МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ, ИЗОЛИРОВАННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ БЕЛАРУСИ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Д.П. Бажанов1, К.К. Яцевич1, Л.И. Прищепа2, Д.В. Войтка2

МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ, ИЗОЛИРОВАННОГО НА ТЕРРИТОРИИ БЕЛАРУСИ

'ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 2РУП «Институт защиты растений» Республика Беларусь, 223011, Минская обл., д. Прилуки, ул. Мира, 2

Введение

Препараты на основе энтомопатогенных бактерий являются наиболее эффективным и широко используемым средством борьбы с вредными насекомыми и занимают около 90-95% мирового рынка биопестицидов [1]. Применяемые для производства биоинсектицидов энтомопатогенные бактерии обычно принадлежат к виду Bacillus thuringiensis, который родственен генетически близким видам Bacillus cereus и Bacillus anthracis [2]. Точная идентификация этих видов чрезвычайно важна, поскольку штаммы B. thuringiensis используются в качестве продуцентов биоинсектицидов, B. anthracis является возбудителем сибирской язвы, а многие штаммы B. cereus -причиной пищевых отравлений. Основным методом идентификации и внутривидовой классификации изолятов B. thuringiensis является H-серотипирование, основанное на определении иммунологической реакции к флагеллину - белку бактериальных жгутиков. По данным [3], насчитывается более 69 H-серотипов штаммов вида B. thuringiensis, в 10 из которых обнаружена внутритиповая вариабельность антигена [4]. Причиной такого разнообразия является вариабельность кодирующего флагеллин гена hag. В геномах бактерий B. thuringiensis этот ген фланкирован консервативными участками прилегающих генов, что позволяет проводить амплификацию его последовательностей с помощью универ-

сальных праймеров. С помощью типирования на основе сравнения нуклеотидных последовательностей гена hag возможно определение принадлежности новых изолятов к известным сероварам при отсутствии антисывороток.

Коллекция Института защиты растений НАН Беларуси насчитывает 28 штаммов эн-томопатогенных бактерий, идентифицированных как B. thuringiensis. Они были изолированы на территории различных районов Минской и Брестской областей Республики Беларусь из взрослых особей и личинок различных видов насекомых, принадлежащих к отрядам жесткокрылых и чешуекрылых, что позволяет предположить их принадлежность к различным подвидам и сероварам. Коллекция включает в себя как бактерии являющиеся продуцентами инсектицидных препаратов, так и штаммы, перспективные в качестве основы для разработки новых биоинсектицидов. Таксономическая идентификация этих штаммов при помощи молекулярно-генетических методов не проводилась. Лишь у некоторых из них с помощью традиционных методов была определена принадлежность к серотипам.

Цель настоящей работы - проведение молекулярно-генетического типирования перспективных для использования в качестве основы биоинсектицидов энтомопатогенных бактерий из коллекции РУП «Институт защиты растений».

Материалы и методы

В работе использовали двадцать один штамм энтомопатогенных бактерий из коллекции РУП «Институт защиты растений» и типовой штамм Bacillus cereus BIM B-169T из Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (БИМ). Сведения об источниках и времени выделения

энтомопатогенных бактерий приведены в табл. 1.

Выделение общей ДНК для использования в ПЦР проводили методом лизиса в присутствии Мех 100 [5].

Использованные в работе праймеры приведены в табл. 2.

Таблица 1

Характеристика кристаллоносных бацилл, выделенных из погибших насекомых

в Республике Беларусь

Вид Штамм Год выделения Насекомое-хозяин, место сбора, биоценоз

LP1 1985 Гусеница пяденицы, черная смородина, сад, д. Лошица-1, Минский р-н

LP2 1984 Гусеница зимней пяденицы, сад, д. Корзюки, Минский р-н

LP3 1986 Гусеница медведицы кайя, частный сад, г. Несвиж, Минская обл.

LP4 Гусеница яблонной плодожорки, сад, д. Лошица-2, Минский р-н

LP5 1979 Гусеница яблонной плодожорки, сад, д. Лошица-1, Минский р-н

LP6 Гусеница яблонной плодожорки, частный сад, Минский р-н

LP7 1990 Куколка капустной совки, совхоз «Рассвет», Минский р-н

5 LP8 Гусеница листовертки под корой, Беловежская пуща, кв. № 458, Хвойникское лесничество, сосна, ель

'1 а LP9 Куколка жука-рогача, Беловежская пуща, кв. № 457, Хвойникское лесничество, сосна, ель

« LP10 Куколка жука-рогача, Беловежская пуща, кв. № 323, дубрава

LP11 Личинка жука-рогача, Беловежская пуща, кв. № 295, сосна, ель

«и <3 LP12 Куколка жука-рогача, Беловежская пуща, кв. № 713, смешанный лес

LP13 Имаго, жук-рогач, Беловежская пуща, кв. № 713, смешанный лес

LP14 1991 Имаго, жук-щелкун, Беловежская пуща, кв. №506, березовая роща

LP15 Имаго жужелицы, Беловежская пуща, кв. № 713, смешанный лес

LP16 Куколка жужелицы, Беловежская пуща, кв. № 773, смешанный лес

LP17 Имаго жужелицы, Беловежская пуща, кв. № 264, смешанный лес

LP18 Имаго долгоносика, Беловежская пуща, кв. № 264, ель, сосна

LP19 Личинка щелкуна, Беловежская пуща, кв. № 264, ель, сосна

LP20 Имаго жука-рогача, Беловежская пуща, кв. № 264, ель, сосна

LP21 Личинка жука-короеда, Беловежская пуща, кв. № 264, ель, сосна

Таблица 2

Характеристика праймеров

Праймер Последовательность Ссылка

27f 5' GAGTTTGATCCTGGCTCAG 3' [6]

960г 5' GCTTGTGCGGGTCCCCG 3' [7]

519г 5' GWATTACCGCGGCKGCTG 3'

ERIC Ш.1 5' ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC 3' [8]

ERIC2 5' AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG 3'

BOXA1R 5' CTACGGCAAGGCGACCTGACG 3' [9]

Bc-REP-1 5' ATTAAAGTTTCACTTTAT 3' [10]

Bc-REP-2 5' TTTAATCAGTGGGG 3'

Bthag F1 5-AGTACATGCGCCAAAACCAAG-3' [11]

Bt hagR1 5'-GTTTGCTTGAGAAAGCATGCT-3'

Генетическое типирование. Для Rep-ПЦР при 30 мкл реакционной смеси использовали 10Х буфер (Диалат Ltd., Россия), 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 1 единицу BioTaq-полимеразы (Диалат Ltd., Россия), праймеры (табл. 2) ERIC IR1, ER-IC2 (по 60 пмолей каждого индивидуально), BOXA1R (60 пмолей), Bc-REP-1 и Bc-REP-2 (по 60 пмолей) и 0,5 мкл геномной ДНК в качестве матрицы. В случае ERIC-ПЦР реакцию начинали инкубированием реакционной смеси при 95 °C в течение 5 минут, затем следовало 4 цикла состоящих из инкубаций: 94 °C -5 мин, 40 °C - 5 мин, 72 °C - 5 мин, которые сменялись 35 циклами, состоящими из 94 °C -1 мин, 55 °C - 1 мин, 72 °C - 2 мин. Реакцию завершали инкубированием смеси при 72 °C в течение 10 минут. В случае BOX-ППР каждый из 35 циклов состоял из инкубаций: 94 °C -1 мин, 45 °C - 1 мин, 72 °C - 2 мин. Завершающую элонгацию проводили при 72 °C в течение 10 мин. В случае RFP-ППР каждый из 30 циклов состоял 94 °C - 1 мин, 42 °C -1 мин, 72 °C - 1,5 мин. Завершающую элонгацию проводили при 72 °C в течение 7 мин.

Электрофорез проводили в 2%-ном агароз-ном геле в стандартном трис-боратном буфере половинной концентрации [12]. Гели окрашивали этидиум бромидом и фотографировали при просвечивании ультрафиолетовыми лучами с помощью системы GelDoc 2000 (Bio-Rad).

Матрицы для секвенирования генов 16S рРНК исследуемых штаммов синтезировали методом ПЦР с использованием универсальных праймеров 27f и 960r, для секвенирования генов hag - с помощью праймеров Bt hag F1 и Bt hag R1 (табл. 2). Реакционная смесь (30 мкл) содержала 3 мкл 10Х буфера (Диалат Ltd., Россия), 200 мкМ каждого дезоксирибо-нуклеозидтрифосфата, по 60 пкмолей каждого

из праймеров, 1 единицу BioTaq-полимеразы (Диалат Ltd., Россия) и 0,5 мкл общей ДНК в качестве матрицы. Амплификацию генов 16S рРНК проводили в градиентном термоцикле-ре MJ Mini™ (Bio-Rad). ПЦР начинали инкубированием реакционной смеси при 95 оС в течение 4 минут, затем следовало 30 циклов, состоящих из инкубаций: 94 оС - 30 секунд, 55 °С - 30 секунд, 72 °С - 2 минуты. Реакцию завершали инкубированием смеси при 72 °С в течение 10 минут. При амплификации генов hag температуру отжига праймеров понижали до 45 °С, а время элонгации уменьшали до 1 минуты. Очистку продуктов амплификации проводили путем вырезания единичных фрагментов ДНК с последующей их экстракцией из 1,5% геля, используя набор реагентов DNA Extraction Kit (Fermentas). При необходимости ПЦР фрагменты генов hag у части исследуемых штаммов перед секвенированием клонировали в плазмиду pBluescript II KS (+) согласно [13].

Секвенирование фрагментов генов 16S рРНК и hag идентифицируемых бактерий проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) c использованием набора для секвенирования BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems). Компьютерную обработку данных, полученных в результате секвени-рования, проводили в программе Sequencing Analysis Software v5.2 (Applied Biosystems). Анализ сходства нуклеотидных последовательностей проводили с использованием базы данных GenBank при помощи анализатора BLAST Национального центра биотехнологической информации США (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST). Филогенетический анализ и построение дендограмм осуществляли по алгоритму Neighbor Joining [14] с помощью пакета программ Mega 4 [15].

Результаты и обсуждение

На первом этапе работы осуществили типирование энтомопатогенных бактерий с помощью Rep-ПЦР при использовании индивидуальных праймеров ERIC IR1, ERIC2, BOXA1R, и пары праймеров Bc-REP-1/Bc-REP-2. (рис. 1).

Наибольшей дифференцирующей способностью обладал праймер ERIC IR1, позволивший разделить исследуемые бактерии на

три неравнозначных по численности группы (рис. 1А). Большинство штаммов, 18 из 21, вошли в группу I, внутри которой отсутствовали различия по составу продуктов амплификации (штаммы LP1-LP3, LP5, LP6, LP8-LP13, LP15-LP21). Паттерны штаммов группы I состояли из 14 основных фрагментов размером от 220 до 2000 пар нуклеотидов (п.н.). Паттерны бактерий группы II (LP4 и LP7) существенно

отличались от штаммов группы I по количеству и размеру амплифицируемых фрагментов. Паттерны штаммов LP4 и LP7 включали в свой состав 10 фрагментов размером от 150 до 2000 п.н., из которых только 2 соответствовали по размеру фрагментам паттерна группы I (600 и 2000 п.н.). В группу III был выделен единственный штамм LP14, паттерн которого был близок штаммам группы I и не содержал фрагментов в диапазоне 700-2000 п.н., но имел 2 до-

полнительных фрагмента размером около 580 и 620 п.н. при отсутствии фрагмента размером 600 п.н. (рис. 1А). При использовании прайме-ра ЕМС2 (рис. 1Б) и пары Вс-ЯЕР-Шс-ЯЕР-2 (рис. 1Г) разделение штаммов на группы было сходным, за исключением того, что паттерны штамма LP14 были идентичны паттернам бактерий группы I. При анализе с помощью ВОХ-ПЦР различий между исследуемыми штаммами не было выявлено (рис. 1В).

Рис. 1. Rep-ПЦР типирование штаммов энтомопатогенных бактерий с помощью праймеров: A - ERIC IR1,

Б -ERIC2, В - BOXA1R, Г - Bc-REP-1/Bc-REP-2. Дорожки обозначены номерами исследуемых штаммов. М - маркер молекулярной массы - Gene Ruler™

100 bp (Fermentas)

На втором этапе работы нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК шести представителей из всех трех генотипических групп (ЬР2, LP4, LP7, LP8, LP11 и ЬР14) были определены на протяженности более 350 п.о. и депонированы в GenBank (номера доступа КГ258818-КГ258823 соответственно). В результате поиска наиболее сходных последовательностей в базе данных GenBank была установлена принадлежность исследуемых бактерий к группе близкородственных видов В. сегеш - В. thuringiensis - В. апШт-

cis. При проведении филогенетического анализа бактерии генотипических групп I и Ш и типовой штамм B. thuringiensis образовывали обособленную ветвь в кластере близкородственных видов группы B. cereus, в то время как положение в нем штаммов группы II было неустойчивым (рис. 2).

Результаты филогенетического анализа коррелировали с результатами Rep-генотипирования и позволили отнести энтомопатогенные бактерии генотипических групп I и III к гено-мовиду Bacillus thuringiensis, в то время как

таксономическое положение бактерий LP4 и LP7 могло быть определено лишь до уровня

группы видов B. Thuringiensis B. anthracis.

B. Cereus

LP14 (III) (KF258823)

В. thuringiensis ATCC 10792T (AF290545) LP8 (I) (KF258821) LP11 (I) (KF258822) LP2 (I) (KF258818)

B. thuringiensis IAM 12077T (NR_043403) LP4 (II) (KF258819) LP7 (II) (KF258820)

B. cereus ATCC 14579T (AE016877) B. anthracis ATCC 14578T (NR_041248)

_i B. pseudomycoides DSM 12442T (AM747226)

95 I— B. pseudomycoides CIP 105700 (AF013121) I B. mycoides 237 (NR_036880) B. mycoides CIP 103472T (AM747229) B. weihenstephanensis DSM11821T(NR_024697) — B. panaciterrae Gsoil 1517T (NR_041379)

-B. funiculus NAF001T (NR_028624)

-Paenibacillus polymyxa DSM 36T(AJ320493)

Э5

Рис. 2. Филогенетическое дерево, показывающее родство исследуемых энтомопатогенных штаммов

и бактерий рода Bacillus.

В скобках приведены номера доступа последовательностей в GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Блок сравнения включает 294 нуклеотида. Значения бутстрапа вычислены на основании анализа 1000 деревьев. Линейка

соответствует 0,02 замене на нуклеотидную позицию

На третьем этапе работы проводили типирование исследуемых изолятов на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена hag с целью определения принадлежности данных штаммов к известным сероварам. При амплификации гена флагелли-

на hag всех бактерий генотипических групп I и III с помощью пары консервативных праймеров Bt hag F1 и Bt hag R1 происходило образование продукта размером около 1000 п.о., в то время как для штаммов группы II было характерно образование ампликона длиной около 750 п.о. (рис. 3).

Рис. 3. Обнаружение генов hag с помощью геноспецифичной ПЦР. Дорожки обозначены номерами исследуемых штаммов, M - маркер молекулярной массы Gene Ruler™ 100bp

(Fermentas), К - контроль без матрицы

У представителей всех генотипических групп (LP2, LP4, LP7, LP8, LP11 и LP14) были определены нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов гена hag и депонированы в GenBank (номера до-

ступа KF258824-KF258830). При этом в геноме штаммов генотипической группы II были выявлены несколько копий генов hag, имеющих различия в нуклеотидных последовательностях. Такая внутриклональная вариабель-

ность гена флагеллина характерна для части представителей B. thuringiensi и уже описана в литературе [4]. Поиск наиболее сходных нуклеотидных последовательностей в базе данных GenBank (табл. 3) и последующий филогенетический анализ (рис. 4) позволили определить принадлежность бактерий из генотипических групп I и III к B. thuringiensis

serovar darmstadiensis. Штаммы группы II были наиболее близки бактериям B thuringiensis serovar alesti и B thuringiensis serovar kurstaki. Дифференциация этих сероваров на основании имеющихся данных оказалась невозможной. Штаммы LP4 и LP7 могут принадлежать к любому из этих сероваров либо иметь собственный, ранее неизвестный серотип.

Таблица 3

Сходство нуклеотидных последовательностей hag генов энтомопатогенных бактерий из коллекции лаборатории биологического метода защиты растений РУП «Институт защиты растений» и наиболее сходных штаммов из базы данных GenBank, %

Бактерии (Номера доступа нуклеотидных последовательностей в GenBank) LP2 LP4 locus A LP4 locus C LP7 locus B LP8 LP11 LP14

B. thuringiensis serovar darmstadiensis (DQ377242) 99,3 100 99,5 99,9

B. thuringiensis serovar andalousiensis (DQ377236) 94,7 95,4 94,7 95,6

B. thuringiensis serovar londrina (DQ377230) 92,8 93,5 93 93,7

B. thuringiensis serovar jegathesan (DQ377234) 83,9 84,7 84,1 84,6

B. thuringiensis serovar alesti (locus A)(X67138) 99,9 93,6 93,2

B. thuringiensis serovar alesti (locus B)(X67138) 93,2 88,9 99,9

B. thuringiensis serovar alesti (locus C)(X67138) 93,1 98,5 89,2

B. thuringiensis serovar kurstaki (DQ377225) 99,9 93,4 93

B. thuringiensis serovar kurstaki (locus A) (EF595775) 99,7 93,4 93

B. thuringiensis serovar kurstaki (locus B) (EF595775) 93,2 88,9 99,9

B. thuringiensis serovar kurstaki (locus C) (EF595775) 93,1 98,5 89,2

B. thuringiensis serovar fukuokaensis (DQ377247) 90,5 95,2 90,7

B. thuringiensis serovar fukuokaensis (locus С) (EF595778) 90,8 95,3 90,9

B. thuringiensis serovar fukuokaensis (locus B1) (EF595778) 93,2 90,7 94,2

B. thuringiensis serovar fukuokaensis (locus B2) (EF595778) 90,1 88,7 94,4

Примечание. Полужирным выделены наиболее высокие значения сходства.

Заключение

В результате молекулярно-генетического типирования получены новые знания о кло-нальной структуре циркулирующих на территории Беларуси энтомопатогенных бактерий, определено их таксономическое положение и принадлежность к антигенным группам в соответствии с современной серотипической классификацией.

Результаты типирования указывают на низкое генетическое разнообразие исследован-

ных бактерий. Учитывая разнообразие источников изолирования, их пространственную и временную изоляцию, можно предположить, что на территории Беларуси циркулирует незначительное число штаммов B. thuringiensis, являющихся хозяевами плазмид, несущих различные детерминанты патогенности для насекомых.

Исследование выполнено при поддержке гранта БРФФИ Б11-Ш.

Рис. 4. Филогенетическое дерево, показывающее родство исследуемых энтомопатогенных штаммов и представителей известных сероваров бактерий Bacillus huringiensis. В скобках приведены номера доступа последовательностей в GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Блок сравнения включает 503 нуклеотида. Значения бутстрапа вычислены на основании анализа 1000 деревьев. Линейка

соответствует 0,02 замене на нуклеотидную позицию

Список использованных источников

20

100

64

100

82

97| в t serovar alesti Bt5 locus С (X67138) ээ П В t serovar kurstaki BGSC-4D2 locusC (EF595775) LP4 locus С (KF258829)(II) В t serovar fukuokaensis IEBC-T03C001 (DQ377247) В t serovar fukuokaensis IEBC-T03C001 locus С (EF595778) В t serovar alesti Bt5 locus A (X67138) LP4 locus A (KF258828)(II)

■ В t serovar kurstaki IEBC-T03A001 (DQ377225)

■ В t serovar kurstaki BGSC-4D2 locusA (EF595775)

|— В t serovar fukuokaensis IEBC-T03C001 locus B1 (EF595778) |— В t serovar fukuokaensis IEBC-T03C001 locusB2 (EF595778) В t serovar alesti Bt5 locus В (X67138) LP7 locus В (KF258830)(II) В t serovar kurstaki BGSC-4D2 locusB (EF595775) - В t serovar amagiensis IEBC-T29 001 (DQ377268)

100

-В t serovar Pakistani IEBC-T13 001 (DQ377256)

В t serovar entomocidus IEBC-T06 001 (DQ377250) -В t serovar thuringiensis IEBC-T01 001 (DQ377245)

84

88 г В t serovar canadensis IEBC-T05A 001 (DQ377227) В t serovar aizawai IEBC-T07 001 (DQ377228) В t serovar galleriae IEBC-T05 001 (DQ377226) В t serovar dakota IEBC-T15 001 (DQ377231)

48

52

В t serovar colmeri IEBC-T21 001 (DQ377262) -В t serovar jegathesan IEBC-T28A001 (DQ377234)

86

|— В t serovar londrina IEBC-T10A001 (DQ377230)

-В t serovar andalousiensis IEBC-T37 001 (DQ377236)

LP8 (KF258825) (I)

В t serovar darmstadiensis IEBC-T10 001 (DQ377242) LP14 (KF258827) (III) LP2 (KF258824) (I) LP11 (KF258826)(I)

0.1

1. Feitelson, J.S. Bacillus thuringiensis: Insects and Beyond / J.S. Feitelson, J. Payne, L. Kim // BioTechnology. - 1992. - V. 10. -P. 271-275.

2. Vilas-Bôas, G.T. Biology and taxonomy of Bacillus cereus, Bacillus anthracis and Bacillus thuringiensis / G.T. Vilas-Bôas, A.P.S. Peruca, O.M.N. Arantes // Can. J. Microbiol. - 2007. -V. 53. - P. 673-687.

3. Updating the H-antigen classification of Bacillus thuringiensis / M.-M. Lecadet [et al.] // J. Appl. Microbiol. - 1999. - V. 86. -P. 660-672.

4. Xu, D. Sequence diversity of Bacillus thuringiensis flagellin (H antigen) protein at the intra-H serotype level / D. Xu, J.-C. Côte // Appl. Environ. Microbiol. - 2008. - V. 74. -P. 5524-5532.

5. Use of colony-based bacterial strain typing for tracking the fate of Lactobacillus strains dur-

ing human consumption / E .Mahenthiralingam [et al.] // BMC Micribiology. - 2009. - Mode of access: http://www.biomedcentral.com/1471-2180/9/251.

6. Weisburg, W.G. 16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study / W.G. Weisburg, S.M. Barns, D.A. Pelletier // J. Bacteriol. -1991. - V. 173. - P. 697-703.

7. Reed, D.L. Phylogenetic analysis of bacterial communities associated with ectoparasitic chewing lice of pocket gophers: a culture-independent approach / D.L. Reed, M.S. Hafner // Microbial Ecol. - 2002. - V. 44. - P. 78-93.

8. Versalovic, J. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes / J. Ver-salovic, T. Koeuth, J.R. Lupski // Nucl. Acids Res. - 1991. - V.19. - P. 6823-6831.

9. Koeuth, T. Differential subsequence conservation of interspersed repetitive Streptococ-

cus pneumaniae BOX elements in diverse bacteria / T. Koeuth, J. Versalovic, J.R. Lupski // Genome Res. - 1995. - V. 5. - P. 408-418.

10. Genetic relationship in the «Bacillus cereus group» by rep-PCR fingerprinting and sequencing of Bacillus anthracis-specific rep-PCR fragment / A. Cherif [et al] // Appl. Microbiol. -2003. - V. 94. - P. 1108-1119.

11. Xu, D. Sequence diversity of Bacillus thuringiensis and B. cereus sensu lato flagellin (H antigen) protein: comparison with H serotype diversity / D. Xu, J.-C. Côte // Appl. and Envi-ronm. Microbiol. - 2006 - V. 72 - P. 4653-4662.

12. Бажанов, Д.П. Исследование плазмид-ной ДНК: учебно-методические рекомен-

дации к практическим занятиям по курсу «Молекулярная эпидемиология». - Минск: МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2002. - 20 с.

13. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. / J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis / Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Publications, NY. - 1989. - 468 p.

14. Saitou, N. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees / N. Saitou, M. Nei // Mol. Biol. Evol. -1987. - V. 4. - P. 406-425.

15. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 / K. Tamura [et al.] // Mol. Biol. Evol. - 2007. -V. 24. - P. 1596-1599.

Дата поступления статьи 26 июня 2013 г.