой (0,09 мкм) светлой клеточной стенке гранулярной структуры. Часть клеток в центральной и средней частях колонии находилась на стадиях старения и отмирания.
В десятидневной культуре (период максимального спороношения) липидные включения из большей части гиф воздушного мицелия, сосредоточенных в зоне формирования конидиальных головок, полностью исчезали. Частота встречаемости стареющих и опустошенных клеток по направлению к центру колонии возрастала.
Субстратный мицелий. В периферический части колонии апикальные клетки гиф имели диаметр не более 1,0 мкм независимо от возраста колонии. Эти клетки характеризовались полярным строением: в базальной части клетки (вблизи септы) располагалась вакуоль среднего размера (Рис. 1.1 а-е; 2 в), а апикальная часть была занята цитозолем, практически свободным от крупных органелл. В верхушечной части можно было различить апикальную (1-2 мкм) и субапикальную зоны (Рис. 2 г). В первой имело место скопление большого числа крупных (0,07-0,10
мкм) равномерно распределенных пузырьков с фибриллярным содержимым. Редко отмечали картины их экзоцитоза. Из двух других исследованных видов аспергиллов [13], у A. giganteus в апикальном куполе растущих гиф мицелия также наблюдали скопление крупных светлых пузырьков. У второго вида — A. ni-dulans центральная часть апикального купола была занята типичным апикальным тельцем, состоящим из скопления мелких (0,31 мкм) пузырьков; крупные пузырьки располагались на периферии тельца [13]. В связи с этим интересно отметить, что мелкие пузырьки в апексах гиф A. niger не были обнаружены также другими авторами [10], но они были описаны у этого же вида МакКлюром (McClure) с соавт. [9].
Во второй, субапикальной зоне концевой клетки гиф A. niger находились цитозоль, свободные рибосомы и длинные, часто разветвленные, профили митоходрий. Возможно, что они представляют собой сечения единой системы — митохондриального ретикулума. Ранее митохондриальный ретикулум для этого вида гриба был описан в работе Танака (Tanaka) с соавт. [8].
В центральной части клетки локализовались два ядра. Ядра мелкие (0,6x0,7 мкм), эллипсоидной формы, с ровной оболочкой, плотно примыкали друг к другу. Ядрышко (0,2 мкм) эксцентричное, гранулярно-фибриллярного строения. Гранулярный компонент его формировал небольшие скопления неправильной формы. Нуклеоплазма светлее цитозоля, содержала диффузный хроматин. Элементы эндоп-лазматического ретикулума (ЭР) — редкие короткие гранулярные цистерны. Микротельца, одиночные цистерны аппарата Гольджи, мультивезикулярные тельца и запасные вещества в апикальных сегментах гиф не наблюдали. Клеточная стенка тонкая (0,08 мкм), однослойная, светлая, гранулярная, покрытая тонким слоем фибриллярной слизи.
По мере роста диаметр клеток увеличивался до 2,7-5,5 мкм. Возрастал уровень вакуолизации. Вакуоли возникали за счет расширений элементов ЭР. Для клеток вегетативного мицелия A. niger аналогичный путь формирования вакуолей ранее отмечался другими авторами [12]. Ядра располагались вне связи друг с другом (Рис. 2 д, е), размер их по сравнению с ядрами в апикальных клетках заметно увеличивался (1,2x1,6 мкм). Ядрышко также увеличивалось (0,5 мкм), причем в основном за счет гранулярного компонента. Все эти признаки характеризуют возросшую активность ядра. Снаружи ядра в плотном контакте с его оболочкой можно наблюдать темное плоское полярное тельце веретена (Рис. 2 е). Под ним располагался блок конденсированного хроматина. По-прежнему в клетке отмечали хорошо развитый митохондриальный ретикулум. Длинные профили митохондрий отмечались также для клеток вегетативных гиф A. nidulans [14]. ЭР не изменялся. Здесь уместно отметить, что характерные для клеток вегетативного мицелия A. flavus [15] стопки из параллельных друг другу коротких цистерн ЭР, лока-
лизованные вблизи ядра, в исследуемом материале отсутствовали. Одиночные цистерны аппарата Голь-джи не обнаружены. Частота секреторных пузырьков уменьшалась, помимо крупных светлых появлялись мелкие серые. Как исключение в цитозоле можно было наблюдать массивное скопление концентрически ориентированных трехслойных мембран, отличающихся своим высоким контрастом (Рис. 1и). Изредка вблизи клеточной оболочки встречались небольшие ломасомы, содержащие трубочки и пузырьки разного диаметра. Ранее их отмечали также для вегетативного мицелия Л. тйи1ат [14]. Появлялись микротельца. Цитозоль, умеренно электронноплотный, был насыщен рибосомами. Плазмалемма формировала пальцевидные выросты разной протяженности. Клеточная стенка утолщалась до 0,2 мкм, возрастал и прилегающий к ней слой слизи.
По интенсивности вакуолизации, количеству и типу запасных веществ во всех изученных нами колониях можно выделить четыре типа зрелых клеток (Рис. 1.2 в-г), что, вероятно, является доказательством наличия, по крайней мере, четырех путей дифференциации гиф.
Клетки первого типа (Рис. 1.2 в; 2 д) содержали большое число собранных в группы вакуолей разного размера. Характерные особенности клеток — отсутствие вакуолярных включений и низкий уровень запасных веществ в цитозоле, представленных одиночными редкими липидными включениями на периферии клетки. В ходе последующего развития формировалась центральная вакуоль (Рис. 1.3 в; 3 а), в содержимом которой отмечали неправильной формы сгустки темного фибриллярного материала и обрывки мембран разной протяженности и конфигурации. Часто наблюдали картины локального автолиза цитозоля с участием тонопласта. Ядра уменьшались в размерах (до 0,6x0,1 мкм), приобретали эллипсоидную форму, нуклеоплазма уплотнялась. Размеры ядрышка уменьшались в 2 раза. Эти изменения — признак снижения активности ядер. Электронная плотность цитозоля возрастала настолько, что органеллы переставали выявляться. Запасные вещества исчезали. Ранее для сильно ва-куолизированных клеток мицелия А. niger отмечали низкое содержание запасных веществ [11].
В клетках второго типа вакуоли также были средних размеров, но они имели включения в виде одной крупной темной глобулы, контактирующей с тонопластом (Рис. 1.2 г; 3 б). По-видимому, эти глобулы содержат запасные белки. Запасные вещества в цитозоле полностью отсутствовали.
Характерными чертами ультраструктуры клеток третьего типа были вакуоли без включений, крупные (0,3-0,6 мкм) одиночные, либо собранные в небольшие группы своеобразные, со светлой периферической каймой, липидные включения и цитозоль повышенной электронной плотности (Рис. 1.2 д; 3 в). Отличительной особенностью ультраструктуры клеток четвертого типа было отсутствие вакуолей и наличие
массивных светлых скоплений розеток альфа-гликогена, заполняющих основной объем цитоплазмы (Рис. 1.2 е; 3 г). Гликоген состоял из сферических розеток диаметром 0,05-0,09 мкм, находящихся в плотном контакте друг с другом (Рис. 3 д). Встречались также редкие мелкие липидные включения умеренной электронной плотности, занимающие пристенное положение. Сходные скопления гликогена были описаны в гифах вегетативного мицелия A. nidulans (14).
При переходе колонии гриба к конидиальному спороношению запасные вещества из клеток субстратного мицелия исчезали, в них формировалась центральная вакуоль (Рис. 1.3 а-е) и происходили процессы старения. В клетках первые признаки старения затрагивали ядра и митохондрии. Ядра набухали и приобретали неправильную форму (Рис. 3 е). Нуклеоплазма просветлялась, ядрышко уменьшалось, уплотнялось и, наконец, исчезало. Митохондриальный ретикулум распадался на отдельные митохондрии, число которых затем уменьшалось. Матрикс их просветлялся, кристы сокращались в числе и затем исчезали. Тонопласт вакуолей фрагментировался, цитозоль просветлялся, плотность распределения свободных рибосом уменьшалась.
Поровый аппарат септ. Клетки гиф мицелия A. niger отделены друг от друга однослойными клиновидными септами такого же строения, как и латеральные стенки. Толщина септ вблизи латеральной стенки составляет 0,17 (0,15-0,19) мкм, а в средней их части — 0,10 (0,08-0,13) мкм. Плазмалемма, ограничивающая септы растущих клеток, сильно извилистая (Рис. 4 а, в), а закончивших рост — ровная (Рис. 4 д, е). Диаметр септальных пор варьирует от 0,09 до 0,17 мкм, составляя в среднем 0,13 мкм. В литературе [8] для этого вида приводят меньшую цифру — 0,08 мкм. Тельца Воронина имеют довольно стабильный (0,23 мкм) диаметр, число их на срезе варьирует от 1 до 5. Положение телец по отношению к поре варьирует. Как правило, поры открыты; лишь очень редко одно тельце Воронина закрывает пору (Рис. 4 д). Робинсон (Robinson) с соавт. [12] также отметили открытые септальные поры в зрелых клетках у этого вида гриба. Чаще всего на медианном срезе септы можно видеть четыре тельца, расположенных симметрично относительно друг друга и на некотором удалении от поры (Рис. 4 б). На очень немногих медианных срезах септ тельца Воронина отсутствуют. По литературным данным (9), в апикальной клетке гифы A. niger тельца Воронина 0,13-0,14 мкм в диаметре были видны недалеко от апикального купола. Вне связи с септой тельца были обнаружены также в апикальной клетке гиф вегетативного мицелия Л. giganteus [13]. По нашим данным, в стареющих клетках A. niger тельца Воронина часто теряют связь с септальными порами (Рис. 3 е).
Форма телец Воронина в молодых клетках гексагональная, электронная плотность умеренная (Рис. 4 a-в); в зрелых клетах форма их становится округлой
или слегка эллипсоидной, электронная плотность возрастает (Рис. 4 г, д). Ограничивающая тельца мембрана трехслойная, сходная по толщине и структуре с плазмалеммой.
Интересно отметить, что в смежных клетках, различающихся по электронной плотности цитозоля, септальная пора может быть закрыта не тельцем Воронина, а куполообразной, слегка извилистой электронноплотной ламеллой (Рис. 4 в, показано стрелкой).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Нами показано, что для клеток гиф вегетативного мицелия изученного штамма A. niger характерно наличие двух ядер с незначительным содержанием диффузного хроматина (хромоцентрический тип), что характерно для грибов [16] и объясняется низким числом хромосом в них. По мере дифференциации клеток гиф субстратного мицелия их ядра теряли групповое расположение, отмечалось увеличение их размеров, а также ядрышек. Последнее свидетельствует о перехода клеток на более высокий уровень метаболизма.
На основании сравнительного анализа полученных данных показано, что клетки гиф воздушного мицелия, в целом, слабее вакуолизированы, беднее митохондриями и запасными веществами, чем клетки гиф субстратного мицелия. Судя по ультраструктуре, они выглядят малоактивными; их функции — механическая и, частично, запасающая. Субстратный мицелий выглядит метаболически более активным. Он содержит ядра с крупными гранулярными ядрышками, хорошо развитый мито-
ЛИТЕРАТУРА
1. Билай В. И., Коваль 3.3. Аспергиллы. Определитель. — Киев: Наукова думка, 1988.- 204 с.
2. Кашкин П.Н. и др. Определитель патогенных, токсигенных и вредных для человека грибов. — Л: Медицина, 1979. — 240 с.
3. de Hoog G. S., Guarro J, Gene J, Figueras M. J. Atlas of Clinical Fungi 2d ed. BS, Utrecht the Netherlands; Universität Rovira I Virgili Reus, Spain, 2000.
4. Schuster E., Dunn-Coleman N, Frisvad J. C., van Dijck P. W. M. On the safety of Aspergillus niger — a review// Applied Microbiology and Biotechnology.— 2002 — Vol. 58. — P. 426-435.
5. Блинов H.П., Митрофанов В. С., Чернопятова P.M. Аспергиллезная инфекция: подходы к ее диагностике// Ж. Проблемы медицинской микологии. — 2002. — Т.4, № 1. — С. 4-16.
6. Korzenioswka-Kosela М., Haiweg H., Bestry Б., et al. Pulmonary aspergüloma caused by Aspergillus niger// Pneumon. Pol. — 1990. — Vol.3. — P. 328-333.
7. Bibasi Т., Papagiannis A., Kelesidis A., et al. Peritonitis due to Aspergillus niger in a patient on continuous ambulatory peritoneae dialysis shortly after kidney graft rejection// Nephrol. Dial. Transpl. — 1993. — Vol. 8. — P. 85-7.
8. Tanaka K., Tomomichi Y. Electron microscopy on ultrathin sections of Aspergillus niger. I. Fine structure of hyphal cells// J. Gen. Microbiol. — 1963.- Vol.9, №1. — P. 101-118.
9. McClure W.K., Park D., Robinson P.M. Apical organization in the somatic hyphae of fungi// J. gen. Microbiol. — 1968. — Vol. 50, №2, — P. 177-182.
10. Grove S.N, Bracker C.E. Protoplasmic organization of hyphal tips amongst fungi: vesicles andSpitzenkorper// J. Bact. —1970.-Vol.104, N2. — P. 989-1009.
11. Tsukahara T.M., Yamada M. Cytological structure of Aspergillus niger by electron microscopy// Jap. J. Microbiol., 1965. — Vol.9, № 1,- P. 35-48.
12. Robinson P.M., Park D., McClure W.K. Observations on induced vacuoles in fungi// Trans. Brit. Mycol. Soc. — 1969. — Vol. 52, №3, — P. 447-450.
хондриальный ретикулум, многочисленные свободные рибосомы и запасные вещества. Более высокий уровень метаболизма субстратного мицелия связан с тем, что, с одной стороны, он тесно контактирует с питательной средой, а с другой — формирует элементы конидиального спороношения, что требует больших энергозатрат.
На основании этих данных можно считать, что в процессе развития A. niger происходит дифференциация не только клеток, но и гиф субстратного и, в меньшей степени, воздушного мицелия: в первом можно выделить по крайней мере 4, во втором — 2 типа гиф. Указанные типы происходят из апикальных клеток одинаковой структуры. Наличие разных типов гиф служит доказательством и разных, присущих им, типов метаболизма (липидного, белкового, углеводного); этим, наряду с широким спектром секретируемых ферментов, можно объяснить выраженную пластичность A. niger и способность его колонизировать разные субстрата, включая ткани человека.
Переход колоний гриба к конидиальному спо-роношению сопровождается утилизацией запасных веществ из клеток воздушного, а затем и субстратного мицелия с последующим их старением и отмиранием.
Признаки порового аппарата септ, по сравнению с другими ультраструктурными характеристиками гиф, более заманчивы для использования на практике в целях идентификации видов. Однако, для решения этого вопроса необходимо изучение других видов рода Aspergillus.
13. Collinge /., Мягкат P. Hyphal tip ultrastructure of Aspergillus nidulans and Aspergillus giganteus and possible implications of Woronin bodies close to the hyphal apex of the latter species// Protoplasma. — 1982. — Vol.113. — P. 209-213.
14. Weisberg S. H., Turian G. The memraneous type of lomasome (membranosome) in the hyphae of Aspergillus nidulans// Protoplasma. — 1974.- Vol.79, №3-4. — P. 377-389.
15. Bojovic-Cvetic IX, Vujicic R. Membanous aggregations associated with nucleis in Aspergillus flaws hyphae// Protoplasma. — 1976. — Vol.88, № 1. — P. 25-29.
16. Степанова А, А., Васильев A. E. Ультраструктурные основы морфогенеза шляпочных грибов. — Ашхабад: ЫлымД994,-263с.
Рисунок 1 и фотографии 1-4 к статье A.A. Степановой и И.А. Синицкой
■°10 --------О-----------
:оАо Ч—---------------------------------
of о
С
-^OfO
о|о
0*0 — ЯШ* 0 у
010
Ядр
гш - I ' I ГХiS
\Т] < > ¿J? Щу 'ff •!?;
/• qjp I soiayWzЯтт jy
В
a
ЭР
TB
Гß ®s~
ы° —^ oiol
"öyö
О l о
6
ojo<
о i gfflS>0 10
........ ТГ
iorc. /-^11
pr», ;°jo
£
T*!
ajoi
oFo-^flEES^.ofö" о I 0 О i о
лк
5. с _5 (Л;.
¿Ql Q°cnrrrr. I.ViiU4-
Рис. 1. Схема, иллюстрирующая типы гиф воздушного (а, б) и субстратного (в-е) мицелия А. гмдег, выращенного на среде Чапека.
Апикальная (1), зрелая (2) и стареющая (3) клетки гиф.
Условные обозначения (здесь и на фото 2-4):
В — вакуоль; Г — гликоген; КО- клеточная стенка; Л К — липидная капля; М — митохондрия; ПТВ — полярное тельце веретена; Пз—пузырьки; С — септа; СП — септальная пора; ТГ — темная глобула; ТВ — тельце Воронина; ЭР — эндоплазматический ретикулум; Яд — ядро; Ядр — ядрышко.
Рис. 2. Клетки воздушного (а, б) и субстратного (г-ж) мицелия А. п1дег, выращенного
на среде Чапека.
Ув.: а — Х37000; б — х11520; в — х10260; г — Х35000; д — х12800; е — Х26000; ж — Х28000.
Рис. 3. Интактные (а-д) и стареющая (и) клетки субстратного мицелия А. тдег, выращенного на питательной среде Чапека.
Ув.: а — Х24300; б — Х23400; в — х15700; г — х21780; д — Х72000.
Рис. 4. Строение порового аппарата септ клеток субстратного мицелия А. підег, выращенного на среде Чапека. Стрелкой (рис. в) показана темная ламелла в
септальной поре.
Ув.: а — х11280; б — Х58000; в — Х58000; г — Х84580; д — Х84580; е — Х40600.
Поступила в редакцию журнала 09,12,2003 Рецензент: В, А, Мельник
