Антигенные свойства бактерий вида Bacillus thuringiensis и их использование в дифференциации этих бактерий Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

© ТАЛАЛАЕВА Г.Б. - 2010

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUSTHURINGIENSIS И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

В ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЭТИХ БАКТЕРИЙ

Г.Б. Талалаева

(Иркутский государственный университет, ректор - д.х.н., проф. А.И. Смирнов, кафедра микробиологии, зав. - д.б.н., проф. Б.Н. Огарков)

Резюме. Проведены сравнительные исследования Н- и О-антигенов бактерий вида Bacillus thuringiensis. Установлена высокая специфичность О-антигена энтомопатогенных кристаллообразующих бактерий в сравнении с их Н-антигеном. Проведенные исследования позволили выявить четкие различия свойств соматического антигена между Bac. thuringiensis и Bac. cereus при совпадении у этих двух видов морфокультуральных и физиологобиохимических признаков.

Ключевые слова: Bac. thuringiensis, Н- и О-антигены.

ANTIGENIC CHARACTERISTICS OF BACTERIA BACILLUS THURINGIENSIS AND THEIR APPLICATION

IN BACTERIA'S DIFFERENTIATION

G.B. Talalajeva (Irkutsk State University, Irkutsk)

Summary. The comparative researches of H-and O-antigens of bacteria of species Bacillus thuringiensis have been conducted. The researches established high specificity of O-antigen of entomopatogenic graining bacteria in comparison with their H-antigen. The conducted studies allowed to reveal the clear differences of properties of somatic antigen between Bac. thuringiensis and Bac. cereus in coincidence of morphocultural and physiologic-biochemical features in these two species.

Key words: Bac. thuringiensis, Н- antigen, О- antigen.

Кристаллообразующие бактерии являются промышленными продуцентами энтомопатогенных препаратов, используемых в защите растений от насекомых вредителей.

В 60-80 гг. прошлого столетия эти препараты успешно заменяли ядохимикаты в защите растений, среди которых преобладали хлор- и фосфорорганические пестициды. И те, и другие вызывают различные патологические изменения в организме человека, например, хлорофос, обладает канцерогенным и эмбриотропным действием. Практическое использование энтомопатогенных бактериальных препаратов, продуцентами которых являются энтомопатогенные бактерии Bac. thuringiensis, доказало их безопасность для здоровья человека.

В 1911-1915 гг. Э. Берлинер выделил из погибших гусениц мельничной огневки на мукомольной фабрике в Тюрингии бактерию, вызвавшую массовую гибель огневки, и сделал относительно подробное описание ее морфокультуральных и физиологических особенностей, закрепив тем самым за собой приоритет первого исследования свойств энтомопатогенных бактерий.

Следующий период, вплоть до начала 50-х годов ХХ века, был этапом выявления разными авторами из природных источников аналогичных бактерий и создания коллекции штаммов. В это же время обнаружен один из ключевых признаков этих бактерий - способность образовывать внутриклеточные кристаллообразные включения, обладающие для некоторых видов насекомых токсическими свойствами. В патогенезе заболевания, вызываемого кристаллообразующими энтомопа-тогенными бактериями, имеет место преемственность двух процессов: токсического и септического. Первые исследования и публикации по данному вопросу сделаны A.M. Хеймпелом и T.A. Ангусом. Но, несмотря на открытие и описание указанного ключевого признака (образование эндотоксигенных кристаллов), данные бактерии считались в большей степени идентичными известной спорообразующей бактерии Bac. cereus. Далеко не все специалисты в этой области были согласны с таким утверждением. И, очевидно, несогласие и привело к компромиссному предложению выделить в систематике споробразующих бактерий группу энтомопатогенных бактерий cereus-thuringiensis. Второй эпитет «thuringiensis» взят из названия вида энтомопатогенной бактерии (Bac. thuringiensis), изученной Э. Берлинером. Эта условная группа cereus-thuringiensis энтомопатоген-

ных бактерий не имела ранга таксона [2]. Этап с 60-х годов прошлого столетия и по настоящее время, можно считать периодом продолжающегося накопления коллекционного материала - штаммов энтомопатогенных бактерий и описанием их функциональных особенностей. За этот период было предложено несколько классификаций, схем, ключей по дифференциации кристаллообразующих энтомопатогенных бактерий. Появилось понятие «бактерии вида Bacillus thuringiensis Berliner», в котором отражены и приоритет Э. Берлинера, давшего наименование вида по описанному им типовому штамму этих бактерий, а также их уникальность по физиологическим свойствам. Наибольшее признание получили классификации, предложенные французскими исследователями H. De Barjac, A. Bonnefoi, E. Frachon [4,5,6]. В основе этих классификаций лежит внутривидовая дифференциация Bac. thuringiensis по различающимся совокупностям биохимических и антигенных свойств.

При идентификации новых штаммов кристаллообразующих энтомопатогенных бактерий мы используем дифференциальные ключи, дендрограммы, составленные специально для этих бактерий [5,6]. Новым в познании этих бактерий является определение свойств их соматического антигена [1,2,3]. Целью работы явились сравнительные исследования Н- и О-антигенов бактерий вида Bacillus thuringiensis.

Материалы и методы

Для получения диагностических сывороток использовались типовые штаммы бактерий вида Bac. thuringiensis (табл. 1). Маточные культуры типовых штаммов пересевали в пробирки на скошенный мясо-пептонный агар (МПА), двух-трехкратно пассировали в U-образных трубках в полужидком МПА (агар-агара -

0,2%) в течение 18 часов с последующим пересевом культуры в пробирки с мясо-пептонным бульоном (МПБ) и культивированием материала при 28-30оС. Через 24 часа 1 мл бульонной культуры высевали на МПА в чашку Петри. Выращивание посевов производили при таком же температурном режиме; 18-24-часовые культуры смывали с поверхности МПА физиологическим раствором. Титр клеток в рабочей суспензии составлял 2 млрд/мл. Часть суспензии использовали как Н-антиген. В этом случае в качестве консерванта в суспензию добавляли формалин в количестве 0,05%. Другую часть су-

Таблица 1

Типовые штаммы бактерий вида Bac. thuringiensis

№№ штам- мов Биохимический вариант №№ штам- мов Биохимический вариант №№ штам- мов Биохимический вариант

1 berliner 8 galleriae 15 darmstadiensis

2 frnitimus 9 canadensis 16 caucasicus

3 alesti 10 subtoxicus 17 toumanoffi

4 kurstaki 11 entomocidus 18 thompsoni

5 sotto 12 aizawai 19 pakistani

6 dendrolimus 13 morrisoni 20 israelensis

7 kenyae 14 tolworthi

спензии использовали для приготовления О-антигена. Приготовление данного антигена связано с 2-х часовым прогреванием клеточной суспензии в стерильных пробирках в кипящей водяной бане. Применение данного способа приводит к разрушению термолабильных компонентов бактериальной клетки, в частности, жгутиков.

Таблица 2

Схема введения антигена

Дни инъекций Дозы (мл), введенные

внутривенно подкожно

Первый - 0,5

Четвертый 0,5 -

Седьмой 0,5 0,5

Одиннадцатый 0,8 0,8

Пятнадцатый 1,0 1,0

Девятнадцатый 1,5 1,5

Двадцать третий 2,0 2,0

Полученный таким образом О-антиген представляет собой термостабильный клеточный компонент, в отличие от Н-антигена. Приготовленные антигены хранились в холодильнике при температуре +3оС в течение месяца.

Для иммунизации отбирались здоровые кролики, первоначальный вес которых равен 2,5-3 кг.

20 особей использовали для гипериммунизации Н-антигеном, а другие 20 особей - для гипериммунизации О-антигеном. Применялась схема комбинированного введения антигенов: половина доз Н- и О-антигенов вводилась внутривенно в краевую вену уха животного, другая часть дозы - подкожно в бедро кролика. Интервал между инъекциями составлял 3-4 дня (табл. 2).

Если учесть, что титр клеток в используемых суспензиях равнялся 2 млрд. в 1 мл физиологического раствора, то общее количество введенных животному бактерий в течение всего цикла гипериммунизации составляло 25 млрд.

Через 7 и 14 дней после последней инъекции производился забор крови из вены уха в количестве 30-40 мл. Кровь, собранную в стерильные пробирки, помещали на 20-30 мин в термостат при 37оС и затем в холодильник на 24 часа при 5оС с последующим отделением сыворотки в отдельные стерильные емкости. В качестве консервантов в полученные Н- и О-сыворотки добавляли или хинозол, или борную кислоту в количестве 0,05%. Полученные сыворотки хранили в холодильнике при 3оС.

В исследовании использованы экспериментальные животные (кролики), все манипуляции выполнялись с соблюдением принципов гуманности, и «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755). В результате исследований ни одно лабораторное животное

не пострадало.

Для определения титра антител в сыворотках ставились реакции агглютинации (РА) при взаимодействии антигенов с антителами в растворе электролита в объемном варианте, в пробирках. За титр антител в сыворотке принималось ее конечное разведение, в котором наблюдалась отчетливая агглютинация соответствующего антигена. Было установлено, что максимальные разведения полученных нами Н- и О-сывороток составили соответственно 1:25600 и 1:800.

Для определения сравнительных свойств Н- и О-антигенов бактерий вида Bac. thuringiensis проводилась перекрестная сероагглю-тинация: каждая из 20-ти сывороток, полученных к Н-антигену типового штамма соответствующего биоварианта Bac. thuringiensis, использовалась в постановке РА с Н-антигенами 20-ти других биовариантов данного вида (отдельно в каждом случае).

По аналогичной схеме нами определены свойства 20-ти полученных О-сывороток и О-антигенов Bac. thuringiensis. Антигенные свойства бактерий вида Bac. thuringiensis сравнивались с антигенными свойствами Bac. cereus.

Результаты и обсуждение

Кристаллообразующие энтомопатогенные бактерии, относящиеся к виду Bac. thuringiensis, различаются по ряду биохимических признаков: образованию ацетил-метилкарбинола, лецитиназы, протеазы, амилазы, пигмента, алкогольдегидрогеназы, способности ферментировать сахарозу, маннозу, эскулин, салицин и другим признакам. Различия по данным признакам отражены в биохимических вариантах [4,5,6].

H. De Barjac, A. Bonnefoi [4,5] установили, что ряд указанных биовариантов различаются между собой и

Таблица 3

Дифференциация бактерий вида Bac. thuringiensis по свойствам Н- и О-антигенов

№№ пп Биохимический вариант Н- антиген О- антиген Серологический вариант (антигенная формула)

1 berliner 1 1 НА

2 frnitimus 2 2 Н2О2

3 alesti 3а 3 НзаОз

4 kurstaki 3а3в 4 Нза3вО4

5 sotto 4а4в 5 Н4а4вО5

6 dendrolimus 4а4в 6 Н4а4вО6

7 kenyae 4а4с 7 Н4а4сО7

8 galleriae 5а5в 8 Н5а5вО8

9 canadensis 5а5с 9 Н5а5сО9

10 subtoxicus 6 10 Н6°,0

11 entomocidus 6 11 НбО„

12 aizawai 7 12 ^О,2

13 morrisoni 8 13 ^О,з

14 tolworthi 9 14 Н9°,4

15 darmstadiensis 10 15 Н,оО,5

16 caucasicus 10 16 Н10О!6

17 toumanoffi 11 17 Н11О17

18 thompsoni 12 18 Н12О!8

19 pakistani 13 19 Н13О19

20 israelensis 14 20 Н14О20

по свойствам H-антигена (табл. 3). Вместе с тем, в некоторых случаях H-антиген не является высоко специфичным (варианты alesti, kurstaki, sotto, dendrolimus, kenyae, galleriae, canadensis, subtoxicus, entomocidus, darmstadiensis, caucasicus).

Результаты наших исследований свидетельствуют, что биоварианты, относящиеся по свойствам H-антигена к 3, 4, 5, 6 и 10 серовариантам, обладают специфическими О-антигенами, а это очень важно при использовании антигенных свойств в дифференциации и идентификации кристаллообразующих бактерий вида Bac. thuringiensis.

Мы предлагаем в наименовании этих бактерий, наряду с названием биоварианта, приводить и их полную антигенную формулу, в которой отражены свойства H-и О-антигенов.

Примеры полных наименований кристаллообразующих энтомопатогенных бактерий:

1. Bac. thuringiensis, biovar berliner, serovar H^

2. Bac. thuringiensis, biovar dendrolimus, serovar

^40,6

3. Bac. thuringiensis, biovar sotto, serovar H4 4вО5

Проведенные нами исследования физиологобиохимических, антигенных, морфокультуральных свойств штаммов бактерий, относящихся к двум видам

- Bac. cereus и Bac. thuringiensis, а также штаммов, утративших способность образовывать кристаллы эндотоксина, и выделенных из популяций Bac. thuringiensis, позволили выявить четкие различия свойств соматического антигена между Bac. cereus и Bac. thuringiensis при совпадении у этих двух видов морфокультуральных и физиолого-биохимических признаков.

ЛИТЕРАТУРА

1. Талалаева Г.Б., Покровская Л.А. О-антиген бактерий вида Bac. thuringiensis // Селекция микроорганизмов. -Иркутск, 1978. - С.113-122.

2. Талалаева Г.Б. Принципы и методические подходы в классификации и идентификации энтомопатогенных кристаллообразующих бактерий // Бюлл. Восточно-Сибирского научного центра. - Иркутск, 2003. - № 7. - С.95-97.

3. Чемерилова В.И., Секерина О.А., Талалаева Г.Б. Анализ морфологических вариантов, возникающих при S^R диссо-

циации у Bacillus thuringiensis II Микробиология. - 2007. - T. 76. №4. - С.507-514.

4. Barjac H., Bonnefoi A. A classification of strain of Bacillus thuringiensis Berliner with a key to their differentiiation II Invert Pathol. - 1968. - Vol. 11, №9. - P.333-348.

5. Barjac H., Bonnefoi A. Misse au point sur la classification des Bacillus thuringiensis II Entomophaga. - 1973. - Vol. 18. №1.

- P.5-17.

6. Barjac H., Frachon E. Classification of strain of Bacillus thuringiensis II Entomophaga. - 1990. - Vol. 35. №2. - P.233-240.

Информация об авторе: 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, тел. (3952) 24-18-70 (добав. 104), e-mail: nadin_buk@mail.ru

Талалаева Галина Борисовна - доцент, к.б.н.

© ФИЛАТОВ В.В., ТЕЛЯТНИКОВА Л.И., ДОЛГИХ В.Т. - 2010

АРГОННО-ПЛАЗМЕННАЯ КОАГУЛЯЦИЯ КАК АЛЬТЕРНАТИВА ОПЕРАТИВНОМУ ВМЕШАТЕЛЬСТВУ

В.В. Филатов1, Л.И. Телятникова1, В.Т. Долгих1'2 ('МУЗ ГК «Больница скорой медицинской помощи №1», гл. врач - д.м.н., проф. С.И. Филиппов;

2Омская государственная медицинская академия, ректор - д.м.н., проф. А.И. Новиков, кафедра патофизиологии с курсом клинической патофизиологии, зав. - д.м.н., проф. В.Т. Долгих)

Резюме. Обследовано и пролечено 39 больных с кровоточащими язвами желудка и двенадцатиперстной кишки. Установлено, что аргонно-плазменная коагуляция в 85,7% случаев уже после однократного сеанса позволяет достичь окончательного гемостаза. Отмечено, метод аргонно-плазменной коагуляции следует применять в течение первых 24-48 часов с момента поступления больного в стационар или при первой диагностической фиброгастро-дуоденоскопии.

Ключевые слова: язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, аргонно-плазменная коагуляция.

ARGON-PLASMATIC COAGULATION AS AN ALTERNATIVE TO OPERATIVE INTERVENTION

V.V. Filatov1, L.I. Telyatnikova1, V.T. Dolgikh1,2 ('Emergency Care Hospital № 1, 2Omsk State Medical Academy)

Summary. 39 patients with bleeding from peptic ulcers were examined and treated. It has been found that in 85,7% of the cases argon-plasmic coagulation enables to achieve terminal hemostasis just after a single-phase session. Argon-plasmatic coagulation method, as has been noted, should be used within the first 24-48 hours of admission to a hospital or during the first diagnostic fibrogastroduodenoscopy.

Key words: peptic ulcer, argon-plasmatic coagulation.

Язвенной болезнью (ЯБ) желудка и двенадцатиперстной кишки (ДПК) страдает 10-15% населения (в РФ это порядка 1,5 млн. человек) [2,10]. Язвенная болезнь в 13-21% случаев осложняется кровотечением [3,6]. Подозрение на желудочно-кишечные кровотечения является абсолютным показанием к госпитализации больного в стационар хирургического профиля [1,4,12]. В стационаре в неотложном порядке осуществляется диагностика источника кровотечения, динамическое наблюдение и при необходимости оперативное лечение [7]. Возможности эндоскопического воздействия расширяются с каждым годом. Задачами лечебной эндоскопии, помимо визуализации источника кровотечения, в настоящее время являются: остановка

продолжающегося кровотечения, профилактика рецидива, а также ускорение сроков эпителизации дефектов слизистой оболочки [5,9]. В помощь аппликационному методу воздействия на источник кровотечения, эффективному только в условиях состоявшегося кровотечения, пришла инъекционная методика. Она позволяет за счет инъекции в подслизистую оболочку склерозан-тов: гипертонического раствора с адреналином, эток-сисклерола, эпинефрина и др. осуществлять гемостаз в условиях продолжающегося кровотечения [13]. Эффект достигается за счет механического сдавления кровоточащего сосуда, местного сосудосуживающего действия, а также усиления тромбообразования. Окончательный гемостаз при этой методике удается достигнуть в 75-