CC BY
142
УДК 616-006.441; 616.155.321
Клональные реаранжировки и опухолевые клоны при периферической Т-клеточной лимфоме
Ю. В. Сидорова1, Н. Г. Чернова1, Н. В. Рыжикова1, С. Ю. Смирнова1, М. Н. Синицына1, Ю. Е. Виноградова2, У. Л. Джулакян1, А. М. Ковригина1, Е. Е. Звонков1, А. Б. Судариков1* Тематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ, 125167, Москва, Новый Зыковский пр-д, 4
2Первый Московский государственный медицинский университет им И.М. Сеченова, кафедра госпитальной терапии № 2, 119435, Москва, Б. Пироговская ул., 4 *Е-таН: [email protected] Поступила в редакцию 24.03.2015
РЕФЕРАТ Определяли целесообразность и информативность молекулярно-генетического исследования клональности при периферической Т-клеточной лимфоме (ПТКЛ). Анализировали биоптаты пораженных органов, кровь и костный мозг 30 пациентов с диагнозом периферическая Т-клеточная лимфома. Клональность Т-клеток оценивали по реаранжировкам генов TCRG и TCRB методом ПЦР с последующим секвенированием фрагментов. Исследование клональности по генам TCRG и TCRB позволяет доказать наличие опухоли у большинства (97%) пациентов с ПТКЛ. Методом ПЦР показано поражение костного мозга и/или лейкемизация у большинства (93%) пациентов, тогда как морфологически поражение костного мозга подтверждено только у 73% пациентов. Множественные реаранжировки генов Т-клеточных рецепторов у и в, утрата и появление новых, присутствие нескольких опухолевых клонов обнаружено у 63% пациентов с ПТКЛ. Возможно, они связаны с генетической нестабильностью при ПТКЛ. Сделан вывод, что наличие множественных клональных реаранжировок TCRG и TCRB при ПТКЛ должно учитываться при использовании данного метода в диагностических целях. Клональная эволюция опухоли, появление новых клональных пиков (клонов) не свидетельствуют о появлении новой опухоли. Множественные реаранжировки генов TCRG и TCRB при ПТКЛ затрудняют оценку минимальной остаточной болезни.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА периферическая Т-клеточная лимфома, ПЦР, реаранжировки генов Т-клеточных рецепторов, клональность Т-лимфоцитов.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ПТКЛн - периферическая Т-клеточная лимфома, неуточненная; TCR - Т-клеточный рецептор; TCRG - Т-клеточный рецептор у; TCRB - Т-клеточный рецептор в; TCRD - Т-клеточный рецептор 6; CD - кластер дифференцировки.
ВВЕДЕНИЕ
Периферическая Т-клеточная лимфома, неуточненная (ПТКЛн) - гетерогенная группа лимфом с имму-нофенотипом зрелых периферических (посттими-ческих) Т-лимфоцитов. Данный диагноз охватывает более 29% Т-клеточных лимфом, которые не попадают под другие нозологические формы и является диагнозом исключения [1, 2]. Клинически заболевание протекает агрессивно (пятилетняя общая выживаемость не превышает 32%), часто носит распространенный (у 69% пациентов диагностируется стадия Ш/^) и внеузловой характер, поражает костный мозг, кожу, подкожную клетчатку, легкие [3]. Считается, что морфологическим субстратом опу-
холи являются Т-лимфоциты, имеющие иммунофе-нотип зрелых Т-клеток с ав-вариантом Т-клеточного рецептора на поверхности (TCRаP) и маркерами CD2 + , CD3+, CD5 + , CD7 + , CD4+ или CD8 + , экспрессия которых несет признаки аберрантности (утрата одного или нескольких из них). ПТКЛн чаще имеет иммунофенотип CD4 + /CD8-, реже CD4-/CD8+. В некоторых случаях у периферических Т-клеточных лимфом наблюдается очень скудная экспрессия Т-клеточных маркеров на поверхности, например только CD2 или СD3. Кроме того, небольшое число ПТКЛн - это лимфомы из уб-Т-лимфоцитов, которые невозможно отнести по клини-ко-морфологическим данным к гепато-лиентальной
уб-лимфоме или уб-варианту лейкоза из больших гранулированных лимфоцитов [3-6]. Исследование клональных реаранжировок генов Т-клеточных рецепторов при ПТКЛн позволяет в сложных диагностических случаях подтвердить Т-клеточную клональность и доказать наличие опухоли [7-11]. Суть метода состоит в ПЦР-амплификации и анализе области соединения V-D-J-сегментов генов Т-клеточных рецепторов б (TCRD), у (TCRG) и в (TCRB). В каждом нормальном Т-лимфоците данная область имеет уникальную нуклеотидную последовательность. При фрагментном анализе амплифи-катов, полученных из здоровой ткани, наблюдается множество пиков с Гауссовским распределением длин (рис. 1А). Моноклональные образцы, имеющие одинаковую длину ПЦР-продуктов, определяются
в виде одного пика (моноаллельная реаранжировка, рис. 1Б) или двух пиков (биаллельная реаранжиров-ка, рис. 1В).
Длина моноклонального ПЦР-продукта уникальна для опухолевого клона и неизменна во всех пораженных тканях у данного пациента. Обнаружение клона, например, в пунктате костного мозга, будет указывать на поражение костного мозга. Кроме того, по характеру реаранжировок можно судить о степени зрелости лимфоидной опухоли. При созревании Т-лимфоцита в норме реаранжировки проходят последовательно: сначала перестраивается локус генов TCRD ^б^б, Dб-Dб, Dб-Jб, Vб-Jб), затем TCRG ^у^у) и неполностью TCRB ^Р^Р). Несколько позже происходят полные реаранжировки TCRB ^Р^Р) и а-локуса TCR ^а^а) (рис. 2) [12, 13].
А
Б
В
Рис. 1. Пример определения клональности по генам TCRG. А - поликлональный результат. Б - моноклональный результат (моноаллельная реаранжировка). В - моноклональный результат (биаллельная реаранжировка)
Уб-^б ^ Vy-Jy
Уб^б^б^б)
DР-JР
о
УР^Р
Vа-Jа
>
• 1 -<•)
мультипотентная Т^К. пре-Т1 пре-Т2 1а+5+
34+1а-5-2- 34+1а-5+2+ 34+1а+5+2+ 2+4-8- 1а+5+2+4-
ч /су^3+ 8lowCD3+/-
N1^ • ) TCRyб (5%)
рТа
#
ДП CD4+8+ TCRаР+/-CD3+/-
Ч 9» CD2+3+8-4-
•
CD8+4-
TCRаР++
CD3++
CD4+8-
TCRаР++
CD3++
Рис. 2. Ранние стадии развития Т-лимфоцитов. Последовательные реаранжировки б-, у-, Р- и а-цепей генов TCR. ДП - двойные позитивные клетки
Таблица 1. Данные лабораторно-диагностических исследований
№ Основные иммунофенотипические характеристики опухоли Объем поражения Стадия КМ ПЦР Общее кол-во клональных реаранжировок*** Кол-во клонов** Кол-во иссл. тканей
TCRG, TCRD* TCRB Dß-Jß TCRB Vß-Jß
1 ЛУ CD3m+CD4+CD8-CD30-GranzB-CD5-CD57-CXCL13-CD7 + ЛУ I нм 3 VY-JY 3Dß-Jß 0 2 1
2 Сел CD3m+CD4+CD8+CD5+TIA-1+GranzB+CD7+CD56+ КМ Печ Сел Киш IV + 2 VY-JY 3Dß-Jß 1Vß-Jß 3 5
3 Сел CD3m+CD4-CD8+CD2+CD7+CD30-CD10-CD5+ КМ Сел IV + 1 Vy-JY 3TCRD 2 Dß-Jß 5 Vß-Jß 4 2
4 КМ CD3m+CD4+CD8+CD10-CD1a-CD5+CD7+ КМ Сел IV + 6 VY-JY 4Dß-Jß 5 Vß-Jß 4 2
5 КМ CD3e-CD4-CD8+(4acTb)CD7- CD2-CD1a-CD5-CD56-CD30-Сел CD3e+CD4-CD8-CD7-CD2-CD1a-CD5-CD30-ALK-GranzB- КМ Сел IV + 3 VY-JY 3Dß-Jß 3Vß-Jß 3 3
6 ЛУ CD3m+CD4+CD8-CD45RO+CD2+CD7-CD30-ALK- КМ ЛУ IV + 3 VY-JY нд нд 2 1
7 ЛУ CD3m+CD4-CD8+CDR0+CD30-CD15-CD23-CD56- КМ ЛУ Сел Жел IV + 3 VY-JY 1 Dß-Jß 2Vß-Jß 2 5
8 ЛУ CD3m+CD4+CD8-CD 5+CD10-CD23- КМ ЛУ Кожа Минд III + 5Vy-JY 1 Dß-Jß 3Vß-Jß 4 9
9 ЛУ CD3m+CD4-CD8+CD2+CD5+CD30+ КМ ЛУ Кожа Горт Минд IV + 8Vy-Jy 3Dß-Jß 3Vß-Jß 7 6
10 ЛУ CD3m+CD4-CD8+CD5+TIA-1 + КМ ЛУ Киш МЖ Легк IV + 2Vy-Jy 3Dß-Jß 3Vß-Jß 3 6
11 ЛУ CD3m+CD4+CD8-CD2+CD5+CD7+CD15-CD1a- КМ ЛУ Легк Жел Кожа Печ Сел НЛ III + 4Vy-Jy 2 Dß-Jß 2 Vß-Jß 5 7
12 ЛУ CD3m+CD4+CD8-CD30+GranzB-EMA+ КМ ЛУ МЖ Легк Минд НЛ IV + 3 Vy-Jy 2 Dß-Jß 1 Vß-Jß 2 2
13 Сел CD3m+CD4-CD8-TIA-I+ КМ Сел Печ IV + 8Vy-Jy 2 Dß-Jß 4Vß-Jß 4 4
14 ЛУ CD3m+CD4+CD8+CD7+CD2+CD30-NK- КМ ЛУ Кожа IV + 2 Vy-Jy 3Dß-Jß 1 Vß-Jß 2 2
15 Сред CD3m+CD4+CD8-CD30-ALK- Средостение IE нм 2 Vy-Jy 1Dß-Jß 1 Vß-Jß 1 1
16 Легк CD3m+CD4+CD8-CD45R0+CD5+CD7+CD30-CD10-CD23- ЛУ Легк IE + 3Vy-Jy 1Dß-Jß 2Vß-Jß 2 3
17 ЛУ CD3m+CD4+CD8-CD30+CD33+CD56- Сред ЛУ III + 3Vy-Jy 2Dß-Jß 1Vß-Jß 2 2
18 ЛУ CD3m+CD4-CD8+CD5+CD7 + ЛУ III + 2Vy-Jy 0 2Vß-Jß 1 2
19 ЛУ CD3m+CD4+CD8-CD5+CD4+CD10-ALK- ЛУ Сел III +? 2Vy-Jy 0 1Vß-Jß 1 2
20 Сел CD3c+CD4-CD8-CD1a-CD2+CD5-CD7-CD4-CD8-CD16+CD56+ КМ Сел IV + 2Vy-Jy 1Dß-Jß 2Vß-Jß 2 2
21 ЛУ CD3m+CD4-CD8-CD30-CD15-CD5+CD7+NK-CD2+GranzB- КМ ЛУ IV + 2Vy-Jy 1Dß-Jß 2Vß-Jß 2 2
22 ЛУ CD3m+CD4-CD8+CD30-CD10-CD15-CD23- КМ ЛУ IV + 1Vy-Jy 0 2Vß-Jß 1 1
23 Орбита CD3m+CD4+CD8+CD5+CD7+TIA-1+CD10-CD30-CD56-LPM-1-CD23-ALK- Мягкие ткани орбиты IE нм 1Vy-Jy 1Dß-Jß 1Vß-Jß 1 1
Примечание. ЛУ - лимфоузел, Сел - селезенка, КМ - костный мозг, Киш - кишечник, Жел - желудок, Горт -гортань, Печ - печень, Минд - миндалина, Легк - легкое, МЖ - молочные железы, НЛ - нейролейкемия, Сред - средостение. TCRD* - исследование генов TCRD проведено у двух пациентов с подозрением на уб-Т-клеточную лимфому. Кол-во клонов** - минимальное количество опухолевых клонов у пациента, которое оценивалось по количеству клональных реаранжировок в одном локусе и по появлению (смене) клональных продуктов в различных тканях. Случаи, где зафиксировано появление (смена) клональных продуктов, подчеркнуты. Объяснение см. в разделе Результаты и обсуждение. Общее кол-во клональных реаранжировок *** - совокупное количество клональных реаранжировок (пиков), обнаруженное во всех исследованных тканях. нм - нет материала, нд - нет данных, сомн - сомнительная картина.
24 Сел CD3m+CD4+CD8-CD2+CD5+CD7+CD56+TIA-1 + КМ Cел IV + 2Vy-Jy 1Dß-Jß 2Vß-Jß 1 2
25 ЛУ CD3m+CD4+CD8-CD2+CD7+GranzB+CD30-CXCL13-PD1-LMP1- Cел ЛУ III - 0 0 0 0 2
26 ЛУ CD3m+CD4+CD8-CD2+CD5+CD7+CD30-ALK-GranzB-EMA-CD56-CD57- КМ ЛУ IV - 0 2 Dß-Jß (сомн) 1Vß-Jß (сомн) 1 2
27 ЛУ CD3e-CD4-CD8-CD10-CD5-CD23-CD30-ALK^CA+CD2+CD7 + GranzB- КМ ЛУ Кожа IV + 0 1Dß-Jß (КМ) 0 1 3
28 КМ CD2+CD3+CD5-CD7+-CD4-CD8-CD16+56+cytCD3TCRyö+ Cел CD3e+ (m+cyt) CD4-CD8-CD5-CD7-TIA-I+CD56+ КМ Cел IV + 2Vy-Jy 3TCRD 2Dß-Jß 0 1 2
29 Кровь CD3+TCRaß+CD4+CD8+CD5+CD7+ КМ Cел IV + 1Vy-Jy 0 2Vß-Jß 1 1
30 КМ 30% клеток CD3+CD4-CD8-CD5-CD2+ КМ Cел IV + 3 vy-Jy 2Dß-Jß 1Vß-Jß 2 2
Так как гены TCRб (TCRD) располагаются внутри ло-куса TCRa, то они вырезаются при реаранжировках TCRa. Таким образом, спектр наблюдаемых при лим-фомах клональных реаранжировок можно разделить на ранние и более зрелые. Если в опухоли обнаруживают клональные продукты локусов TCRD, TCRG, неполные перестройки Dp-Jp, и не находят полных Vp-JP-реаранжировок генов TCRB, то это говорит о раннем характере реаранжировок, что соответствует опухоли из уб-Т-лимфоцитов. Чаще в опухоли представлен более зрелый спектр реаранжировок: одновременно присутствуют реаранжировки VY-JY, Dp-Jp и Vp-Jp, что характерно для большинства TCRaP-лимфом, в том числе и ПТКЛ. Согласно опубликованным данным, клональные реаранжировки генов TCRG и TCRB имеют 81-94% и 96% ПТКЛн соответственно [7, 8].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В Гематологическом научном центре Минздрава России (далее ГНЦ) проведен ретроспективный анализ результатов исследования клональности при ПТКЛн за последние 10 лет (2005-2015 гг.).
Пациенты и образцы
Выборка больных состояла из 30 человек (15 мужчин и 15 женщин, медиана возраста 56 лет (32-75)).
Стадию заболевания определяли согласно классификации Ann-Arbor (1971), поражение костного мозга считали IV стадией. У четырех пациентов диагностирована стадия I, у четырех - III, у 22 - IV. Поражение лимфатических узлов отмечено у 18 (60%) пациентов, костного мозга у 22 (73%), селезенки у 14 (47%), кожи у 5 (17%), желудочно-кишечного тракта у 4 (13%), легких у 4 (13%), миндалин у 3 (10%), печени у 3 (10%), средостения у 2 (7%), оболочек головного мозга (нейролейкемия) у 2 (7%), молочных желез у 2 (7%), мягких тканей орбиты у 1 (3%) (табл. 1). Гистологические и иммуногистохимические исследования выполнены в патолого-анатомическом отделении ГНЦ, молекулярно-генетические исследования клональности - в лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ.
Выделение ДНК из тканей
Лейкоциты и ДНК из крови и костного мозга выделяли как описано ранее [14]. Для выделения ДНК из ткани, залитой в парафиновый блок, брали пять срезов по 5 мкм в пробирки Eppendorf. Ткань де-парафинизировали методом нагревания [15, 16]. Свежезамороженную ткань для выделения ДНК размораживали и вырезали кусочек 1 х 1 х 1 мм. ДНК выделяли методом, основанным на растворении ткани в концентрированном аммиаке, с последующей
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 2. Наборы ПЦР-праймеров по протоколу BЮMED-2 для генов TCRD, TCRG, TCRB
Набор праймеров (название пробирок) Прямые праймеры Обратные праймеры Длина продуктов, п.н.
TCRD Tube A Dô2,Vôl,Vô2,Vô3,Vô4, Vô5,Vô6 JôlFAM Jô2R6G Jô3TAMRA Jô4ROX 130-280
TCRD Tube B Dô2,Vôl,Vô2,Vô3,Vô4, Vô5, Vô6 Dô3FAM 190-280
TCRG Vylf, Vy9, Vyl0, Vy11 JY1/2FAM Jpl/2FAM 100-250
TCRB Tube A Vß2-Vß24 (23 праймера) Jßl.l-Jßl.6HEX (6 праймеров) Jß2.2, Jß2.6, Jß2.7 FAM (3 праймера) 240-280
TCRB Tube B Vß2-Vß24 (23 праймера) Jß2.l, Jß2.3, Jß2.4, Jß2.5 FAM (4 праймера) 240-280
TCRB Tube C Dßl, Dß2 Jßl.l-Jßl.6HEX Jß2.l-Jß2.7FAM (13 праймеров) 170-210(Dß2) 290-310(Dßl)
нейтрализацией ледяной уксусной кислотой и высаливанием белков [17]. Концентрацию ДНК определяли на УФ-спектрофотометре. Образцы ДНК хранили при -20°С.
Исследование реаранжировок генов TCR при помощи ПЦР и фрагментного анализа
Т-клеточную клональность оценивали с использованием мультиплексных систем праймеров BIOMED-2 для фрагментного анализа [13] по перестройкам генов TCRG (Vy-Jy), TCRB (Vß-Jß, Dß-Jß). При yô-Т-клеточных лимфомах анализировали также перестройки генов TCRD. Мультиплексную амплификацию генов TCRD, согласно протоколу BIOMED-2, проводили в двух пробирках - Tube A и Tube B, а амплификацию генов TCRB в трех пробирках - Tube A, Tube B и Tube C (описание реакций см. в табл. 2). Для амплификации генов TCRD, TCRG использовали праймеры производства «Синтол», Россия. Реакционная смесь в конечном объеме 20 мкл включала: 100 нг ДНК, 10 мкл 2 х смеси для ПЦР (PCR Master Mix Promega), 5 пмоль каждого прай-мера. Гены TCRB амплифицировали с использованием коммерческого набора TCRB Gene Clonality Assay ABI Fluorescence Detection (Invivoscribe Technologies) и ДНК-полимеразу AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) в соответствии с инструкцией производителя. Условия ПЦР: предварительная денатурация 95°С (5 мин); 35 циклов - 92°С (35 с), 60°С (35 с), 72°С (35 с); окончательная элонгация - 72°С (10 мин). ПЦР проводили на автоматическом термоци-клере DNA Engine (BioRad, Hercules, США).
Для фрагментного анализа ПЦР-продуктов использовали автоматический анализатор нуклеи-
новых кислот ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Для этого 2 мкл разведенного в 20 раз ПЦР-продукта смешивали с 10 мкл формамида (Applied Biosystems) и 0.04 мкл GeneScan 500-LIS Size Standard (Applied Biosystems). После денатурации при 95°C в течение 3 мин и последующего охлаждения 10 мкл смеси вносили в лунку 96-луноч-ной плашки и проводили капиллярный электрофорез высокого разрешения на полимере POP-4 (Applied Biosystems). Флуоресценцию амплификатов и их профиль (распределение по длинам) анализировали при помощи компьютерной программы GeneMapper v. 4.0 (Applied Biosystems).
Статистический анализ
Для сравнения результатов, полученных двумя методами, вычисляли критерий ранговой корреляции Спирмена по формуле: r = 1 - 6^d2/(N3 - N), где N - число членов совокупности, d - разность рангов для каждого члена выборки, r - коэффициент Спирмена.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клональность генов TCR выявлена у 29 из 30 пациентов (97%): по генам TCRG - у 27 из 30 (90%), по генам TCRB - у 29 из 30 (97%). В некоторых образцах ПТКЛ реаранжировка обнаружена только в одном из локусов - TCRG или TCRB, что обусловлено аномальной дифференцировкой опухолевых клеток и часто сочетается с незрелым и аберрантным им-мунофенотипом. Например, у опухолевых клеток пациента № 27, в костном мозге которого найдена лишь одна клональная реаранжировка Dß-Jß, на поверхности не найдены CD3, CD5, CD4 или CD8, а об-
V|322-D|31-J|31 D|32-J|32
чи-т-ошганнкг]-ШН-
Рис. 3. Пример появления дополнительной реаранжировки DP2-JP. Представлена схема локуса TCRB с двумя реаранжировками VP22-DP1-JP1 и DP2-JP2
наружены только CD2 и CD7. Наиболее вероятная причина отсутствия клональных пиков при исследовании генов TCR (пациент № 25) - малое количество опухолевых клеток в образце (много реактивных Т-лимфоцитов). Методом ПЦР поражение костного мозга или лейкемизация (присутствие клональных лимфоцитов в крови) обнаружено у 93% (у 25 из 27) пациентов (табл. 1). При этом клональные реаран-жировки в костном мозге не обнаружены только у пациентов № 25 и № 26, у которых клональные пики также отсутствовали или были сомнительными в лимфоузлах. У четырех пациентов (№ 16-19) морфологическими методами поражение костного мозга не выявлено, тогда как методом ПЦР клональ-ные клетки выявлены в костном мозге. Обнаружение клональных реаранжировок генов TCRG в костном мозге или крови считается плохим прогностическим фактором при ПТКЛ [18]. У большинства пациентов мы наблюдали множественные (более двух) кло-нальные реаранжировки в одном локусе. Клон опухолевых лимфоцитов может иметь реаранжировку на одной хромосоме (моноаллельная реаранжировка) или на двух гомологичных хромосомах (биаллельная реаранжировка). Таким образом, для каждого гена (TCRD или TCRG, или TCRB) в одном опухолевом клоне мы можем обнаружить только один или два клональных пика.
В качестве исключения описано появление дополнительной реаранжировки DP2-JP (рис. 3) [19, 20]. В этом случае при фрагментном анализе мы наблюдаем появление дополнительного клонального пика в диапазоне 170-210 п.н. в пробирке С (Tube С, см. табл. 2) при амплификации генов TCRB.
У 13 из 30 (43%) пациентов, хотя бы в одной ткани обнаружены три и более клональных пика в одном
локусе генов TCR (у 10 пациентов в локусе TCRG, у 11 - в локусе генов TCRB). При этом множественные (три и более) клональные пики с одинаковой частотой обнаруживались в костном мозге, лимфоузлах и/или селезенке (у 10 из 13 пациентов). Теоретически «лишние» пики можно было бы отнести на счет реактивных Т-клеток, однако мы столкнулись с совершенно иной ситуацией. У 63% пациентов (15 из 24), у которых анализировали несколько тканей, мы наблюдали появление новых клональных пиков и соответственно новых клонов в различных тканях. Зафиксированные ранее клональные реаранжиров-ки либо не определялись, либо частично сохранялись. При этом картина по генам TCRG и TCRB совпадала, т.е. обнаружение нового клонального пика по генам TCRG обычно сопровождалось выявлением новой клональной реаранжировки генов TCRB. Такую картину можно объяснить только присутствием нескольких опухолевых клонов и различным их представительством в тканях и органах. В общей сложности у 19 из 30 пациентов (63%) мы обнаружили несколько клонов. Число клонов варьировало от двух до семи (табл. 1). Корреляции с возрастом (р = 0.43) и стадией заболевания (р = 0.29) не обнаружено. Выявление нескольких клонов коррелировало с количеством проанализированных тканей (т = 0.6, р < 0.0005). Возможно, данный феномен не был обнаружен у других пациентов лишь из-за малого количества изученных тканей. Ниже приведены наиболее репрезентативные примеры исследования клональ-ности при ПТКЛ.
Пациент 11 (рис. 4). При постановке диагноза у пациента 11 выявлена типичная для зрелой Т-клеточной лимфомы картина: биаллельная реа-ранжировка генов TCRG (212 и 224 п.н.) и полная ре-
л
4400 3300 2200 400 0
700 210 140 70 0
TCRG
ISO 210
Жел 224
212 1
ЛУ 224 ч 212 \
Alk >
л
780 570
зао
190 О
300 270 180 90
Кожа
201
1600 КМ 224
1200 212
£00 | /
400 0 * ■ ■ - 1 к ! .
224
212 IX
1И 210
СМЖ 174
201
Б TCRBTube A
240 280
TCRB Tube B
TCRB Tube C
280
39 D 260 130 0
160 ■ 120 BO 0
. Жел i poly
il
240
280
КМ
poly
J^iJiJi.
5700 3600 1900 о
600 400 200
262 390
/ 260
130
i
240
280
160
200
262 600 193
/ 400- 187 ^^
200
Г» J
240
280
160
200
210 Кожа 254
140 /
70 ■
rv .....-J
2400 1000 eoo
1ВП
262
/ 120
60
/
193 \
ч ., 1 J,II L
В Клональные реаранжировки генов TCRG и TCRB
Гены Жел ЛУ КМ Кожа СМЖ Сел Печ
TCRG 212 224 212 224 212 224 201 212 224 174 201 212 224 212 224
TCRB A p°iy p°iy p°iy 254 НА p°iy p°iy
B 262 262 262 262 НА 262 262
C p°iy p°iy 187 193 193 НА p°iy p°iy
Рис. 4. Результаты исследования клональных реаранжировок пациента 11. А - исследование генов TCRG. Б -исследование генов TCRB. В - общая таблица. Жел - желудок, КМ - костный мозг, ЛУ - лимфатический узел, СМЖ - спинномозговая жидкость, poly - поликлональный результат, НА - нет амплификации. Новые клональ-ные продукты подчеркнуты
аранжировка генов TCRB (Tube B 262 п.н.). При исследовании костного мозга выявлено еще два клона с неполными реаранжировками генов TCRB (Tube C 187 и 193 п.н.). Прогрессия заболевания приводит к поражению кожи, при котором обнаружены один или два новых клона с реаранжировкой генов TCRG (201 п.н.) и полной реаранжировкой генов TCRB (Tube A 254 п.н.). Дальнейшая прогрессия приводит к развитию нейролейкемии. В спинномозговой жидкости (СМЖ) отсутствуют клоны, обнаруженные в опухоли ранее (TCRG 212 и 224 п.н.), но найден клон с реаранжировкой генов TCRG длиной 201 п.н. и новый
клон с реаранжировкой генов TCRG длиной 174 п.н. Через 11 месяцев в связи с нарастающей цитопенией пациенту проведена спленэктомия и биопсия печени. В селезенке и печени картина клональных реа-ранжировок совпадает с первоначальной картиной в лимфоузле и желудке. Таким образом, у пациента 11 в общей сложности выявлены четыре реаранжировки генов TCRG: две полные реаранжировки генов TCRB и две неполные реаранжировки генов TCRB. Динамика появления новых реаранжировок в ходе прогрессии заболевания свидетельствует о пяти или более различных опухолевых клонах.
Л TCRG
160 200 2Ь0
Б TCRB ТиЬеА TCRB ТиЬе В
TCRB ТиЬе С
267 262 т 24 ж 305
269 ^
ЛУ1 —
*» »09 то
МИ» 140«
• 0» ,000
ж НО по гоо 2« гво т
*та 263 267 Г0ОО 1.1.1 и 0 26 2 «00 18< 305
— ™ 269 5000 301
2<№ эооо 191
ЛУ2 2000 »00 1
™ .1 1 10» 1.
6 ма ао ** н» т
263
267 ™ 186 301
262
™ КМ
— А к._
В Клональные реаранжировки генов TCRG и TCRB
Гены Кровь Минд ЛУ1 ЛУ2 КМ Кожа
TCRG 167 148 148 167 167 162
178 167 167 178 178 167
188 178 178 188 188 178
205 228 205 205
228 228 228
TCRB А - 267 267 263 263 НА
267 267
В - 262 262 262 262 262
269 269 269
С - 305 305 186 186 НА
191 301
301
305
Рис. 5. Результаты исследования клональных реаранжировок пациента 9. А — исследование генов TCRG. Б - исследование генов TCRB. В — общая таблица. Минд - миндалина, КМ - костный мозг, ЛУ - лимфатический узел, НА - нет амплификации
Пациент 9 (рис. 5). У пациента 9 выявлены множественные клональные реаранжировки генов TCRG и TCRB с различным представительством клонов в тканях и органах. При первичной диагностике исследовали кровь, костный мозг, биоптат миндалины и лимфоузла № 1. В крови и костном мозге выявлено пять и более реаранжировок генов TCRG и TCRB. В миндалине и лимфоузле № 1 найдены три и четыре клональных реаранжировки TCRG соответственно, и четыре реаранжировки генов TCRB. При прогрессии заболевания выполнена
биопсия лимфоузла № 2 и кожи. В биоптате лимфоузла найдено пять реаранжировок генов TCRG и восемь - TCRB. За исключением реаранжировки генов TCRB (А) 267 п.н. и генов TCRB (В) 262 п.н., которые в большинстве тканей присутствуют одновременно, остальные реаранжировки генов TCRB распределены произвольно и относятся к различным опухолевым клонам. Данные молекулярного исследования клональности свидетельствуют о наличии у данного пациента семи или более опухолевых клонов.
А
TCRG
160
2000 177
1600 ЛУ2 183
1200 248
800 225 225
400
TCRB Tube A
245
TCRB Tube B
245
TCRB Tube C
1BW 12M
260
КМ
275
D 265
0 1.1. А
:i I ЛУ1
189
900
600 1
300 III
189
900 Минд
600 260
300
Mi 314
0 Кожа
0 0 260
В Клональные реаранжировки генов TCRG и TCRB
A
Гены КМ ЛУ1 ЛУ2 Минд ЛУ3 Кожа
TCRG 204 225 183 248 177 183 225 248 177 177 183 248
TCRB A 260 275 poly 260 275 260 260 260
B 265 poly poly poly poly 265
C poly 189 189 189 189 189
Рис. 6. Результаты исследования клональных реаранжировок пациента 8. А - исследование генов TCRG. Б - исследование генов TCRB. В - общая таблица. Минд - миндалина, КМ - костный мозг, ЛУ - лимфатический узел, poly - поликлональный результат
Б
Пациент 8 (рис. 6). У пациента 8 выявлено пять различных реаранжировок TCRG (177, 183, 204, 225, 248 п.н.), при этом в исследованных тканях представлены разные клоны. Найдено четыре реаранжировки генов TCRB: три полные реаранжировки (Tube A и B) и одна неполная DP2-JP2 (Tube C). В данном случае
нет четкой связи между картиной реаранжировок генов TCRG и TCRB. Например, в лимфоузеле № 1 и коже доминируют реаранжировки генов TCRG 183 и 248 п.н., однако в случае генов TCRB картина различается. Количество клонов у данного пациента -четыре или более, однако не исключено, что клонов
может быть гораздо больше. Например, клоны только с реаранжировкой TCRG или TCRB, или клоны с ре-аранжировкой генов TCRG 177 п.н. и TCRB 260 п.н., TCRG 177 п.н. и TCRB 189 п.н. и т.д.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Присутствие нескольких опухолевых клонов, описанное при острых лимфобластных лейкозах (ОЛЛ), объясняется «текущим» незавершенным процессом реаранжировок генов иммуноглобулинов и TCR в ранних клетках-предшественниках [21-24]. Секвенирование клональных продуктов при манифестации ОЛЛ и в рецидиве показало, что при ОЛЛ одновременно присутствуют клоны с незавершенной реаранжировкой генов TCRD или TCRB и производные от них клоны с завершенными реаран-жировками. Кроме того, в ряде случаев происходит изменение завершенной реаранжировки. Ген V заменяется другим (вышележащим) либо реаран-жировка полностью заменяется на другую из вышележащих генов V и нижележащих J, т.е. генов, которые находятся дистальней предыдущей реа-ранжировки. Иногда в рецидиве наблюдается де-леция и исчезновение клональной реаранжировки генов TCR.
Мы предполагаем, что молекулярные события, происходящие при ОЛЛ, могут иметь место и при ПТКЛ. В опухолевой клетке нарушены механизмы контроля, которые при наличии продуктивной реаранжировки останавливают дальнейшие перестройки локуса: повышена активность ферментов RAG1 и RAG2, изменена организация хроматина и т.д. Вероятно, при ПТКЛ реаранжировки могут заменяться новыми и/или возможна замена незавершенных Dß-Jß на завершенные Vß-Jß. Кроме того, наблюдается общая хромосомная нестабильность, которая может приводить к делециям или дуплика-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L., Jaffe E.S., Pileri S.A., Stein H., Thiele J., Vardiman J.W. WHO Classification of Tumors of Hematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon: IARC, 2008. V. 2. 439 p.
2. Vose J., Armitage J., Weisenburger D., Savage K., Connors J., Gascoyne R., Chhanabhai M., Wilson W., Jaffe E., Armitage J., et al. // J. Clin. Oncol. 2008. V. 26. № 25. P. 4124-4130.
3. Weisenburger D.D., Savage K.J., Harris N.L., Gascoyne R.D., Jaffe E.S., MacLennan K.A., Rüdiger T., Pileri S., Nakamura S., Nathwani B., et al. // Blood. 2011. V. 117. № 12. P. 3402-3408.
4. de Leval L., Gaulard P. // Histopathology. 2011. V. 58. № 1. P. 49-68.
5. Виноградова Ю.Е., Луценко И.Н., Самойлова Р.С., Селиванова Е.И., Замулаева И.А., Грецов Е.М., Воробьев И.А., Капланская И.Б., Рыжикова Н.А., Аль-Ради Л.С. и др. // Гематология и трансфузиология. 2009. Т. 54. № 2. С. 14-18.
циям локуса генов TCR. Делеция локуса, вероятно, запускает механизм дальнейших реаранжировок на гомологичной хромосоме. Комплексные хромосомные изменения, в том числе триплоидия, тетра-плоидия, потери хромосом, трисомия 7q, транслокации с участием локусов генов TCR (14q11, 7q34-35, 7p13-21), описаны при различных периферических Т-клеточных лимфомах [25-27]. В любом случае клональные реаранжировки - это лишь маркер, который показывает гетерогенность данной опухоли и клональную эволюцию при прогрессии заболевания. У большинства пациентов нами выявлена «многоклоновость», однако пока неясно, присущ ли данный феномен только ПТКЛ. Возможно, некоторые другие лимфомы также обладают значительной кло-нальной гетерогенностью, но для их «визуализации» требуются другие подходы и методы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изучение клональности по генам TCRG и TCRB позволяет эффективно доказывать присутствие опухоли у большинства (97%) пациентов с ПТКЛ. Методом ПЦР показано поражение костного мозга и/или лейкемизация у большинства (93%) обследованных, тогда как морфологически поражение костного мозга подтверждено только у 73% пациентов. Специфическая картина реаранжировок при ПТКЛ (множественные реаранжировки генов TCRG и TCRB, утрата и появление новых, присутствие нескольких опухолевых клонов) наблюдалась у большей части пациентов (63%) и безусловно должна учитываться при использовании данного метода в диагностических целях. Появление новых клональ-ных пиков (клонов) не должно расцениваться как появление новой опухоли. Кроме того, множественные реаранжировки крайне затрудняют оценку минимальной остаточной болезни при ПТКЛ. •
6. Vinogradova Y.E., Kaplanskaya I.B., Samoilova R.S., Vorobiev I.A., Zingerman B.V., Sidorova Y.V., Shklovskiy-Kordi N.E., Aitova L.G., Maryin D.C., Vorobiev A.I., et al. // Clin. Med. Insights: Blood Disorders. 2012. № 5. P. 1-13.
7. Brüggemann M., White H., Gaulard P., Garcia-Sanz R., Gameiro P., Oeschger S., Jasani B., Ott M., Delsol G., Orfao A., et al. // Leukemia. 2007. V. 21. № 2. P. 215-221.
8. Tan B.T., Warnke R.A., Arber D.A. // J. Mol. Diagn. 2006. V. 8. № 4. P. 466-475.
9. Сидорова Ю.В., Никитин Е.А., Пекло М., Власик Т.Н., Самойлова Р.С., Кравченко С.К., Меликян А.Л., Виноградова Ю.Е., Пивник А.В., Судариков А.Б. // Терапевт. архив. 2003. T. 75. № 7. C. 48-52
10. Никитин Е.А., Сидорова Ю.В., Рыжикова Н.В., Бидерман Б.В., Меликян А.Л., Виноградова Ю.Э., Аль-Ради Л.С., Судариков А.Б. // Терапевт. архив. 2006. Т. 78. № 7. С. 52-57.
11. Сидорова Ю.В., Никитин Е.А., Бидерман Б.В., Грознова
А.А., Сорокина Т.В., Судариков А.Б. // Справочник заведующего КДЛ. 2009. № 6. P. 13-21.
12. Rothenberg E.V., Moore J.E., Yui M.A. // Nat. Rev. Immunol. 2008. V. 8. № 1. P. 9-21.
13. Dongen J.J., Langerak A.W., Bruggemann M., Evans P.A., Hummel M., Lavender F.L., Delabesse E., Davi F., Schuur-ing E., Garcia-Sanz R., et al. // Leukemia. 2003. V. 17. № 12. P. 2257-2317.
14. Сидорова Ю.В., Сорокина Т.В., Бидерман Б.В., Никулина Е.Е., Кисиличина Д.Г., Наумова Е.В., Почтарь М.Е., Лугов-ская С.А., Иванова В.Л., Ковалева Л.Г., и др. // Клин. лаб. диагностика. 2011. № 12. С. 22-35.
15. Wu L., Patten N., Yamashiro C.T., Chui B. // Appl. Immuno-histochem. Mol. Morphol. 2002. V. 10. № 3. P. 269-274.
16. Coombs N.J., Gough A.C., Primrose J.N. // Nucl. Acids Res. 1999. V. 27. № 16. e12.
17. Sidorova J.V., Biderman B.V., Nikulina E.E., Sudarikov A.B. // Exp. Dermatol. 2012. V. 21. № 1. P. 57-60.
18. Schützinger C., Esterbauer H., Hron G. // Leuk. Lymphoma. 2008. V. 49. № 2. P. 237-246.
19. Langerak A.W.,Wolvers-Tettero I.L.M.,Van Dongen J.J.M. // Leukemia. 1999. V. 13. № 6. P. 965-974.
20. Groenen P.J., Langerak A.W., van Dongen J.J., van Krieken J.H. // J. Hematop. 2008. V. 1. № 2. P. 97-109.
21. Szczepanski T., van der Velden V.H., Raff T., Jacobs D.C., van Wering E.R., Brüggemann M., Kneba M., van Dongen J.J. // Leukemia. 2003. V. 17. № 11. P. 2149-2156.
22. de Haas V., Verhagen O.J., von dem Borne A.E., Kroes W., van den Berg H., van der Schoot C.E. // Leukemia. 2001. V. 15. № 1. P. 134-140.
23. Szczepanski T., Willemse M.J., Brinkhof B., van Wering E.R., van der Burg M., van Dongen J.J. // Blood. 2002. V. 99. № 7.
P. 2315-2323.
24. Germano G., del Giudice L., Palatron S., Giarin E., Cazza-niga G., Biondi A., Basso G. // Leukemia. 2003. V. 17. № 8. P. 1573-1582.
25. Boehm T., Rabbitts T.H. // FASEB J. 1989. V. 3. № 12. P. 2344-2359.
26. Schlegelberger B., Himmler A., Godde E., Grote W., Feller A.C., Lennert K. // Blood. 1994. V. 83. № 2. P. 505-511.
27. Gesk S., Martin-Subero J.I., Harder L., Luhmann B., Schlegelberger B., Calasanz M.J., Grote W., Siebert R. // Leukemia. 2003. V. 17. № 4. P. 738-745.
