CC BY
122
УДК 616.155.392.2; 616-006.446
Эволюция опухолевых клонов
при остром лимфобластном лейкозе
взрослых
С. Ю. Смирнова1, Ю. В. Сидорова1, Н. В. Рыжикова1, К. А. Сычевская2, Е. Н. Паровичникова1, А. Б. Судариков1*
Тематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ, 125167, Москва, Новый Зыковский пр-д, 4
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет фундаментальной медицины, 119192, Москва, Ломоносовский просп., 31, корп. 5 *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 10.02.2016 Принята к печати 01.04.2016
РЕФЕРАТ Нестабильность клонального состава популяции опухолевых клеток при острых лимфобластных лейкозах (ОЛЛ) усложняет процесс контроля минимальной остаточной болезни (МОБ) и эффективности терапии по установленным в дебюте заболевания мишеням, специфичным для данного пациента. Основные работы, в которых изучали эволюцию опухолевых клеток со сменой клональных реаранжировок генов TCR и IG в рецидиве заболевания, выполнены на детских ОЛЛ. Данные для взрослых больных ОЛЛ ограничены, тогда как ОЛЛ у взрослых и детей имеют различия в особенностях биологии и прогноза заболевания. Цель нашей работы состояла в изучении клональных реаранжировок генов IG и TCR и их стабильности у взрослых больных с ОЛЛ. Реаранжировки выявляли методом ПЦР по протоколу BIOMED-2 с последующим анализом фрагментов. У 83% пациентов выявили несоответствие клональных реаранжировок в дебюте и рецидиве заболевания. Клональная эволюция может быть одним из механизмов опухолевой прогрессии. Не исключена изначальная неоднородность состава опухолевых клеток, и в то время как одни клоны исчезают под воздействием терапии, другие, не распознанные из-за недостаточной чувствительности метода, приобретают способность к пролиферации. Кроме того, в течение заболевания реаранжировки могут меняться благодаря сохраняющейся активности рекомбиназного комплекса, что приводит к появлению опухолевых клонов de novo. Изучение механизмов клональной эволюции, способности терапии влиять на процессы клональной эволюции позволит выделить новые прогностические факторы, разработать тактику диагностики МОБ, расширит современные представления о механизмах онкогенеза. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА острый лимфобластный лейкоз, рецидив, ПЦР, реаранжировки генов IG, реаранжировки генов TCR.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ МОБ - минимальная остаточная болезнь; ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз; ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени; TCR - Т-клеточный рецептор; TCRG, TCRB, TCRD - Т-клеточные рецепторы у, в и 6 соответственно; IG - иммуноглобулин; IGH - тяжелая цепь иммуноглобулина; IGK - легкая цепь иммуноглобулина.
ВВЕДЕНИЕ
Острые лейкозы представляют собой гетерогенную группу опухолевых заболеваний кроветворной ткани, характеризующихся поражением костного мозга морфологически незрелыми (бластными) кроветворными клетками. В зависимости от принадлежности опухолевых клеток к той или иной линии гемопоэ-за, острые лейкозы принято разделять на острые лимфобластные и острые миелобластные лейкозы. Без терапии течение заболевания быстропрогресси-рующее и всегда заканчивается смертью больного.
Наиболее часто причиной смерти являются тяжелые инфекционные и геморрагические осложнения, обусловленные замещением нормальной кроветворной ткани бластными клетками.
Основная цель терапии любых форм лейкозов -эрадикация опухолевого клона, восстановление нормального кроветворения и достижение длительной безрецидивной выживаемости больных. Введение в клиническую практику цитостатических препаратов в конце 60-х годов позволило достичь полной ремиссии у 85-95% детей с ОЛЛ [1]. При этом важным
прогностическим фактором является возраст, бессобытийная выживаемость детей варьирует в разных возрастных группах от 83-97% (1-5 лет) до 49-66% (10-15 лет). На сегодняшний день Российской исследовательской группой по лечению острых лимфо-бластных лейкозов (RALL) показано, что в группах взрослых больных моложе 30 лет 5-летняя безрецидивная выживаемость составила 71.5%, в то время как у больных 30-55 лет этот показатель был ниже - 61.8% [2]. Показано, что взрослые и дети, больные ОЛЛ, отличаются не только выживаемостью, но также биологическими свойствами и прогнозом заболевания [3, 4]. В частности, к группе благоприятного прогноза у взрослых относят Т-клеточный вариант заболевания, в то время как у детей этот вариант считается прогностически неблагоприятным. Кроме того, у взрослых чаще выявляют прогностически неблагоприятные хромосомные аберрации (1(9;22), 1(4;11)), миелоидные антигены на мембране опухолевых клеток, в дебюте заболевания чаще определяют гиперлейкоцитоз, чаще диагностируют Т-клеточный иммунофенотип [3, 4].
Другой важный прогностический фактор при ОЛЛ - остаточное количество опухолевых клеток в костном мозге, или минимальная остаточная болезнь (МОБ). Оценка МОБ рассматривается не только как независимый фактор прогноза, но и как критерий разделения пациентов на группы риска развития рецидива [5-7]. Для оценки МОБ наиболее пригодны количественные методики с максимальным уровнем чувствительности (10-4-10-5), такие, как ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием праймеров, специфичных для данного пациента, и многоцветная проточная цитофлуориме-трия. Оценка МОБ у пациентов с ОЛЛ методом ПЦР основана на определении клональных реаранжиро-вок генов Т-клеточных рецепторов (TCR) и иммуноглобулинов (Ю) в опухолевых клетках и подборе пациент-специфичных праймеров к CDR3-области этих генов [8].
Клональные реаранжировки генов Ю и TCR находят у 98% пациентов с В-ОЛЛ и у 95% больных с Т-ОЛЛ [9]. Поскольку в опухолевых клетках, полученных от разных больных, обнаруживают различные хромосомные аберрации, только перестроенные гены Ю и TCR считаются универсальными маркерами, позволяющими отслеживать опухолевые клоны практически у всех больных в течение болезни/терапии. Само по себе выявление клональ-ности не является критерием для постановки диагноза ОЛЛ. Клональные реаранжировки иногда обнаруживают и при реактивных (неопухолевых) процессах воспалительного, инфекционного или аутоиммунного генеза. Как правило, в этих случаях
клональный продукт определяется на поликлональ-ном фоне. Дифференциальная диагностика опухолевой и неопухолевой лимфопролиферации представляет определенную сложность при некоторых лимфомах, грибовидном микозе, синдроме Сезари, однако, исследование клональности при ОЛЛ, когда в периферической крови большинство лимфоцитов (> 20%) представлены опухолевыми клетками, таких затруднений не вызывает.
ПЦР-РВ с пациент-специфичными праймерами, подобранными к уникальной по нуклеотидной последовательности V-D-J-области клонально перестроенных генов Ю или TCR, позволяет с высокой чувствительностью (10-4-10-5) оценить остаточное количество опухолевых клеток у пациентов с ОЛЛ [10]. Однако данные, полученные при изучении клональ-ных перестроек в дебюте и рецидиве ОЛЛ у детей, свидетельствуют о том, что реаранжировки генов Ю и TCR могут изменяться в течение заболевания, т.е. в рецидиве заболевания часть выявленных клональ-ных реаранжировок исчезает и/или появляются новые реаранжировки. Необходимо отметить, что речь идет именно о частичной смене клональных реаран-жировок, так как полная смена генных реаранжи-ровок Ю и TCR в рецидиве указывает на возникновение вторичного ОЛЛ [11, 12]. Частичные различия клональных реаранжировок в дебюте и рецидиве наблюдаются у 67-70% детей с В-ОЛЛ и 45-50% детей с Т-ОЛЛ [13-15]. Данные об эволюции опухолевых клонов у взрослых с ОЛЛ весьма ограничены [11]. У Szczepanski и соавт. приведены результаты оценки генов TCR у 9 взрослых с Т-ОЛЛ [11]. Показано, что в целом стабильность генов TCR при взрослом Т-ОЛЛ выше (97%), чем при детском Т-ОЛЛ (86%) [11]. При этом реаранжировки генов Ю в дебюте и рецидиве заболевания не изучали.
Смена клональных реаранжировок, т.е. клональ-ная эволюция опухоли, может приводить к потере мишени для исследования МОБ и ложноотрицатель-ным результатам. Таким образом, приемлемость той или иной реаранжировки для изучения МОБ при ОЛЛ определяется не только частотой ее выявления, но и стабильностью. Основные данные изучения стабильности и частоты различных реаранжи-ровок при В-ОЛЛ и Т-ОЛЛ суммированы в табл. 1 [5-11, 15-19].
Перестройки генов 6-цепи TCR (TCRD) - самая ранняя из генных перестроек в Т-лимфоцитах. Клональные перестройки генов TCRD встречаются примерно в 55% случаев Т-ОЛЛ [20], генов у-цепи TCR (TCRG) - у 95% пациентов [21], генов Р-цепи TCR (TCRB) - у 92% пациентов. Стабильность ре-аранжировок TCRB при рецидивах Т-ОЛЛ у детей была ниже стабильности у- и 6-цепей - 80 vs 86
Таблица 1. Стабильность и частота выявления клональных реаранжировок при В-ОЛЛ и Т-ОЛЛ [7]
Ген Реаранжировка В-ОЛЛ Т-ОЛЛ
Частота, % Стабильность, % Частота, % Стабильность, %
моно олиго моно олиго
ЮН VH-JH (полные) 93 30-40 88 47 5 НТ
БН^Н (неполные) 20 50-60 57 38 23 НТ
Все ЮН 98 40 85 44 23 НТ
ЮК Vx-K.de 45 5-10 95 40 0 НП
Интрон RSS-Kde 25 5-10 86 0 0 НП
Все Ме 50 5-10 95 40 0 НП
ТСЯБ VB-JB (полные) 21 10-15 89 60 77 79
БВ^В (неполные) 14 10-15 67 0 55 80
Все TСRB 33 10-15 81 43 92 80
ТСЯЮ VG-JG 55 15 75 95 86
TСRD VD-JD или ББ^Б1 < 1 НП НП НП 50 100
VD2-DD3 или ББ2-ББ3 40 20-25 86 26 55 100
Все TСRD 40 20-25 86 26 55 100
Примечание. НТ - не тестировали, НП - неприменимо.
и 100% соответственно (см. табл. 1) [11]. Несмотря на высокую частоту обнаружения и высокую стабильность, моноклональные перестройки генов у-цепи являются не самой удачной мишенью для контроля МОБ, поскольку имеют короткий фрагмент нуклеотидной вставки [22]. Согласно опубликованным данным, Т-ОЛЛ чаще, чем В-ОЛЛ, оказывается устойчивым к терапии и положительным по МОБ [23]. Выявлена высокая стабильность реаранжировок генов 1ЮК (95%) при В-ОЛЛ у детей, завершенных V-D-J-реаранжировок генов ЮН (88%), TCRB (89%) и TCRD (86%), относительно высокая стабильность реаранжировок генов TCRG (75%) и низкая стабильность неполных перестроек генов ЮН (57%) и неполных перестроек генов TCRB (67%) (табл. 1). Кроме того, в значительной части случаев детского В-ОЛЛ (26-30%) изначально определяется олигокло-нальный характер реаранжировок [13-15]. При ОЛЛ возможно присутствие клональных продуктов с незавершенной реаранжировкой генов и производных от них клональных продуктов с завершенными ре-аранжировками, что объясняется действием V(D) J-рекомбиназ и «текущим» продолжающимся процессом реаранжировок генов иммуноглобулинов и TCR в ранних клетках-предшественниках [11, 15,
24]. Чаще других олигоклональность (наличие двух и более клонов) выявляют в генах ЮН: полные реа-ранжировки - в 30-40% случаев, неполные - в 5060%, гены 6-цепи TCR - в 20-25% случаев (табл. 1). Олигоклональные реаранжировки не рекомендовано использовать в качестве мишени для оценки МОБ: они нестабильны и часто дают ложноотрицательные результаты.
Эволюцию опухолевых клеток (смену клональных реаранжировок генов TCR и ЮН) в рецидиве заболевания изучали в основном на детском ОЛЛ. Данные для взрослых больных ОЛЛ весьма ограничены. Учитывая то, что ОЛЛ у взрослых и детей имеют разные биологические свойства и прогноз заболевания, цель нашего исследования состояла в изучении характера клональных реаранжировок генов иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов и их стабильности у взрослых с В-ОЛЛ и Т-ОЛЛ, проходивших лечение в Гематологическом научном центре МЗ РФ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Пациенты и образцы
В исследование включено 63 больных ОЛЛ: 34 -с В-клеточным вариантом ОЛЛ, в том числе два
Таблица 2. Краткая характеристика пациентов с ОЛЛ
с Ph+ ОЛЛ; 28 - с Т-клеточным вариантом ОЛЛ и один с бифенотипическим вариантом ОЛЛ (табл. 2). Всем больным проводили стандартное цитогенети-ческое исследование, FISH-исследование клеток костного мозга с флуоресцентными зондами t(9;22) и t(4;11) (табл. 3). Нормальный кариотип имели 20 из 63 пациентов, у 17 из 63 не было митозов, у шести выявлены различные изменения хромосомы 9 и/или 22. Транслокация t(9;22) обнаружена методом FISH, а химерный транскрипт BCR/ABL (p190) идентифицирован молекулярно-генетическим методом (Ph+ B-ОЛЛ). У пяти больных методом FISH выявлена транслокация t(4;11), а с помощью ПЦР химерный транскрипт MLL-EPS15. У семи больных найдены множественные хромосомные аномалии: у четверых - трисомия 21. Исследовали ДНК, полученную из всех 63 образцов костного мозга в дебюте заболевания. Возраст пациентов 19-59 лет (медиана - 28). У шести из 63 пациентов изучали клональ-ные реаранжировки в дебюте и рецидиве заболевания. Время до рецидива составило от 5.4 до 11.6 месяцев. Больных наблюдали в отделении химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения Гематологического научного центра (далее ГНЦ). Диагнозы устанавливали в соответствии с классификацией ВОЗ. Согласие на обработку данных получено от всех пациентов, включенных в исследование. Кровь здоровых доноров получена на станции переливания крови ГНЦ.
Анализ клональности по реаранжировкам генов
IG/TCR
Лейкоциты и ДНК из периферической крови выделяли как описано ранее [25]. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически. Образцы ДНК хранили при -20°С. B- и T-клеточную клональность определяли с использованием мультиплексных систем праймеров BIOMED-2 для фрагментного анализа [26]. B-клеточную клональность оценивали по перестройкам генов тяжелых цепей IGH (VH-JH-
FR1/FR2/FR3/ DH-JH), легкой цепи к IGK (Vk-Jk/ Vk-KDE/IntronRSS-KDE). T-клеточную клональность оценивали по перестройкам генов T-клеточных рецепторов TCRG (VG-JG), TCRB (VB-JB/DB-JB), TCRD (VD-JD/DD2-JD/VD-DD3/DD2-DD3). Все локусы генов IG и TCR анализировали при помощи мультиплексных реакций с большим количеством праймеров, разделенных на несколько пробирок в соответствии с рекомендациями протокола BIOMED-2 (см. краткое описание в табл. 4). Для амплификации генов TCRB использовали коммерческий набор TCRB Gene Clonality Assay ABI Fluorescence Detection (Invivoscribe Technologies, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Смесь (25 мкл) для ПЦР генов IGH, IGK и TCRG, TCRD содержала 5 пмоль каждого праймера («Синтол», Россия), 100200 нг ДНК и 12.5 мкл 2 xpCRMasterMix (Promega, США). Амплификацию проводили на автоматическом термоциклере DNAEngine (BioRad, США). Условия ПЦР: 95°C (7 мин), затем 35 циклов - 95°С (45 с), 60°С (45 с), 72°С (45 с) и 72°С (10 мин). В качестве положительного (клонального) контроля использовали клеточные линии Jurkat и Daudi, в качестве поликлонального контроля - мононуклеары периферической крови здоровых доноров. Для фрагментно-го анализа ПЦР-продуктов использовали автоматический анализатор нуклеиновых кислот ABIPRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). С этой целью 2 мкл разведенного в 20 раз ПЦР-продукта смешивали с 10 мкл Hi-Di формамида (Applied Biosystems, США) и 0.04 мкл GeneScan 500-LIS Size Standard (Applied Biosystems, США). После денатурации при 95°C в течение 3 мин и последующего охлаждения 10 мкл смеси вносили в лунку 96-луночной плашки и проводили капиллярный электрофорез высокого разрешения на полимере POP-4 (Applied Biosystems, США). Флуоресценцию амплификатов и их профиль оценивали при помощи компьютерной программы GeneMapper v.4.0 (Applied Biosystems, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Клональные реаранжировки изучены у 34 пациентов с В-клеточным вариантом ОЛЛ, 28 пациентов с Т-клеточным вариантом, одного с бифенотипическим вариантом заболевания. Частоты клональных реаранжировок генов y-, ß- и б-цепей TCR и генов тяжелой и легкой цепей IG при B-и Т-вариантах ОЛЛ представлены в табл. 5. У пациента с бифенотипическим вариантом выявлена биаллельная реаранжировка (два пика) генов TCRG и олигоклональная (четыре пика) генов TCRD. У пациентов с В-клеточным вариантом ОЛЛ наиболее часто встречались реаранжировки генов тяжелой
Возраст 19-59(М 28)
Пол, м/ж 32/31
В-ОЛЛ/Т-ОЛЛ/бифенотипический вариант 34/28/1
Число рецидивов (В-ОЛЛ/Т-ОЛЛ) 6 (4/2)
Время до рецидива, мес. 5.4-11.6 (М 6.2)
Примечание. М - медиана возраста.
Таблица 3. Результаты стандартного цитогенетического исследования (СЦИ) и FISH-анализа транслокаций t(4;11) и t(9;22) у пациентов с ОЛЛ
Пациент Вариант ОЛЛ СЦИ, FISH, ПЦР
1 B-II Нет митозов
2 B-I Нормальный кариотип
3 B-I der(7)add(p22),-8?,der(9),i(q10),der(14),add(q32?),+mar der(9)?(17)cp/46, ХХ [3]
4 B-I Добавочный материал на коротком плече хромосомы 10, трисомия хромосом Х, 12 и 22, FISH t(4;11), выявлен MLL-EPS15 методом ПЦР
5 B-I 55XX, производное хромосом 3 и 11, делеция короткого плеча хромосомы 12 и длинного плеча хромосомы 13
6 B-I Нормальный кариотип
7 B-I Нормальный кариотип
8 B-I Нет митозов, FISH t(4;11), выявлен MLL-EPS15 методом ПЦР
9 B-II В 80% ядер выявлен дополнительный сигнал от локуса гена IGH (14q32) (трисомия хромосомы 14? другая транслокация с вовлечением локуса гена IGH)
10 B-II Нормальный кариотип
11 B-II Нет митозов
12 B-II 53XY? +X,+4,+ 6,+14,+21,+21,+mar [10]
13 B-II Нормальный кариотип
14 B-II Нет митозов
15 B-II Нет митозов
16 B-II В 15% по два дополнительных сигнала от локусов генов ABL(9q34) и BCR(22q11), тетрасомия хромосом 9 и 22?
17 B-II Трисомия 21
18 B-II Нормальный кариотип
19 B-II Трисомия 21
20 B-II Трисомия 21, моносомия 13
21 B-II Нормальный кариотип
22 B-II Нет митозов
23 B-II Нормальный кариотип
24 B-II Нормальный кариотип
25 B-II Нормальный кариотип
26 B-III Две клетки с del (11), FISH t(4;11), выявлен MLL-EPS15 методом ПЦР
27 B-III Нормальный кариотип
28 B-III 47ХХ +5 (5q31)
29 B-III 54X,?+X,Y,+4,+5,+ 6,?-7,+14,+21,+22,+ ?mar или r i(7)(q10) или i(8)(q10),+mar [19],46XY
30 B-III +8+11+21
31 B-Ph+ Нет митозов, FISH t(9;22), выявлен BCR-ABL методом ПЦР
32 B-Ph+ Нормальный кариотип, FISH t(9;22), выявлен BCR-ABL методом ПЦР
33 B-II Нет митозов
34 B-II Нет митозов
35 T-I 46XY[2]/90-92,XXYY,=mar [10]
36 T-I Нет митозов
37 T-I 11q23 перестроен, FISH t(4;11), выявлен MLL-EPS15 методом ПЦР
38 T-I Нормальный кариотип
39 T-I del9(p13)
40 T-I Нет митозов
41 T-I Нормальный кариотип
42 T-I 15.5% трисомия, в 45% тетрасомия в локусе гена PMLL\11q23, FISH t(4;11), выявлен MLL-EPS15 методом ПЦР
43 T-I Нормальный кариотип
44 T-II Нормальный кариотип
45 T-II Нормальный кариотип
46 T-II Нормальный кариотип
47 T-II Нет митозов
48 T-II Делеция длинного плеча хромосомы 5? или транслокация t(5;?), производные хромосом 2, 4, 5, 7, 22 и 17 (с вовлечением гена р53)
49 T-II Трисомия хромосомы 8
50 T-II (47, XY,+8 (20))
51 T-II Нормальный кариотип
52 T-II Нет митозов
53 T-III Нормальный кариотип
54 T-III 47, XY+mar [20]
55 T-III der (1)add(p36)?dup(p31p36)?{20}; моносомия 9 или делеция локуса 9q34
56 T-III Нет митозов
57 T-III Производное хромосомы 11, делеция длинного плеча хромосомы 6
58 T-III Нет митозов
59 T-III Нет митозов
60 T-III Нет митозов
61 T-IV t(6;17) +20
62 T-I del 11q23
Бифено-
63 типическии вариант заболевания 47, XY, der(2)add(p24-25),+5, del(7)(q22),del(13)(q11-q34),+14[6]/46, XY [4]
Примечание: жирным шрифтом выделены пациенты, у которых констатирован рецидив заболевания, выявляли реаранжировки генов Т-клеточных рецепторов и иммуноглобулинов в дебюте и рецидиве заболевания.
Таблица 5. Частота (%) выявления клональных реаранжировок генов у-, в- и б-цепей TCR и генов тяжелой и легкой цепей Ю при В- и Т-вариантах ОЛЛ
Таблица 4. Описание мультиплексных реакций и ПЦР-праймеров по протоколу BЮMED-2
Ген Набор праймеров Прямые праймеры Обратные праймеры (меченые) Длина продуктов, п.н.
ЮН А VH1-7 (ЕИ1) JHcons ЕАМ 310-360
В VH1-7 (ЕИ2) JHcons ЕАМ 250-295
С VH1-7 (ЕИ3) JHcons ЕАМ 100-170
Е БН1-6 JHcons ТАМИА 110-290 и 390-420
Б БН7 JHcons ТАМИА 100-130
ЮК А V* 1/6-7 Jк1-4, Jк5 FAM 120-300
В V* 1/6-7, Г№ГО КБЕ-ЕАМ 210-390
TCRD Б1 Dб2,Vб1-Vб6 Jб1FAM, Jб2R6G, Jб3TAMRA, Jб4ROX 120-280
Б2 Dб2,Vб1-Vб6 Dб3FAM 130-280
TCRG GA VYlf, VY10 JY1/2FAM, Jp1/2 R6G 145-255
GB VY9, VY11 JY1/2FAM, Jp1/2 R6G 80-220
TCRB А VP2-VP24 ТР1.1, JP1.6HEX, JP2.2, JP2.6, JP2.7FAM 240-285
В VP2-VP24 JP2.1, Jp2.3, JP2.4, JP2.5 FAM 240-285
С DP1, DP2 JP1.1, JP1.6HEX, Jp2.1, JP2.7FAM 170-210 285-325
Реаранжировки В-ОЛЛ (п = 34) Т-ОЛЛ (п = 28)
TCRG VG-JG 76.5 (п = 26) 89.3 (п = 25)
TCRB VB-JB (полные) 26.5 (п = 9) 50 (п = 14)
БВ^В (неполные) 23.5 (п = 8) 46.4 (п = 13)
Все ТСИВ 38.2 (п = 13) 60.7 (п = 17)
TCRD VБ-JБ/ББ2-JБ 17.6 (п = 6) 53.6 (п = 15)
VБ-ББ3/ББ2-ББ3 47.1 (п = 16) 32.1 (п = 9)
Все ТСИБ 55.9 (п = 19) 64.3 (п = 18)
ЮН VH-JHFR1/FR2/FR3 (полные) 73.5 (п = 25) 7.1 (п = 2)
БН^Н (неполные) 26.5 (п = 9) 25 (п = 7)
Все IGH 82.4 (п = 28) 28.6 (п =8)
ЮК Vk-Jk 26.5 (п = 9) 0 (п = 0)
Vk-KБE/IntronRSS-KБE 26.5 (п = 9) 3.6 (п = 1)
Все IGK 38.2 (п = 13) 3.6 (п = 1)
цепи Ю (82.4%) и у-цепи TCR (76.5%), реаранжиров-ки генов в-цепи TCR и генов к-цепи IG обнаружены в 38.2% случаев, генов б-цепи TCR - в 55.9%. У 89.3% пациентов с Т-клеточным вариантом ОЛЛ выявлены перестройки генов у-цепи TCR. Перестройки генов б-цепи выявлены в 64.3% случаев, генов в-цепи -в 60.7% случаев. Реже остальных при Т-ОЛЛ встречались перестройки ЮН - 28.6%. Перестройка генов легкой к-цепи иммуноглобулина Vk/KDE найдена в одном случае Т-ОЛЛ. Наши данные по частоте клональных генных реаранжировок Ю и TCR несколько отличаются от данных международных исследований, что мы связываем с небольшим размером вы-
борки. Олигоклональные реаранжировки (три и более клональных пика) наблюдались как при В-ОЛЛ (ЮН у 12% (4 из 34) пациентов, TCRD у 18% (6 из 34) пациентов), так и при Т-ОЛЛ (TCRD у 32% (9 из 28) пациентов).
У шести пациентов клональные реаранжировки исследовали в дебюте и рецидиве заболевания. Всего в дебюте заболевания выявлено 17 клональных реаранжировок генов TCR и 5 клональных реаранжировок генов Ю. В рецидиве заболевания выявлено шесть клональных реаранжировок генов TCR и три клональные реаранжировки генов Ю, которые отличались от выявленных в дебюте (табл. 6).
Таблица 6. Клональные продукты, выявленные в дебюте и рецидиве у шести пациентов с диагнозом ОЛЛ
Пациент/ № 1 T-ОЛЛ № 2 T-ОЛЛ № 3 B-ОЛЛ № 4 B-ОЛЛ № 5 B-ОЛЛ № 6 B-ОЛЛ
диагноз Д Р Д Р Д Р Д Р Д Р Д Р
TCRG-GA + + + + - - + - - + + +
TCRG-GB + + - - - - + - - + - +
TCRB-A + + - - - - + - - - - +
TCRB-B - - - - - - - - - - + +
TCRB-C - - - - - - - - - - - -
TCRD-D1 + + + + 1 + + + + + + - -
TCRD-D2 + + - - - + + - + - - -
IGH-A/ IGH-B/ IGH-C - - - - - + - - + + 1 + +
VK-A - - - - - + + - - - + -
VK-B - - - - - - + + - - - -
Примечание. «+» - моноклональная реаранжировка, «-» - поликлональная реаранжировка, «+1» - изначальная клональная реаранжировка выявляется с дополнительной, отличной от выявленной в дебюте заболевания, Д -дебют заболевания, Р - рецидив заболевания.
У двух пациентов с В-клеточным вариантом заболевания отмечена потеря одной из клональных реаранжировок, выявленных в дебюте, при одновременном появлении новых реаранжировок (пациенты № 5 на рис. 1 и № 6 в табл. 6). У одной пациентки с диагнозом раннего Т-ОЛЛ клональные реаранжировки генов y-, ß- и ô-цепей TCR, выявленные в дебюте заболевания, полностью совпадали с клональными ре-аранжировками в рецидиве (№ 1). У одного пациента с диагнозом Т-ОЛЛ, при полном сохранении клональных перестроек, выявленных в дебюте, отмечено появление новых реаранжировок (№ 2). У одного пациента в рецидиве заболевания сохранились только две из семи реаранжировок, выявленных в дебюте (рис. 2, № 4). У одного пациента в дебюте В-ОЛЛ выявлена только одна клональная реаранжировка генов ô-цепи TCR, которая сохранилась в рецидиве, но появились несколько новых, в том числе клональные реаранжировки генов IGH и генов легкой к-цепи IG.
Нами показано, что у всех пациентов в рецидиве ОЛЛ сохранился хотя бы один клональный продукт из выявленных в дебюте (табл. 6). Это подтверждает данные, согласно которым даже при развитии позднего рецидива ОЛЛ у детей (более чем через 5 лет с момента констатации ремиссии) сохраняется хотя бы один исходный клональный продукт [27]. В нашей работе у пяти из шести (83%) пациентов отмечено несоответствие клональных реаранжировок в дебюте и рецидиве заболевания. Даже при столь
небольшой выборке мы наблюдали клональную эволюцию в рецидиве заболевания, что делает актуальным вопрос о первоначальном выборе мишени для количественного определения МОБ. Для минимизации риска ложноположительных результатов принято использовать как минимум две независимые мишени с высокой стабильностью. Однако на практике не ко всем мишеням удается подобрать пациент-специфичный праймер, который обладает нужной специфичностью и чувствительностью. Прежде всего, это касается незавершенных реаранжиро-вок или генных реаранжировок, где отсутствует D-сегмент, например TCRG (Vy-Jy). Нами обнаружена потеря пациент-специфичных мишеней, выявленных у трех пациентов в дебюте заболевания. Для того чтобы зафиксировать минорные субклоны в дебюте заболевания и оценить их поведение на фоне проводимой терапии, мы решили повысить первоначальную чувствительность метода. При помощи праймеров, специфичных к семействам V и J, мы повторно исследовали первоначальный материал на предмет наличия клонов, возникших в рецидиве. Использование таких праймеров увеличивает чувствительность определения опухолевых клеток с 10-1 до 10-2 —10-3. Однако даже при такой чувствительности субклоны не были обнаружены в дебюте, что свидетельствует о малом размере субклонов и подтверждает данные других исследований. Так, в 77% (35 из 45) случаев детского В-ОЛЛ клоны с но-
Пациент 5 Дебют
Рецидив
GA
D1
.142
/ /
) ■-___ . 1 .
207
зон
1МВ
поли
GA
• 164
• • -_ии I
GB
/
151
/
165
D1
.142 / /
207
D2 Л 64 / 1
1 . . . г к .
ЮН-А 347 /
150 210 270 330
ЮН-В * к. /27?
|1 , 144 / ЮН-С
Лы1
D2 к и п 11 оли
120 1в0 240 эоо эи
ЮН-А 330, .....1 347 / к
120 1В0 240 300 эво
ЮН-В . 1.1 263
120 1» 240 ЭСЮ ЭВД
/127 V1" ЮН-С
поли
Рис. 1. Данные фрагментного анализа продуктов амплификации генов TCRG, TCRD, ЮН пациента № 5 в дебюте и рецидиве заболевания. В дебюте выявлено два клональных продукта длиной 142 и 207 п.н. (указаны стрелками) реаранжировки генов TCRD, клональный продукт 347 п.н. реаранжировки генов ЮН. В рецидиве заболевания у данного пациента сохранились исходные клональные реаранжировки генов TCRD и тяжелой цепи ЮН, при этом появились новые клональные реаранжировки генов у-цепи TCR (TCRGA - 164 п.н., TCRGB - 151, 165 п.н.), тяжелой цепи Ю (ЮНА - 330 п.н., ЮНВ - 263 п.н., ЮНС - 127 п.н.)
выми реаранжировками в рецидиве присутствовали лишь в минимальных количествах при дебюте заболевания [28]. Размер таких резистентных субклонов варьировал от 10-2 до 10-5 клеток, и чем меньше было количество клеток, тем больше времени проходило до рецидива [29].
В последние годы показано, что острые лимфо-бластные лейкозы имеют сложный и генетически неоднородный состав опухолевых клеток в пределах одного заболевания [30, 31]. В большинстве случаев ОЛЛ клональная эволюция обусловлена реактива-
цией одного из минорных субклонов, резистентного к проводимой терапии [14, 29, 32]. Клональное разнообразие является механизмом опухолевой прогрессии. Часть клональных клеток, вероятно, имеет отличные от остальных клеток свойства (генетические мутации, скорость деления, иммунологическую зрелость), что придает им устойчивость к воздействию химиотерапии. Причины поздней реактивации первоначального опухолевого клона до сих пор неизвестны. Возможно, происходит ослабление иммунологического надзора и механизмов противоопухоле-
2000 О
Дебют
120 160 240 300
- GA 212
I • г
гни 1400 700 0
640 ; D2
эео-
180- 1 ..1
163
120
оооа- GB .180
4000 /
2000- /
I ■ Л 1
D1
124 /
1.1 / 1 . ...
3000 TCRB-A
2000 260 ^
юоо
Рецидив
120
600 400 200 О
390 260
130
о
1200 ООО 400 О
120 200 230
GB jll.lL.. поли
: D1 ■ 24 *
1 . ]
120 200 200
- D2 поли
.1. 1 . Ц J I _
Рис. 2. Данные фрагментного анализа продуктов амплификации генов TCRG, TCRD, ЮК, TCRB пациента № 4 в дебюте и рецидиве заболевания. В дебюте выявлено семь клональных продуктов (указаны стрелками). В рецидиве у данного пациента сохранились только два клональных продукта из семи исходных - реаранжировка генов TCRD (в реакции D1 - 124 п.н.) и легкой к-цепи Ю (в реакции VK-B - 283 п.н.)
вого иммунитета или появление новых генетических мутаций в опухолевых клетках с их последующей реактивацией. Применение количественных методов оценки МОБ является независимым фактором прогноза и критерием разделения пациентов на группы риска развития рецидива. В течение заболевания спектр клональных реаранжировок может изменяться. Такой процесс может происходить в течение раннего индукционного курса терапии, что дает ложноотрицательные результаты определения МОБ и препятствует стратификации больных на группы риска. Успешный контроль минимальной остаточной болезни можно обеспечить только при подборе пациент-специфичных праймеров для каждой клональ-ной мишени, выявленной в дебюте заболевания.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
У пяти из шести (83%) пациентов отмечено несоответствие клональных реаранжировок в дебюте и рецидиве заболевания, что говорит о клональной нестабильности на фоне проводимой полихимиотерапии. Опухолевые клетки при ОЛЛ изначально имеют сложный генетически неоднородный состав,
и в то время как одни клоны исчезают под воздействием полихимиотерапии, другие, не распознанные из-за недостаточной чувствительности метода, приобретают способность к пролиферации. Клональная эволюция служит одним из механизмов опухолевой прогрессии и является серьезной помехой для количественной оценки МОБ методом ПЦР. Нами показано, что отсутствие амплификации с пациент-специфичными праймерами, подобранными к мишеням, секвенированным в дебюте заболевания, не может полностью гарантировать отсутствие остаточного заболевания, так как мы показываем, что в ряде случаев при остром лейкозе опухолевые клоны нестабильны. Таким образом, в сомнительных случаях при подозрении на рецидив и отсутствии амплификации с пациент-специфичными праймерами необходимо повторное исследование клональности. Изучение механизмов клональной эволюции, способности полихимиотерапии влиять на процессы кло-нальной эволюции, возможно, будет способствовать разработке новых прогностических факторов и терапевтических подходов. •
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Felix C. Acute lymphoblastic leukemia in infants. Washington: Education Program Book of hematology, American society of hematology, 2015. P. 285-302.
2. Паровичникова Е.Н., Троицкая В.В., Соколов А.Н., Ахмер-заева З.Х., Кузьмина Л.А., Менделеева Л.П., Клясова Г.А., Кравченко С.К., Грибанова Е.О., Бондаренко С.Н. и др. // Онкогематология. 2014. № 3. С. 6-15.
3. Campana D., Pui C. // Blood. 1995. V. 85. № 6. P. 1416-1434.
4. Copelan E., McGuire E. // Blood. 1995. V. 85. № 5. P. 1151-1168.
5. Flohr T., Schrauder A., Cazzaniga G., Panzer-Grümayer R., van der Velden V., Fischer S., Stanulla M., Basso G., Niggli F.K., Schäfer B.W. // Leukemia. 2008. V. 22. № 4. P. 771-782.
6. Brüggemann M., Raff T., Flohr T., Gökbuget N., Nakao M., Droese J., Lüschen S., Pott C., Ritgen M., Scheuring U., et al. // Blood. 2006. V. 107. № 3. P. 1116-1123.
7. van Dongen J.J., van der Velden V.H., Brüggemann M., Orfao A. // Blood. 2015. V. 125. № 26. P. 3996-4009.
8. van der Velden V.H., Hochhaus A., Cazzaniga G., Szczepan-ski T., Gabert J., van Dongen J.J. // Leukemia. 2003. V. 17.
P. 1013-1034.
9. van Dongen J.J., Langerak A.W., Bruggemann M., Evans P.A.S., Hummel M., Lavender F.L., Delabesse E., Davi F., Schuuring E., García-Sanz R. // Leukemia. 2003. V. 17. № 12. P. 2257-2317.
10. Pongerse-Willemse M.J., Seriu T., Stolz F., d'Aniello E., Gameiro P., Pisa P., Gonzalez M., Bartram C.R., Panzer-Grümayer E.R., Biondi A. // Leukemia. 1999. V. 13. P. 110-118.
11. Szczepanski T., van der Velden V.H., Raff T., Jacobs D.C., van Wering E.R., Brüggemann M., Kneba M., van Dongen J.J. // Leukemia. 2003. V. 17. № 11. P. 2149-2156.
12. Szczepanski T., van der Velden V.H., Waanders E., Kuiper R.P., van Vlierberghe P., Gruhn B., Eckert C., Panzer-Grü-mayer R., Basso G., Cavé H., et al. // ClinOncol. 2011. V. 29. № 12. P. 1643-1649.
13. Beishuizen A., Verhoeven M.A., van Wering E.R., Hahlen K., Hooijkaas H., van Dongen J.J. // Blood. 1994. V. 83. № 8. P. 2238-2247.
14. Li A., Zhou J., Zuckerman D., Rue M., Dalton V., Lyons C., Silverman L.B., Sallan S.E., Gribben J.G. // Blood. 2003. V. 102. № 13. P. 4520-4526.
15. Szczepanski T., Willemse M.J., Brinkhof B., van Wering E.R., van der Burg M., van Dongen J.J. // Blood. 2002. V. 99. № 7.
P. 2315-2323.
16. van der Velden V.H., Szczepanski T., Wijkhuijs J.M., Wijkhui-js J.M., Hart P.G., Hoogeveen P.G., Hop W.C.J, van Wering E.R., van Dongen J.J.M. // Leukemia. 2003. V. 17. № 9. P. 1834-1844.
17. Beishuizen A., Hahlen K., Hagemeijer A., Verhoeven M.A., Hooijkaas H., Adriaansen H.J., Wolvers-Tettero I.L., van Wering E.R, van Dongen J.J. // Leukemia. 1991. V. 5. № 8.
P. 657-667.
18. Beishuizen A., de Bruijn M.A., Pongers-Willemse M.J., Verhoeven M.-A.J., van Wering E.R., Hahlen K., Breit T.M., de Bruin-Versteeg S., Hooijkaas H., van Dongen J.J.M. // Leukemia. 1997. V. 11. № 12. P. 2200-2207.
19. Bruggemann M., van der Velden V.H., Raff T., Droese J., Ritgen M., Pott C., Wijkhuijs A.J., Gökbuget N., Hoelzer D., van Wering E.R. // Leukemia. 2004. V. 18. № 4. P. 709-719.
20. Breit T.M., WolVers-Tettero I.L., Beishuizen A., Verhoeven M.A., van Wering E.R., van Dongen J.J. // Blood. 1993. V. 82. № 10. P. 3063-3074.
21. Szczepanski T., Langerak A.W., Willemse M.J., Wolvers-Tettero I.L., van Wering E.R., van Dongen J.J. // Leukemia. 2000. V. 14. № 7. P. 1208-1214.
22. van der Velden V.H., Wijkhuijs J.M., Jacobs D.C., van Wering E.R., van Dongen J.J. // Leukemia. 2002. V. 16. № 7. P. 1372-1380.
23. Willemse M.J., Seriu T., Hettinger K., d'Aniello E., Hop W.C., Panzer-Grümayer E.R., Biondi A., Schrappe M., Kamps W.A., Masera G., et al. // Blood. 2002. V. 99. № 12. P. 4386-4393.
24. Germano G., del Giudice L., Palatron S., Giarin E., Cazzaniga
G., Biondi A., Basso G.. // Leukemia. 2003. V. 17. № 8. P. 15731582.
25. Сидорова Ю.В., Сорокина Т.В., Бидерман Б.В., Никулина Е.Е., Кисиличина Д.Г., Наумова Е.В., Почтарь М.Е., Лугов-ская С.А., Иванова В.Л., Ковалева Л.Г. и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 2011. № 12. С. 22-35.
26. Dongen J.J., Langerak A.W., Bruggemann M., Evans P.A., Hummel M., Lavender F.L., Delabesse E., Davi F., Schuur-ing E., García-Sanz R., et al. // Leukemia. 2003. V. 17. № 12. P. 2257-2317.
27. Lo Nigro L., Cazzaniga G., Di Cataldo A., Pannunzio A., D'Aniello E., Masera G., Schiliró G., Biondi A. // Leukemia. 1999. V. 13. P. 190-195.
28. Eckert C., Flohr T., Koehler R., Hagedorn N., Moericke A., Stanulla M., Kirschner-Schwabe R., Cario G., Stackelberg A.,
Bartram C.R., et al. // Leukemia. 2011. V. 25. № 8. P. 1305-1313.
29. Choi S., Henderson M.J., Kwan E., Beesley A.H., Sutton R., Bahar A.Y., Giles J., Venn N.C., Pozza L.D., Baker D.L., et al. // Blood. 2007. V. 110. № 2. P. 632-639.
30. Mullighan C.G., Zhang J., Kasper L.H., Lerach S., Payne-Turner D., Phillips L.A., Heatley S.L., Holmfeldt L., Collins-Underwood J.R., Ma J., et al. // Nature. 2011. V. 471. № 7337. P. 235-239.
31. Gawad C., Pepin F., Carlton V.E., Klinger M., Logan A.C., Miklos D.B., Faham M., Dahl G., Lacayo N. // Blood. 2012. V. 120. № 22. P. 4407-4417.
32. de Haas V., Verhagen O.J., von dem Borne A.E., Kroes W., van den Berg H., van der Schoot C.E. // Leukemia. 2001. V. 15. № 1. P. 134-140.
