CC BY
21
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ
П.А. Сибиряков1, Г.А. Цаур123, А.М. Попов4, Т.Ю. Вержбицкая12, Л.И. Савельев1-2-3, Ю.В. Румянцева4, А.И. Карачунский4,
Л.Г. Фечина1,2
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬ К РАЗВИТИЮ ОСТРОГО ЛИМФОБЛАСТНОГО ЛЕЙКОЗА У ДЕТЕЙ
1Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области «Областная детская клиническая больница», г. Екатеринбург
2 Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области «Центр специализированных видов
медицинской помощи «Институт медицинских клеточных технологий», г. Екатеринбург 3Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Уральский
Государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Екатеринбург 4Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва
Введение. Известно, что врожденные генетические варианты генов, ответственных за развитие В-клеток, влияют на восприимчивость к острому лимфобластному лейкозу (ОЛЛ) у детей в Европе и США. Известно, что частота риск-аллелей, влияющих на предрасположенность к ОЛЛ в детском возрасте, значительно различаются в зависимости от происхождения. В России со смешанной этнической принадлежностью населения такого рода исследования ранее не проводились.
Цель. Оценить связь между генетическими вариантами генов ARID5B, 1^1, СЕВРЕ, CDKN2B, CDKN2A, GATA3, Р1Р4К2А, ТР63 и предрасположенностью к развитию ОЛЛ у детей.
Материалы и методы. Мы сравнили частоты аллелей следующих 11 5ЫР: ^4132601, ^11978267 (оба в 7р12.2, 1^1), ^17756311 (9р21.3, CDKN2B), ^3731249, ^3731217 (оба в 9р21.3, CDKN2A), ^7088318 (10р12.2, Р1Р4К2А), ^3824662 (10р14, САТА3), ^10821936, ^7089424 (оба в ^21.2, АШ5В), ^2239633 (^11.2, СЕВРЕ), ^17505102 ^28, ТР63) у 422 детей с ОЛЛ (366 случаев ОЛЛ из В-линейных предшественников (ВП-ОЛЛ) и 56 детей с Т-линейным ОЛЛ (Т-ОЛЛ)) с медианой возраста 4,5 года (диапазон 1,03-17,8), а также у 427 детей из контрольной группы без ОЛЛ. Риск определяли путем расчета отношения шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ). Информированное согласие было получено в каждом случае.
Результаты. Результаты генотипирования 11 в 8 генах показали, что риск-аллели ^4132601, ^11978267, ^10821936, ^7089424 и ^17505102 достоверно чаще выявлялись у пациентов с ОЛЛ по сравнению с пациентами контрольной группы (ОШ 1,64, 1,67, 1,85, 1,73 1,38, соответственно; р<0,0001 для первых четырех групп и р=0,02233 для пятой). Два в IKFZ1 находились в сильном неравновесном сцеплении, также как 2 в ARID5B (г2> 0,94 в обоих случаях). Таким образом, ^7089424 и ^11978267 были исключены из дальнейшего анализа. Следует отметить, что гб10821936 в ARID5B и ^4132601 в IKZF1сохраняли свою значимость не только в общей группе пациентов, но и у пациентов с ВП-ОЛЛ, а также в следующих подгруппах: с транслокацией t(12;21)/ETV6-RUNX1 (п=91), высокой гипердиплоидией (п=72), в группе другие В-линейные
ОЛЛ (п=145), при BCR-ABL1-подобном ОЛЛ (п=20), у пациентов моложе 10 лет (п=300) (р<0,0052 во всех случаях). Ни один из 11 маркеров не был связан с Т-ОЛЛ. За исключением двух вышеуказанных ни один из оставшихся маркеров не был связан с более высоким риском ОЛЛ с транслокацией ^12;21)/ ETV6-RUNX1. ^3731249 в CDKN2A увеличивал риск развития ОЛЛ с высокой гипердиплоидией (ОШ 3,29 р=0.0078). Также выявлена ассоциация риск-аллеля ^3824662 в GATA3 и BCR-ABL1-подобного ОЛЛ: риск-аллель в GATA3 значительно чаще обнаруживался при BCR-ABL1-подобном ОЛЛ, чем при ВП-ОЛЛ, а также среди пациентов из группы другие B-линейные ОЛЛ (ОШ 3,68 р<0,0001 и ОШ 2,95 р=0.0016, соответственно). Не было обнаружено связи между ^3824662 и ответом на лечение (ответ на дексаметазон на 8 день, статус костного мозга на 15 день, МОБ-позитивность на 15-й, 36 дни). Тем не менее, пациенты с ВП-ОЛЛ, имеющие хотя бы 1 риск-аллель GATA3, имели худший прогноз из-за более низкой БСВ (0,75±0,04, по сравнению с 0,88±0,03 р=0,012) и более высокой частоты рецидивов (0,22±0,04, по сравнению с 0,09±0,02 р=0,002).
Выводы. Таким образом, мы показали наличие врожденных генетических вариантов, влияющих на предрасположенность к развитию ОЛЛ. Большинство ранее описанных локусов восприимчивости к ОЛЛ не было связано с риском развития ОЛЛ в наблюдаемой группе пациентов, что может отражать реальное генетическое разнообразие и лишь частично объясняться низким количеством наблюдений в основной и контрольной группах. Наиболее сильная связь наблюдалась между наследуемыми генетическими вариантами в IKZF1 и ARID5B и риском развития ОЛЛ у детей. Также была отмечена умеренная ассоциация ТР63 ^1505102 с более высоким риском развития ОЛЛ. У 13,6% пациентов с ВП-ОЛЛ, несущих 5 риск-аллелей, было выявлено увеличение риска ОЛЛ в 4,2 раза по сравнению со средним числом аллелей риска (п=3) (р<0,0001). ^3824662 в GATA3 связан с риском BCR-ABL1-подобного ОЛЛ, а также неблагоприятным исходом. Также выявлена ассоциация между CDKN2A ^3731249 и риском развития ОЛЛ с высокой гипердиплоидией.
Ю.В. Сидорова, Н.В. Рыжикова, С.Ю.Смирнова, Н.А. Северина, Е.Б. Рыбкина, Е.И. Захарько, В.Н. Двирнык, О.А. Ляврилина,
Е.Н. Паровичникова, А.Б. Судариков
ОСОБЕННОСТИ РЕАРАНЖИРОВОК ГЕНОВ T-КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА ПРИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗАХ ИЗ РАННИХ Т-КЛЕТОЧНЫХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ, Т-ОЛЛ С КОЭКСПРЕССИЕЙ МИЕЛОИДНЫХ МАРКЕРОВ И ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗАХ СО СМЕШАННЫМ Т/МИЕЛОИДНЫМ ФЕНОТИПОМ
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.г. Москва
Введение. Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) из ранних Т-клеточных предшественников (ЕТР) - редкая, недавно выделенная подгруппа Т-ОЛЛ, опухолевые клетки которой несут одновременно иммунофенотипические маркеры ранней диф-
ференцировки Т-клеток (суКШ, CD7) и один или несколько миелоидных маркеров или маркеров стволовых клеток. Прогноз при ЕТР неблагоприятный, а при рецидивах часто наблюдается смена иммунофенотипа (ИФ) на миелоидный. Счита-
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVII, № 2, 2021
ется, что клетка-предшественница ETP имеет полипотентные черты как Т-клеток, так и миелоидных предшественников. Одна из черт, характеризующая Т-клетку - реаранжировки генов Т-клеточного рецептора (TCRr), которые происходят уже на самых ранних этапах развития Т-клетки. Клональные TCRr находят у 95% больных с T-ОЛЛ. При этом неполные перестройки TCRD (VS2/DS2-DS3) не являются линейно-специфичными и могут определяться даже при ОМЛ. Гены S-цепи TCR (TCRD) - самая ранняя генная перестройка в T-лимфоцитах, встречается примерно в 50-55% случаев Т-ОЛЛ, гены у-цепи TCR (TCRG) перестроены у 95% пациентов, гены ß-цепи TCR (TCRB) - у 92% пациентов. Частота и характер TCRr при ETP-ОЛЛ не изучены, хотя известно, что TCRr происходят значительно реже чем при Т-ОЛЛ. Кроме того, особый интерес представляют данные о стабильности TCRr в рецидивах заболевания со сменой ИФ.
Цель. Определить характер и стабильность клональных реаранжировок генов T-клеточных рецепторов у пациентов с ETP-ОЛЛ и прочими ОЛЛ с коэкспрессией Т/миелоидных маркеров. Изучить связь между TCRr и иммунологическими маркерами, характеризующими зрелостью Т-лимфоцитов (cyt CD3).
Материалы и методы. Всего исследовано 36 пациентов: 21 ETP-ОЛЛ, 10 T-ОЛЛ с коэкспрессией миелоидных маркеров и 5 острых лейкозов со смешанным Т/миелоидным фенотипом (ОЛСФ), которые наблюдались в "НМИЦ Гематологии" МЗ РФ с 2015 года. У 14 пациентов проведен сравнительный анализ реаранжировок в дебюте и рецидиве/ах заболевания. Исследование реаранжировок генов TCRD, TCRG и TCRB проводили методом ПЦР по протоколу BIOMED-2 с последующим капиллярным электрофорезом на секвенаторе ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems).
Результаты. У 52% (11 из 21) пациентов с ETP-ОЛЛ не было выявлено никаких TCRr, т. е. гены TCR находились в терми-
нальном состоянии, либо были выявлены только неполные реаранжировки ТС^О, что указывало на отсутствие признаков "генетической дифференцировки" в сторону Т-лимфоцитов. У остальных пациентов выявлялись реаранжировки одной или нескольких цепей TCR. Среднее количество ТС^г на одного пациента было самым низким в группе ЕТР-ОЛЛ (1,2), чуть выше у пациентов с Т-ОЛЛ с коэкспрессией миелоидных маркеров (2,1) и в группе с ОЛСФ -3,8, при этом различия были недостоверны из-за малой выборки. Корреляция количества TCRг и су£03 отсутствовала (р=0,2), т. е. даже при 99,9% экспрессии су£03 гены Т-клеточного рецептора могли находиться в терминальном состоянии и наоборот. Мы исследовали и сравнили TCRг в дебюте и в рецидивах заболевания у 14 пациентов. У 4-х пациентов из 14 (29%) мы выявили частичную смену TCRг в рецидиве, в основном за счет приобретения новых, более "зрелых" реаранжировок TCRB, что очевидно можно связать с работой ферментов RAG1 и RAG2, которые отвечают за процесс V-D-J рекомбинации. У 71% (10 из 14) новых TCRг в рецидивах не появилось, а выявленные в дебюте были стабильны. Большинство из этих пациентов (8 из 10) имели "незрелый" характер TCRг, что может указывать на дефицит ферментов RAGl и RAG2 в опухолевых клетках, как в дебюте, так и в рецидиве заболевания. Мы исследовали TCRг у 3-х пациентов с рецидивами и сменой ИФ. У 100% (3 из 3) при смене ИФ клональные TCRг не изменились, т.е. опухолевый клон в рецидиве остался прежним.
Выводы. ЕТР-ОЛЛ в 52% случае демонстрирует "незрелый" профиль TCRг (полное отсутствие или наличие только неполной реаранжировки TCRD). При этом четкой связи между наличием ТС^г и экспрессией cytCD3 не выявлено. TCRг имеют высокую стабильность при рецидивах, даже в случаях смены ИФ с Т-клеточного на миелоидный, что доказывает полипотент-ность клеток-предшественников ЕТР-ОЛЛ.
Ю.В. Сидорова, Н.А. Северина, Б.В. Бидерман, Н.В. Рисинская, О.А. Глинщикова, А.С. Пшеничный, И.А. Лукьянова, Е.Н. Паровичникова, А.Б. Судариков
МОНИТОРИНГ МУТАЦИИ FLT3-ITD МЕТОДОМ TD-PCR
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г.Москва
Введение. Мутация FLT3-ITD - внутренняя тандемная дупликация в 14 экзоне/интроне гена FLT3, является одной из самых частых мутаций при остром миелобластном лейкозе (ОМЛ) и встречается в 25-30% случаев. Как фактор неблагоприятного прогноза данная мутация интересна для мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ). Однако непостоянное место и вариабельный размер (от нескольких нуклеотидов до >200 Ьр) вставки затрудняет ПЦР диагностику. Недавно предложенный метод TD-PCR обладает достаточной чувствительностью 10-4-10-5 для отслеживания МОБ. В основе метода - система из 8-ми пар праймеров, которые перекрывают возможную зону дупликации. В каждой паре прямой и обратный праймер комплементарны друг другу, и в случае отсутствия вставки FLT3-ITD ПЦР амплификация не происходит. Если есть дупликация FLT3, то один из праймеров "садится" на дуплицированный участок, что приводит к появлению амплификата равного длине вставки плюс длина праймера. При помощи капиллярного электрофореза и фрагментного анализа можно выявить амплификат нужной длины. Ниже мы приводим первые результаты применения данного метода для мониторинга МОБ при ОМЛ.
Цель. Оценить возможности метода TD-PCR при оценке МОБ у пациентов с ОМЛ.
Материалы и методы. Всего исследовано 53 пациента с ОМЛ с FLT3-ITD мутацией, наличие которой было доказано методом фрагментного анализа стандартными протоколами. Все пациенты наблюдались или проходили первичное обследование в "НМИЦ Гематологии" МЗ РФ с 2018 года. Для
TD-PCR применяли методику, описанную ранее.
Результаты. У 56,6% (30 из 53 пациентов) с FLT3-ITD удалось выполнить TD-PCR, т.е. при первичном тестировании и также при разведении в 1000/ 10000 раз выявлен амплифи-кат нужной длины. Основная причина невозможности применения данного метода - короткая вставка (у 21 из 53 пациентов - 39,6%). При размере вставки менее 40 нуклеотидов определение специфического продукта при фрагментном анализе невозможно из-за димеров праймеров схожего размера, а также слишком маленькой зоны посадки праймеров. У 2-х из 53 - 3,8% чувствительность метода оказалась недостаточной для определения МОБ, что было показано при первичном тестировании. У 4-х из 4-х пациентов без эради-кации клона FLT3-ITD перед трансплантацией аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК), такой же клон продолжал выявляться и после алло-ТГСК, а заболевание рецидивировало в сроки от 5 мес до 2, 5 лет.
Выводы. Метод TD-PCR приемлем для определения МОБ, однако чувствительность определения сильно варьирует от пациента к пациенту и в ряде случаев может быть недостаточной для определения МОБ, что требует первичного тестирования на серии разведений. Метод можно применить примерно у половины пациентов с FLT3-ITD, так как он не рассчитан на определение вставок длиной менее 40 нуклеотидов. Существенным недостатком является то, что метод TD-PCR неколичественный. Метод TD-PCR - универсальный метод для анализа FLT3-ITD, нетрудоемкий, не требующий пациент-специфичных праймеров.
