CC BY
133
УДК 632.951:579.852.11
Аспирант М.Е. БЕЛОУСОВА (ФГБНУ ВНИИСХМ coryphella@arriam.spb.ru) Канд. биол. наук Т.В. ДОЛЖЕНКО (СПбГАУ, dolzhenkotv@mail.ru)
ВОЗМОЖНОСТЬ КРИСТАЛЛООБРАЗОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫМИ ШТАММАМИ
BACILLUS THURINGIENSIS
Bacillus thuringiensis (Bt) Berliner - грамположительная, палочковидная, почвенная, спорообразующая бактерия, относящаяся к группе Bacillus cereus или B. cereus sensu лато (Bcg). На момент написания статьи в состав Bcg входит 8 видов близкородственных р. Bacillus, включая виды медицинского значения (рвотный токсин B. cereus), экономического значения (биологические инсектициды на основе B. thuringiensis) и потенциально опасные для человека (вирулентные плазмиды B. anthracis). Пять новых видов были введены в группу недавно: B. cytotoxicus, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. toyonensis и B. weihenstephanensis [1]. Бактерии Bcg имеют сходные хромосомные геномы и вариабельные внехромосомные элементы [2]. Ввиду генетической близости представителей группы зачастую их сложно отличить друг от друга морфологически и фенотипически.
Вместе с тем у Bt есть отличительная особенность - способность производить белковые кристаллические 5-эндотоксины на стадии споруляции. Благодаря этим токсинам, обладающим инсектицидными свойствами, Bt становится широко распространенным и эффективным агентом защиты растений. За всю историю применения Bt в биологической защите зарегистрировано свыше 400 препаратов на основе этой бактерии и в настоящее время на долю рынка биопестицидов приходится 60% препаратов, в основе которых лежит Bt [2].
Следует уточнить, что за образование кристалла отвечают гены cry, которые находятся на плазмидах, и, следовательно, могут быть утеряны вместе с плазмидами в процессе горизонтального переноса [3].
Белковый кристалл может быть разной формы (округлой, бипирамидальной, в виде плоских квадратов) и при правильном окрашивании можно различить форму кристалла, просматривая микробиологические мазки через световой микроскоп. В некоторых публикациях высказывалось мнение о зависимости спектра действия подвида Bt от формы его кристалла [4]. Так, округлые кристаллы Bt subsp. israelensis активны против личинок кровососущих двукрылых, подвиды с бипирамидальными кристаллами действуют в отношении личинок чешуекрылых, а квадратные кристаллы Bt subsp. tenebrionis (morrisoni) могут применяться против личинок жесткокрылых насекомых.
Независимо от своей формы, кристалл представляет собой неактивные протоксины, которым необходимо попасть в кишечник хозяина для начала патогенеза. Растворяясь в щелочной среде средней кишки насекомого, а затем претерпевая протеолитическое расщепление протеазами хозяина, протоксины становятся активными и связываются со специфическими рецепторами микровиллий эпителия кишечника. Связывание с клеточной мембраной необратимо, и приводит к образованию пор, лизису эпителиальных клеток, и, как следствие, разрушению кишечника [4].
Цель исследования - изучить коллекцию из 31 штамма бактерий группы B. cereus с использованием подобранной техники окрашивания кристаллических включений. Также мы попытались соотнести полученные данные с имеющимися представлениями о связи формы кристалла с его спектром действия, и показать возможность потери кристалла кристаллогенными штаммами Bt.
Материалы, методы и объекты исследования. Работа была выполнена в рамках программы студенческого обмена Erasmus Mundus в Биоцентре Шведского Аграрного Университета в г. Уппсала в 2016-2017гг. Коллекция штаммов группы Bacillus cereus была
получена на кафедре экологии Орхусского университета (Роскилле, Дания). Коллекция содержалась на агаризованной Т3 среде в плотно закрытых пробирках (на литр: 3 г триптона, 2 г триптозы, 1.5 г дрожжевого экстракта, 6,9 г NaH2PÜ4 x H2O, 0,008g MnCl2 x 4H2O, и 15 г агара после проверки pH) при температуре 4°С. Перед проведением микроскопии бактерии выращивали на свежеприготовленной среде в чашках Петри при температуре 29°С. На 1, 3 и 7 день роста готовили микропрепараты с использованием красителя Coomassie Blue (0.133% Coomassie Blue, растворенного в 50% уксусной кислоте). Затем препараты тщательно промывали дистиллированной водой, подсушивали и просматривали через микроскоп с увеличением в 1000 раз.
Результаты исследования. Был проанализирован 31 штамм из коллекции бактерий группы Bacillus cereus, включая 23 штамма Bt (21 подвид этой бактерии), по одному штамму B. mycoides, B. pseudomycoides и B. weihenstephanensis и 5 штаммов B. cereus (табл. 1). Большая часть подвидов Bt имела кристаллы бипирамидальной формы с разным размером и соотношением длин осей. Ромбовидные кристаллы размером больше споры, с длиной осей 2,4-2 мкм, были обозначены как большие. Кристаллы размером со спору и длиной осей 1,60,8 мкм обозначены как средние, а кристаллы с длинами осей 0,8-0,5 мкм - мелкие (рис. 1). Длина спор изучаемых нами штаммов была в пределах 1,4-1,7 мкм, что согласуется с данными других исследователей [5].
Отличительной особенностью Bt при сравнении с другими представителями группы Bcg является наличие параспорального кристаллического белкового образования. Однако отсутствие такого образования не может свидетельствовать о том, что рассматриваемый штамм не относится к Bt [2]. В изучаемой нами коллекции все представители Bacillus cereus, Bacillus pseudomycoides, Bacillus mycoides, Bacillus weihenstephanensis, ожидаемо, не имели кристаллического белкового образования. Споруляция у этих видов начиналась на 1 -2 день наблюдений, и при просмотре микропрепаратов бактериальной культуры на 5-7 день инкубации в микробиологическом мазке были только споры. Шесть штаммов, относящихся к разным подвидам Bt (Bt subsp. alesti, Bt subsp. canadensis, Bt subsp. оstriniae, Bt subsp. tolworthi, Bt subsp. kyushuensis, Bt subsp. kenyae) также имели только споры при просмотре через световой микроскоп. В литературе есть данные о наличии кристаллов у этих подвидов [2, 6]. Bt subsp. kenyae имеет типичный бипирамидальный кристалл и активен против личинок чешуекрылых. Описаны кристаллы и обнаружены кодирующие их гены у Bt subsp. alesti и у Bt subsp. canadensis. Подвиды Bt subsp. оstriniae, Bt subsp. tolworthi, Bt subsp. kyushuensis также имеют кристалл и активны в отношении чешуекрылых личинок. Варианты Bt, просматриваемые нами и не имеющие кристалл, по-видимому, потеряли в процессе хранения и культивации плазмиду, содержащую гены протоксинов. Как известно, cry-гены локализуются на плазмиде, и она может быть утеряна в процессе горизонтального переноса [3]. На некоторых микропрепаратах акристаллогенных штаммов были обнаружены кристаллоподобные образования, однако в очень незначительном количестве (одно кристаллоподобное образование на 100 и более спор). В литературе были отмечены случаи отсутствия и наличия разных по размеру кристаллов у представителей Bt subsp. galleriae и Bt subsp. yunnanensis [6]. Можно сделать предположение, что акристаллогенные (включая варианты с очень малой продукцией кристаллов) не будут иметь инсектицидного эффекта на целевые объекты, ввиду отсутствия основного компонента инсектицидного действия.
Таблица 1. Микроскопия видов группы Bacillus cereus
Вид Штамм Описание морфологии кристалла
Bacillus thuringiensis
Bt subsp. aizawai HD 112, Bt616 Ромбовидные, по размеру есть мелкие, средние, большие
Bt subsp. dakotai HD932, Bt18 Мелкие ромбовидные и мелкие неопределенной формы кристаллы
Bt subsp. israelensis 4Q2-72, Bt 154 Правильная округлая форма, диаметр - 1,2 мкм
Bt subsp. israelensis AM65-52, Bt 1253 Правильная округлая форма, диаметр - 1,2 мкм, встречаются округлые кристаллы с неровными краями
Bt subsp. sotto HD 770, Bt5 Вытянутые ромбовидные кристаллы среднего и мелкого размера
Bt subsp. darmstadiensis HD146, Bt 12 Мелкие и среднего размера ромбовидные кристаллы, ромбовидные кристаллы со сглаженными углами.
Bt subsp. thuringiensis HD 2, Bt 82 Ромбовидные кристаллы среднего и мелкого размера
Bt subsp. thuringiensis HD 22 Округлые и овальные кристаллы по размеру меньше споры
Bt subsp. kurstaki HD1, Bt144 Крупные и среднего размера бипирамидальные кристаллы с четкими гранями и углами
Bt subsp. finitimus HD 3 Кристаллы округлой и овальной формы, диаметром 0,7-1 мкм, большинство ассоциировано со спорой
Bt subsp. alesti HD4 Акристаллогенный вариант, или низкая кристаллогенность (встречается 1 кристалловидное образование на 100 спор)
Bt subsp. dendrolimus HD7 Вытянутые ромбовидные кристаллы (2,4х0,8 мкм)
Bt subsp. galleriae HD29 Бипирамидальная форма, встречаются кристаллы со сглаженными углами, размер средний и крупный
Bt subsp. canadensis HD224 Акристаллогенный вариант
Bt subsp. entomocidus HD 110 Крупные, средние и мелкие ромбовидные кристаллы, встречаются с четкими и со сглаженными углами
Bt subsp. оstriniae HD 501 Акристаллогенный вариант, или вариант с низкой кристаллогенностью (1 кристаллоподобное образовнаие на 100 спор)
Bt subsp. tolworthi HD 537 Акристаллогенный вариант
Bt subsp. toumanoffi HD 201 Вытянутые бипирамидальные кристаллы, размером со спору
Bt subsp. kyushuensis HD 541 Акристаллогенный вариант
Bt subsp. thompsoni HD 542 Кристаллы неправильной сердцевидной формы, диаметр 0,9 мкм
Bt subsp. tochigiensis HD 868 Округлые, диаметром 0,8 мкм или слегка овальные кристаллы. Встречаются как ассоциированные со спорой, так и свободные
Bt subsp. colmeri HD 847 Овальные или ромбовидные с сильно сглаженными углами, среднего размера
Bt subsp. kenyae HD 136 Акристаллогенный вариант
g 3 м км » * « 0 # » # - • - Ос 1 » " » и т % k A * • 5мкм b . * ' —
1.s vTnri if» Il'"1* . f. ^ « 4,5 мкгл L * ' - «л ^ • о • - • о v5R* • . « * ___~ » (J * 4,5 м™ • ^ -
; * '* " ' - л 9 . . • 1 . ¥ » » * • * * * » » * i Vf ï 1 * у . » , ■ * е . ' »51ИКМ 1 » ¡Г ^ tî ® в ь Г CPft Çi^o^ ° _ Гл й .Ь ол? V, v? 4 ( о f 5 м км
Рис.1. Фотографии штаммов Bcg.
A. Bt subsp. darmstadiensis, вегетативные клетки на стадии споруляции, свободные споры и бипирамидальные
кристаллы; В. Bt subsp. entomocidus, свободные споры и ромбовидные кристаллы; С. Bt subsp. fmitimus, свободные споры и округлые кристаллы, часто ассоциированные со спорами; D. Bt subsp. israelensis, свободные споры и округлые кристаллы; E. Bt subsp. kurstaki свободные споры и кристаллы бипирамидальной формы; F. Акристаллогенный Bt subsp. alesti, только споры свободные
Штаммы Bt subsp. aizawai HD 112, Bt subsp. dakotai HD932, Bt subsp. sotto HD 770, Bt subsp. darmstadiensis HD146, Bt subsp. thuringiensis HD 2, Bt subsp. kurstaki HD1, Bt subsp. dendrolimus HD7, Bt subsp. galleriae HD29, Bt subsp. entomocidus HD 110, Bt subsp. toumanoffi HD 201 имели бипирамидальные кристаллы. Бипирамидальная форма кристаллов часто связывается с Cryl токсинами, активными в отношении чешуекрылых. Действительно, большинство из этих подвидов (aizawai, entomocidus. galleriae, thuringiensis, kurstaki. dendrolimus) несут Cry 1 гены, а упаковка протоксинов в кристалл зависит от их конфигурации. Однако, помимо этого, на форму кристалла влияют другие компоненты, характерные для Bt и также бипирамидальная форма кристалла может быть обнаружена у штаммов, не несущих Cry1. Bt subsp. thompsoni из нашего исследования имеет сердцевидную форму кристаллов, хотя по данным литературы несет Cryl гены. Штамм Bt subsp. thuringiensis HD 22 продуцировал овальные и округлые кристаллы, в то время как штамм HD 2 обладал классическими для subsp. thuringiensis бипирамидальными кристаллами с четкими гранями. В литературе также встречается информация о штамме subsp. thuringiensis, продуцирующем нетипичные кристаллы кубической формы.
Согласно исследованиям А.В. Мокеевой (2008), штаммы subsp. israelensis могут нести кристаллы разные по размеру. В нашем исследовании было 2 штамма israelensis, и их кристаллы были одинакового размера (1,2 мкм в диаметре) ровной округлой формы и округлой формы со слегка неровными краями.
Также были отмечены кристаллы, ассоциированные со спорой для Bt subsp. finitimus и Bt subsp. tochigiensis. В этом случае на завершающем этапе наблюдений за ростом культуры, после того как в бактериальной массе не остается вегетативных клеток, а только споры и кристаллы, ассоциированные кристаллы находятся в контакте со спорой и не отсоединяются.
В 80-х гг. ХХ в. в обозначение Bt-токсинов была заложена информация о группе насекомых, в отношении которой они активны. Cry I - токсины активны в отношении чешуекрылых, CryII - действуют на чешуекрылых и двукрылых, Cry III - против жесткокрылых и CrylV - исключительно против двукрылых. Однако с ростом списка организмов, в отношении которых активны токсины Bt, с открытием все большего количесва токсинов этой бактерии, стала актуальна другая классификация токсинов, включающая 4-компонентное название, которое содержит информацию о степени идентичности аминокислот с каждым предществующим токсином. На данный момент к 5-эндотоксинам Bt относятся Cyt-токсины (с 1 по 3) и Cry- токсины (с 1 по 74). Огромное разнообразие токсинов оставляет в прошлом возможность прогнозировать спектр действия какого-либо подвида Bt по форме его кристалла. Вклад в спектр действия штамма могут вносить разные типы токсина, например для Lepidoptera это Cry1A-K, Cry2A, Cry7B, Cry8D, Cry9A-C,E, Cry15A, Cry22A, Cry32A, Cry51A токсины, и форма кристаллического образования будет определяться их комплектацией и нектороми другими факторами [7].
Выводы. По результатам исследования коллекции штаммов Bt было установленно, что каждый отдельный вариант может продуцировать кристаллы разного размера и формы. В пределах одного подвида Bt у разных штаммов могут быть обнаружены кристаллы разные по форме и размеру, а также кристаллогенные и акристаллогенные варианты. Все перечисленное необходимо учитывать при подборе штаммов с инсектицидной активностью.
Литература
1. Venkateswaran K., Singh N.K., Checinska Sielaff A., and others. Non-Toxin-Producing Bacillus cereus Strains Belonging to the B. anthracis Clade Isolated from the International Space Station. // mSystems. - 2017. - № 2(3). - Р: e00021-17. doi: 10.1128/ mSystems.00021-17.
2. Risks for public health related to the presence of Bacillus cereus and other Bacillus spp. including Bacillus thuringiensis in foodstuffs // EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). -2016. doi: 10.2903/j.efsa.2016.4524
3. Schneider S., Hendriksen N.B., Melin P., and others. Chromosome-directed PCR-based detection and quantification of Bacillus cereus group members with focus on B. thuringiensis serovarisraelensis active against Nematoceran larvae// Appl. Environ. Microbiol. - №81. - 2015. - p. 4894-4903.
4. Штерншис М.В. Биопрепараты на основе бактерий рода Bacillus для управления здоровьем растений / Новосибирский государственный аграрный университет -Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2016. - 233 с.
5. Carrera M., Zandomeni R.O., Fitzgibbon J., Sagripanti J.L. Difference between the spore sizes of Bacillus anthracis and other Bacillus species // J Appl Microbiol. - 2007. - № 102(2). -Р. 303-12.
6. Мокеева А.В., Орешкова С.Ф., Калмыкова Г.В., и др. Молекулярное типирование штаммов бактерии Bacillus thuringiensis с помощью RAPD-анализа // Биотехнология. -2008. - №3. - С. 40-47.
7. Crickmore N., Zeigler D.R., Schnepf E., and others. Bacillus thuringiensis toxin nomenclature// Available online: http://www.lifescisussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/ (accessed on 08.2017).
Literatura
1. Venkateswaran K., Singh N.K., Checinska Sielaff A., and others. Non-Toxin-Producing Bacillus cereus Strains Belonging to the B. anthracis Clade Isolated from the International Space Station. // mSystems. - 2017. - № 2(3). - P: e00021-17. doi: 10.1128/mSystems.00021-17.
2. Risks for public health related to the presence of Bacillus cereus and other Bacillus spp. including Bacillus thuringiensis in foodstuffs // EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). -2016. doi: 10.2903/j.efsa.2016.4524
3. Schneider S., Hendriksen N.B., Melin P., and others. Chromosome-directed PCR-based detection and quantification of Bacillus cereus group members with focus on B. thuringiensis serovarisraelensis active against Nematoceran larvae// Appl. Environ. Microbiol. №81. - 2015. -P. 4894-4903.
4. Shternshis M.V. Biokhimicheskiye veshchestva, osnovannyye na bakteriyakh roda Bacillus dlya upravleniya zdorov'yem rasteniy / Min-vo sel'skogo khoz-va RF, Novosibirskiy gosudarstvennyy agrarnyy universitet. Novosibirsk: Izd-vo SO RAN. - 2016. - 233 s.
5. Carrera M., Zandomeni R.O., Fitzgibbon J., Sagripanti J.L. Difference between the spore sizes of Bacillus anthracis and other Bacillus species // J Appl Microbiol. - 2007. - № 102(2). -P. 303-12.
6. Mokeyeva A.V., Oreshkova S.F., Kalmykova G.V., i dr. Molekulyarnoye tipirovaniye shtammov bakterii Bacillus thuringiensis s pomoshch'yu RAPD-analiza // Biotekhnologiya. -2008. - №3. - S. 40-47.
7. Crickmore N., Zeigler D.R., Schnepf E., and others. Bacillus thuringiensis toxin nomenclature// Available online: http://www.lifescisussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/ Bt/ (accessed on 08.2017).
УДК 632.95.02
Соискатель Н.Г. ПЕТРОВА
(ФГБНУ ВИЗР, sacura0@yandex.ru) Доктор ист. наук Н.М. НАРЫКОВА (СПбГАУ, Narykova@yandex.ru)
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНФОРМАЦИОННЫХ РЕСУРСОВ ФАО ООН В ИССЛЕДОВАНИЯХ ПО ЗАЩИТЕ РАСТЕНИЙ
Роль Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (ФАО ООН) в системе глобального управления продовольственной безопасностью возрастает, чему способствует огромная информационная работа организации [1]. Созданная ещё в 1945 г. эта международная организация одним из главных направлений своей деятельности реализует сегодня комплекс задач управления специальной отраслевой информацией - сбор, анализ и распространение информации. Эту информацию широко используют специалисты в области сельского хозяйства, а также специалисты, разрабатывающие стратегии развития мирового агропромышленного комплекса [2]. Серии аналитических докладов, выходящих с определённой периодичностью, и тематические электронные ресурсы ФАО (система АОЫБ) служат глобальной базой сведений о состоянии АПК в разных странах, а также глобальным набором технических знаний в сельскохозяйственной области. При разработке международных политических документов руководство ФАО и её члены - правительства большинства стран мира, а также международные организации опираются на современные и передовые научные достижения во всех отраслях сельского хозяйства.
Цель исследования - показать опыт сотрудников Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» (ФГБНУ ВИЗР), так как он наглядно показывает возросшие возможности
