CC BY
10
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVII, № 2, 2021
ется, что клетка-предшественница ETP имеет полипотентные черты как Т-клеток, так и миелоидных предшественников. Одна из черт, характеризующая Т-клетку - реаранжировки генов Т-клеточного рецептора (TCRr), которые происходят уже на самых ранних этапах развития Т-клетки. Клональные TCRr находят у 95% больных с T-ОЛЛ. При этом неполные перестройки TCRD (VS2/DS2-DS3) не являются линейно-специфичными и могут определяться даже при ОМЛ. Гены S-цепи TCR (TCRD) - самая ранняя генная перестройка в T-лимфоцитах, встречается примерно в 50-55% случаев Т-ОЛЛ, гены у-цепи TCR (TCRG) перестроены у 95% пациентов, гены ß-цепи TCR (TCRB) - у 92% пациентов. Частота и характер TCRr при ETP-ОЛЛ не изучены, хотя известно, что TCRr происходят значительно реже чем при Т-ОЛЛ. Кроме того, особый интерес представляют данные о стабильности TCRr в рецидивах заболевания со сменой ИФ.
Цель. Определить характер и стабильность клональных реаранжировок генов T-клеточных рецепторов у пациентов с ETP-ОЛЛ и прочими ОЛЛ с коэкспрессией Т/миелоидных маркеров. Изучить связь между TCRr и иммунологическими маркерами, характеризующими зрелостью Т-лимфоцитов (cyt CD3).
Материалы и методы. Всего исследовано 36 пациентов: 21 ETP-ОЛЛ, 10 T-ОЛЛ с коэкспрессией миелоидных маркеров и 5 острых лейкозов со смешанным Т/миелоидным фенотипом (ОЛСФ), которые наблюдались в "НМИЦ Гематологии" МЗ РФ с 2015 года. У 14 пациентов проведен сравнительный анализ реаранжировок в дебюте и рецидиве/ах заболевания. Исследование реаранжировок генов TCRD, TCRG и TCRB проводили методом ПЦР по протоколу BIOMED-2 с последующим капиллярным электрофорезом на секвенаторе ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems).
Результаты. У 52% (11 из 21) пациентов с ETP-ОЛЛ не было выявлено никаких TCRr, т. е. гены TCR находились в терми-
нальном состоянии, либо были выявлены только неполные реаранжировки ТС^О, что указывало на отсутствие признаков "генетической дифференцировки" в сторону Т-лимфоцитов. У остальных пациентов выявлялись реаранжировки одной или нескольких цепей TCR. Среднее количество ТС^г на одного пациента было самым низким в группе ЕТР-ОЛЛ (1,2), чуть выше у пациентов с Т-ОЛЛ с коэкспрессией миелоидных маркеров (2,1) и в группе с ОЛСФ -3,8, при этом различия были недостоверны из-за малой выборки. Корреляция количества TCRг и су£03 отсутствовала (р=0,2), т. е. даже при 99,9% экспрессии су£03 гены Т-клеточного рецептора могли находиться в терминальном состоянии и наоборот. Мы исследовали и сравнили TCRг в дебюте и в рецидивах заболевания у 14 пациентов. У 4-х пациентов из 14 (29%) мы выявили частичную смену TCRг в рецидиве, в основном за счет приобретения новых, более "зрелых" реаранжировок TCRB, что очевидно можно связать с работой ферментов RAG1 и RAG2, которые отвечают за процесс V-D-J рекомбинации. У 71% (10 из 14) новых TCRг в рецидивах не появилось, а выявленные в дебюте были стабильны. Большинство из этих пациентов (8 из 10) имели "незрелый" характер TCRг, что может указывать на дефицит ферментов RAGl и RAG2 в опухолевых клетках, как в дебюте, так и в рецидиве заболевания. Мы исследовали TCRг у 3-х пациентов с рецидивами и сменой ИФ. У 100% (3 из 3) при смене ИФ клональные TCRг не изменились, т.е. опухолевый клон в рецидиве остался прежним.
Выводы. ЕТР-ОЛЛ в 52% случае демонстрирует "незрелый" профиль TCRг (полное отсутствие или наличие только неполной реаранжировки TCRD). При этом четкой связи между наличием ТС^г и экспрессией cytCD3 не выявлено. TCRг имеют высокую стабильность при рецидивах, даже в случаях смены ИФ с Т-клеточного на миелоидный, что доказывает полипотент-ность клеток-предшественников ЕТР-ОЛЛ.
Ю.В. Сидорова, Н.А. Северина, Б.В. Бидерман, Н.В. Рисинская, О.А. Глинщикова, А.С. Пшеничный, И.А. Лукьянова, Е.Н. Паровичникова, А.Б. Судариков
МОНИТОРИНГ МУТАЦИИ FLT3-ITD МЕТОДОМ TD-PCR
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г.Москва
Введение. Мутация FLT3-ITD - внутренняя тандемная дупликация в 14 экзоне/интроне гена FLT3, является одной из самых частых мутаций при остром миелобластном лейкозе (ОМЛ) и встречается в 25-30% случаев. Как фактор неблагоприятного прогноза данная мутация интересна для мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ). Однако непостоянное место и вариабельный размер (от нескольких нуклеотидов до >200 Ьр) вставки затрудняет ПЦР диагностику. Недавно предложенный метод TD-PCR обладает достаточной чувствительностью 10-4-10-5 для отслеживания МОБ. В основе метода - система из 8-ми пар праймеров, которые перекрывают возможную зону дупликации. В каждой паре прямой и обратный праймер комплементарны друг другу, и в случае отсутствия вставки FLT3-ITD ПЦР амплификация не происходит. Если есть дупликация FLT3, то один из праймеров "садится" на дуплицированный участок, что приводит к появлению амплификата равного длине вставки плюс длина праймера. При помощи капиллярного электрофореза и фрагментного анализа можно выявить амплификат нужной длины. Ниже мы приводим первые результаты применения данного метода для мониторинга МОБ при ОМЛ.
Цель. Оценить возможности метода TD-PCR при оценке МОБ у пациентов с ОМЛ.
Материалы и методы. Всего исследовано 53 пациента с ОМЛ с FLT3-ITD мутацией, наличие которой было доказано методом фрагментного анализа стандартными протоколами. Все пациенты наблюдались или проходили первичное обследование в "НМИЦ Гематологии" МЗ РФ с 2018 года. Для
TD-PCR применяли методику, описанную ранее.
Результаты. У 56,6% (30 из 53 пациентов) с FLT3-ITD удалось выполнить TD-PCR, т.е. при первичном тестировании и также при разведении в 1000/ 10000 раз выявлен амплифи-кат нужной длины. Основная причина невозможности применения данного метода - короткая вставка (у 21 из 53 пациентов - 39,6%). При размере вставки менее 40 нуклеотидов определение специфического продукта при фрагментном анализе невозможно из-за димеров праймеров схожего размера, а также слишком маленькой зоны посадки праймеров. У 2-х из 53 - 3,8% чувствительность метода оказалась недостаточной для определения МОБ, что было показано при первичном тестировании. У 4-х из 4-х пациентов без эради-кации клона FLT3-ITD перед трансплантацией аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК), такой же клон продолжал выявляться и после алло-ТГСК, а заболевание рецидивировало в сроки от 5 мес до 2, 5 лет.
Выводы. Метод TD-PCR приемлем для определения МОБ, однако чувствительность определения сильно варьирует от пациента к пациенту и в ряде случаев может быть недостаточной для определения МОБ, что требует первичного тестирования на серии разведений. Метод можно применить примерно у половины пациентов с FLT3-ITD, так как он не рассчитан на определение вставок длиной менее 40 нуклеотидов. Существенным недостатком является то, что метод TD-PCR неколичественный. Метод TD-PCR - универсальный метод для анализа FLT3-ITD, нетрудоемкий, не требующий пациент-специфичных праймеров.
