CC BY
48
УДК 57.047:579.852.11
Ключевые слова: 5-эндотоксины B. thuringiensis, антибактериальное действие, условно-патогенные бактерии
Key words: 8-endotoxins of B. thuringiensis, antibacterial action, opportunistic pathogenic bacteria
Климентова Е. Г., Юдина Т. Г., Васильев Д. А., Феоктистова Н. А.
АНТИБИОТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВ ПАРАСПОРАЛЬНЫХ КРИСТАЛЛОВ BACILLUS THURINGIENSIS НА УСЛОВНО ПАТОГЕННЫЕ БАКТЕРИИ МИКРОБИОТЫ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА ЖИВОТНЫХ
ANTIBIOTIC ACTION OF PROTEINPARASPORAL CRYSTALS OF BACILLUS THURINGIENSIS ON OPPORTUNISTIC PATHOGENIC BACTERIA OF THE LARGE INTESTINE MICROBIOTA OF ANIMALS
'ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» / Адрес: 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42
'Ulyanovsk State University /Address: 432017, Russia, Ulyanovsk, L. Tolstoy street, 42
2МГУ им. М. В. Ломоносова Адрес: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ, д. 1, стр. 12, биологический факультет
2M. V. Lomonosov Moscow State University Address: 119991, Russia, Moscow, GSP-1, Leninskie Gory, Moscow State University, 1, building 12, Biological Dept. 3ФГОБУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П. А. Столыпина» / Адрес: 432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1 3P. A. Stolypin Ulyanovsk State Agricultural Academy /Address: 432017, Russia, Ulyanovsk, Novy Venets boulevard, 1
Климентова Елена Георгиевна, к. б. н., доцент1 / Klimentova Elena G., Ph.D., Assistant Professor' Юдина Татьяна Георгиевна, д. б. н., вед. научн. сотрудник2 Yudina Tatiana G., Doctor of Biological Sciences, Leading Researcher2 Васильев Дмитрий Аркадьевич, д. б. н., проф.3 / Vasilyev Dmitry A., Doctor of Biological Sciences, Professor3 Феоктистова Наталья Александровна, к. б. н., доцент3 / Feoktistova Natalia A., Ph.D., Assistant Professor3
Аннотация. Раствор белков параспоральных кристаллов (5-эндотоксинов) B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 оказывает антимикробное действие на некоторые бактерии, выделенные из микробиоты толстого кишечника белых мышей. Установлен бактерицидный и бактериостатический эффект 5-эндотоксинов B. thuringiensis в отношении энтеробактерий Esherichia coli, Salmonella spp., а также стафилококков - Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis.
Summary. The protein solution of parasporal crystals (8-endotoxin) B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 has an antimicrobic effect on some bacteria isolated from the large intestine microbiota of white mice. Bactericidal and bacteriostatic effect of 8-endotoxin B. thuringiensis against Enterobacteriaceae Esherichia coli, Salmonella spp., and Staphylococcus - Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis - was determined.
Введение
Известно, что белки параспоральных кристаллов энтомопатогенной бактерии В. thuringiensis (5-эндотоксины) проявляют высокоспецифичную активность против ряда насекомых, нематод, клещей и поэтому являются основным токсическим компонентом биопестицидов. В настоящее время гены ряда 5-эндотоксинов, прежде всего сгу-гены, встроены во многие сельскохозяйственные растения для защиты их от вредных насекомых, в связи с чем такие генетически модифицированные растения (ГМР или В^растения) синтезируют большие количества 5-эндотоксинов, что защищает их от вредителей, но в то же время способно оказывать негативное воздействие на раститель-
ноядных животных, а также на почвенную микробиоту [12].
Впервые об антибиотическом действии 5-эндотоксинов B. thuringiensis на прокариоты было сообщено в 80-х годах прошлого века [2]. Установлено, что белки параспоральных кристаллов B. thuringiensis subspp. thuringiensis, alesti, kurstaki, finitimus, galleriae, dendrolimus и других проявляют антибиотическую активность в отношении ряда архей, аэробных и анаэробных бактерий, в том числе термофильных, а также оказывают бактериоцинподобное действие на бактерии некоторых других подвидов B. thuringiensis [11]. Кроме большого числа исследований in vitro, показано и in vivo, что 5-эндотоксины B. thuringiensis оказывают
антибиотический эффект в организме животных - подавляют развитие клостридий -симбионтов в кишечнике личинок Tenebrio molitor [1].
Изучение биологической активности па-распоральных кристаллов B. thuringiensis в отношении микроорганизмов-симбионтов желудочно-кишечного тракта теплокровных животных и человека весьма актуально, так как компоненты биопрепаратов могут попадать в конечную продукцию и быть источником нежелательной дополнительной микробной обсемененности для животных и человека, а также могут влиять на микробиоценозы желудочно-кишечного тракта. Bt-растения способны оказывать негативное воздействие на растительноядных животных и на почвенную микробиоту, длительно сохраняясь в почве с растительными остатками, благодаря антимикробной активности синтезируемых ими больших количеств 5-эндотоксинов [12]. Так, показано, что растворы 5-эндотоксинов B. thuringiensis в достаточно высоких концентрациях (выше 50 мкг/мл) приводят к формированию дис-биотических изменений в кишечнике теплокровных животных [6]. Поэтому исследования, посвященные роли 5-эндотоксинов в этом процессе, весьма своевременны и актуальны. Одной из возможных причин, приводящих к изменениям в составе микрофлоры теплокровных животных, может быть непосредственное воздействие 5-эндотоксинов на микроорганизмы.
Целью данной работы явилось изучение антибиотического влияния 5-эндотоксинов B. thuringiensis на бактерии, являющиеся частью микробиоты белых мышей, выделенных из прямого отдела толстого кишечника.
Объекты и методы исследования
В работе был использован штамм Z-52 B. thuringiensis subsp. kurstaki, продуцирующий кристаллы 5-эндотоксинов классов Cry IA и Cry2, полученный из ФГУП Гос-НИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов.
Поверхностное культивирование осуществляли в термостатах при 27 °С в чашках Петри на агаризованной питательной
среде следующего состава (%): кукурузный экстракт - 0,7; глюкоза - 1; пептон - 0,5; NaCl - 0,2; MgSO4 - 0,01; NaH2PO4 - 0,3; K2HPO4 - 0,3; агар4агар - 15. рН = 7,2-7,5. Культуру высевали на полупроницаемую целлофановую пленку, помещенную на поверхность питательной среды. Через 3-4 суток культивирования, когда примерно в 80-90 % клеток образовались споры и кристаллы, параспоральные кристаллы 5-эндотоксинов отделяли от спор и отмывали от примесей водой и 1М NaCl. Смесь белков получали путем растворения отмытых кристаллов в 0,02н NaOH в течение 1 часа при перемешивании. Для активации протоксинов до активных токсинов с участием протеина-зы бактерии-продуцента растворы инкубировали в течение 1-2 суток при комнатной температуре. После этого белки кристаллов осаждали ледяной уксусной кислотой, отделяли от супернатанта центрифугированием и перерастворяли в 0,02М фосфатном буфере при рН 7,8, немедленно готовили разведения растворов в этом буфере с известной концентрацией белка, которую определяли спек-трофотометрически на спектрофотометре СФ-26 фирмы «ЛОМО» при 280 нм (е280). При этом учитывали проведенные для ряда Cry-белков подсчеты, которые показали, что растворы этих белков с концентрацией 1 мг/мл имеют е280 = 1,6. Полученные растворы использовали для определения антимикробной активности с помощью модифицированного метода диффузии в агаре [11].
Фракционирование белков кристаллов проводили на электрофоретической системе Paragon фирмы "Beckman" на ацетоцел-люлозных пластинах в гиппуратном буфере (pH 8,6).
Тест-микроорганизмы для определения антимикробного действия растворов дельта-эндотоксинов выделяли из микробиоты толстого кишечника лабораторных животных (белых мышей) с использованием классических бактериологических методик. Анализ выделенных микроорганизмов проводили согласно определителю Берджи (1997) по морфологическим, биохимическим и куль-туральным признакам. Антибиотическую активность растворов 5-эндотоксинов оце-
нивали по их действию на культуры Е. coli, Salmonella spp., Proteus spp., Citrobacter spp., Klebsiella spp., St. epidermidis, Morganella morganii, Yersinia enterocolitica, St. aureus и выражали в относительных единицах, учитывая отношение диаметра зоны подавления роста микроорганизма (в мм*102) к концентрации раствора белков (мкг/л). Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами.
Результаты и обсуждение
Электрофоретическое разделение раствора белков параспоральных кристаллов B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 выявило в их составе несколько компонентов (рис. 1). Преобладающей являлась фракция с Mr 120— 140 кДа (49,0-52,0 %). Далее располагались фракции белков, молекулярный вес которых варьировал от 65 до 80 кДа. Общее содержание этих компонентов в растворе оказалось около 45 %, по данным денситометрии. Результаты, полученные нами, согласуются с данными, установленными другими авторами [3].
Около 3-10 % приходилось на долю белков с Mr 55-65 кДа. В незначительных количествах в пробах обнаруживали компонент с Mr около 5-10 кДа, концентрировавшийся при электрофорезе в виде одной (иногда двух) слабых полос. Следовательно, растворы кристаллов B. thuringiensis subsp. kurstaki штамм Z-52 представляют собой многокомпонентные системы, включающие 3-4 белковые фракции с различными электрофорети-ческими характеристиками.
Рис. 1. Данные по электрофоретическому разделению Cry белков - компонентов параспоральных кристаллов B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52 (c использованием пластин ацетата целлюлозы). Денситограмма раствора дельта-эндотоксинов: пики отражают процентное содержание фракций, имеющих различные электрофоретические характеристики I - Mr 120140 кДа, II - Mr 65-80 кДа, III - 55-65 кДа, IV -менее 50кДа.
Из толстого кишечника белых мышей нами были выделены микроорганизмы, обладающие чувствительностью к антибиотическому действию растворов 5-эндотоксинов B. thuringiensis: это энтеробактерии E. coli и Salmonella spp., а также стафилококки -St. aureus, St. epidermidis. Другие выделенные культуры (Proteus spp., Citrobacter spp., Klebsiella spp., Morganella morganii, Yersinia enterocolitica) оказались нечувствительны к растворам 5-эндотоксинов в использованных концентрациях (от 5 до 300 мкг/мл) (табл. 1).
Таким образом, чувствительность к растворам 5-эндотоксинов проявили бактерии разных систематических групп: грамотрица-тельные энтеробактерии и грамположитель-ные стафилококки.
Об избирательности антибиотического действия отдельных компонентов кристаллов B. thuringiensis свидетельствуют результаты экспериментов ряда исследователей [8]. Различия в действии белков по отношению к разным группам микроорганизмов обусловлены, вероятно, как особенностями строения оболочек их клеток, так и способностью 5-эндотоксинов по-разному связываться с такими оболочками бактерий, подобно некоторым антибиотикам и бактериоцинам [10]. Сообщали также о возможности синергизма действия 5-эндотоксинов, в этом случае совокупность всех белков, составляющих кристалл, по биологической активности превосходит отдельные фракции [13].
Как показали результаты нашего исследования, раствор 5-эндотоксинов B. thuringiensis subsp. kurstaki обладал выраженной антибиотической активностью в отношении вышеназванных тест-микроорганизмов, причем энтеробактерии и стафилококки проявляли сходную чувствительность (табл. 2).
Так, величина относительной антибиотической активности растворов белков была примерно в 2-4 раза выше для грамотрица-тельных энтеробактерий E. ^li и Salmonella spp., чем для грамположительных стафилококков St. aureus и St. epidermidis.
Обращает на себя внимание тот факт, что грамотрицательные энтеробактерии оказались восприимчивы к сравнительно более низким концентрациям эндотоксинов.
Таблица 1.
Чувствительность некоторых бактерий-симбионтов микрофлоры толстого кишечника животных к растворам белков параспоральных кристаллов
В. (:1шп1^е1ш$ subsp. kurstaki Z-52
Наличие(+) или отсутствие (-) зон подавления роста тест-культур Тест-культуры
Е. coli St. aureus St. epidermidis Salmonella spp. Proteus spp. Citrobacter sPP. Klebsiella sPP. Morganella morganii Yersinia enterocolitica
+ + + + - - - - -
Таблица 2.
Антибиотическая активность белков параспоральных кристаллов ö-эндотоксинов
B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-52
Тест-микроорганизмы / антибиотическая активность, отн. ед.
E.coli Salmonella sp. St. aureus St. epidermidis
16,0±4,2 13,6±2,5 3,9±0,9 5,8±1,2
Примечание: число повторностей n=10.
Кроме того, на газоне этих тест-культур формировались зоны ингибирования роста большего диаметра (бактериостатический эффект), чем на газоне грамположительных стафилококков. Вслед за областями подавления развития бактерий наблюдали зоны усиленного роста, соответствующие более низким концентрациям токсина, которые еще угнетают рост более чувствительных диссоциантов популяции, но уже не оказывают влияния на наиболее устойчивые дис-социанты, которые, как правило, быстрее и интенсивнее растут [14]. Следует отметить, что практически во всех случаях наблюдали бактериостатический эффект действия растворов параспоральных белков, который спустя некоторое время (через 3-4 суток) исчезал, и затем наблюдали слабый вторичный рост газона микроорганизмов.
О чувствительности кишечной палочки и других грамотрицательных бактерий к действию различных 5-эндотоксинов B. thuringiensis сообщали и ранее [4]. Более выраженное действие токсина в отношении грамотрицательных энтеробактерий, в частности E. coli, требует, несомненно, дальнейшего изучения. Можно предположить, что связывание изучаемых белков с наружной мембраной посредством взаимодействия
с пориновыми каналами и останавливает рост клеток некоторых грамотрицательных бактерий, а при большей концентрации этих белков приводит к гибели бактерий. Антимикробный эффект параспоральных белков в отношении бактериальной микрофлоры можно объяснить их мембранотропным действием [5].
При исследовании антибактериального действия эндотоксинов на клетки E. coli было выявлено, что низкие концентрации раствора этих белков приводили к формированию областей усиленного роста, расположенных за зонами подавления роста, то есть оказывали стимулирующее влияние на рост клеток микроорганизмов. Исследованиями ряда авторов показано, что зоны усиленного роста образуют бактериальные клетки, менее восприимчивые к токсину. Такие клетки (R-варианты) обладают более плотной клеточной стенкой в сравнении с чувствительными M- и S-диссоциантами, что, видимо, препятствует проникновению антибиотика в клетку. Такие клетки в присутствии низких концентраций эндотоксинов приобретают избирательное преимущество перед более чувствительными диссоциантами и начинают усиленно развиваться и формировать области усиленного роста [9].
Результаты исследований диссоциации микробных популяций под влиянием различных физических и химических факторов окружающей среды указывают на различия в устойчивости диссоциантов одного вида к действию таких факторов, а реакция одинаковых типов клеток к внешним воздействиям может быть сходна даже у разных видов микроорганизмов. Таким образом, морфофи-зиологическая гетерогенность бактериальных популяций отражает адаптацию вида к разнообразным природным условиям, в том числе и к растворам ô-эндотоксинов определенной концентрации [7].
Таким образом, установлено, что представители групп условно патогенных бактерий, выделенных из толстого кишечника теплокровных животных, чувствительны к антибиотическому действию 5-эндотоксинов B. thuringiensis, причем такая чувствительность сходна у двух разных групп исследованных бактерий.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 12-04-97016-р_поволжье_а.
Список литературы
1. Го Даньян. Антибактериальный эффект Cry3A белка кристаллов Bacillus thuringiensis in vivo - в кишечнике личинок Tenebrio molitor / Даньян Го, Т. Г. Юдина, И. А. Залунин, Д. П. Жужиков, Л. И. Люти-кова, А И. Нетрусов // Тезисы докл. конф. «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». - М. : МГУ, РМО, 2009. - С. 56.
2. Егоров, Н. С. Значение экзопротеаз и веществ антибиотического действия Bac. thuringiensis для экологии энтомопатогенных микроорганизмов / Н. С. Егоров, Ж. К. Лория, Т. Г. Юдина // Матер. Все-союз. симпоз. «Микроорганизмы как компонент биогеоценоза». Алма-Ата, 1982. - C. 227.
3. Залунин, И. А. Белковый состав кристаллов дельта-эндотоксина различных серотипов Bacillus thuringiensis / И. А. Залунин, Г. Г. Честухина, В. М. Степанов // Биохимия. - 1979. - Т. 44. - С. 693-698.
4. Каменек, Л. К. Антибактериальное действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis как потенциального агента защиты растений / Л. К. Каменек, Т. А. Левина, Д. А. Терехин, Л. Д. Миначева // Биотехнология. - 2005. - № 1. - С. 59-67.
5. Кирсанова, Л. А. Антибиотическое влияние различных белков, образующих параспоральные включения Bacillus thuringiensis на грамотрицательных бактерий / Л. А. Кирсанова, А. П. Зарубина, И. А. Залунин, Т. Г. Юдина, Н. С. Егоров // Бюлл. МОИП. Отдел биологический «Экология. Природные ресурсы. Рациональное природопользование. Охрана окружающей среды». - 2009. - Т. 114. - Вып. 3. - Приложение 1. - Ч. 1. - С. 442-448.
6. Климентова, Е. Г. Изменение микрофлоры толстого кишечника у мышей при длительном перораль-ном введении 5-эндотоксина Bacillus thuringiensis / Е. Г. Климентова, А. А. Купцова, Л. К. Каменек,
B. В. Гулий // Сельскохозяйственная биология. -2011. - № 4. - С. 115-120.
7. Милько Е. С. Экологическая роль процесса расщепления популяции бактерий на варианты / Е. С. Милько, Н. С. Егоров // Экологическая роль микробных метаболитов. - М. : Изд-во МГУ, 1986. -
C. 201-212.
8. Юдина, Т. Г. Биологическая активность параспо-ральных кристаллов Bacillus thuringiensis / Т. Г. Юдина, Н. С. Егоров, Ж. К. Лория, Выборных // Изв. АН СССР. Сер. биол. -1988. - № 3. - С. 427-436.
9. Юдина, Т. Г. Антимикробная активность белковых включений различных бактерий / Т. Г. Юдина, Н. С. Егоров // Доклады Академии Наук. - 1996. -Т. 349. - № 2. - С. 283-286.
10. Юдина, Т. Г. Действие дельта-эндотоксинов четырех подвидов B. thuringiensis на различных прокариот / Т. Г. Юдина, Л. И. Бурцева // Микробиология. - 1997. - Т. 66. - № 1. - С. 25-31.
11. Юдина, Т. Г. Антимикробная активность и экологическая роль белковых включений бактерий - представителей родов Bacillus, Xenorhabdus, Photorhabdus : дисс. ... докт. биол. наук. - Москва, 2006. - 87 c.
12. Юдина, Т. Г. Антибиотическое влияние 5-эндотоксинов Bacillus thuringiensis на бактерии и дрожжи / Т. Г. Юдина, Го Даньян, А. И. Нетрусов // Сборник статей «Актуальные проблемы биологической безопасности». - Брянск, 2011. - С. 154-162.
13. Poncet, S. Evaluation of synergistic interactions between the CrylVA, CrylVB and CrylVD toxic components of B. thuringiensis subsp.israelensis crystals / S. Poncet, A. Delecluse, A. Klier, G. Rapoport // J. Invert. Pathol. - 1995. - V. 66. - P. 131-135.
14. Yudina, T. G. Antimicrobial activity of the different proteins and their fragments from Bacillus thuringiensis parasporal crystals against clostridia and archaea. T. G. Yudina, A. L. Bryukhanov, I. A. Zalunin, L. P. Revina, A. I. Shestakov, N. E. Voyushina, G. G. Chestukhina, A. I. Netrusov // Anaerobe. - 2007. - № 13. - P. 6-13.
Пройди новый он-лайн тест по чтению УЗИ-снимков (сонограмм) в ветеринарии: www.invetbio.spb.ru/uzi-test-2.php
