CC BY
247
УДК 579.[25+64]:575.17:632.9
Изучение генетического разнообразия Bacillus thuringiensis, выделенных в различных эколого-географических зонах Украины, при помощи анализа генов 16S рРНК, gyrB и методов АР-ПЦР и saAFLP
Н. В. Пунина12*, В. С. Зотов1, А. Л. Пархоменко3, Т. Ю. Пархоменко3, А. Ф. Топунов1 1Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071, Россия, Москва, Ленинский просп., 33, стр. 2 2Медико-генетический научный центр РАМН, 115478, Россия, Москва, ул. Москворечье, 1 3Институт сельского хозяйства Крыма Национальной академии аграрных наук Украины,
95453, Украина, АР Крым, Симферополь, ул. Киевская, 150 *E-mail: hin-enkelte@yandex.ru Поступила в редакцию 02.10.2012
РЕФЕРАТ Группа Bacillus cereus, включающая в себя близкородственные виды бактерий, представляет большой интерес с биотехнологической, сельскохозяйственной и медицинской точек зрения. Однако дифференциация видов внутри данной группы и изучение их внутривидового разнообразия представляют сложную задачу, требующую комплексного решения. Бактерии вида Bacillus thuringiensis (Bt) входят в состав группы B. cereus. В представленной работе изучена внутривидовая структура пяти энтомопатогенных штаммов и 20 изолятов Bt, выделенных в различных эколого-географических зонах Украины, при помощи различных методов: анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и gyrB, АР-ПЦР (BOX- и ERIC-ПЦР) и разработанного нами метода saAFLP. Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и gyrB позволил выделить внутри группы B. cereus шесть подгрупп: B. anthracis, B. cereus I и II, Bt I, II и III, и подтвердить принадлежность изучаемых штаммов к роду Bacillus. Все штаммы были разделены на три группы, 17 из них отнесли к группе Bt II коммерческих, промышленных штаммов. Результаты, полученные методами АР-ПЦР (BOX и ERIC) и saAFLP, хорошо коррелировали друг с другом и с данными для генов 16S рРНК и gyrB. Все штаммы были объединены в пять групп. У штамма Bt 0376 р.о., применяющегося в производстве энтомопатогенного препарата «STAR-t», выявлен уникальный saAFLP-паттерн, который позволяет отличать его от других штаммов группы Bt II.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА группа Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, 16S рибосомная РНК, gyrB, saAFLP, таксономия, филогения.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Bt - Bacillus thuringiensis; ICP - 6-эндотоксин; MLST (multilocus sequence typing) -мультилокусное типирование последовательностей; MEE (multilocus enzyme electrophoresis) - мультило-кусный электрофорез ферментов; saAFLP, AFLP (single adapter amplified fragment length polymorphism) -полиморфизм длины амплифицированных фрагментов, полученных с применением одного адаптера; RFLP (restriction fragment length polymorphism) - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов; AP-ПЦР (arbitrarily primed polymerase chain reaction) - полимеразная цепная реакция со случайными праймерами; rep-ПЦР (repetitive sequence-based PCR) - полимеразная цепная реакция с праймерами на повторяющиеся элементы; BOX, ERIC - повторяющиеся элементы ДНК; ME (minimum evolution) - метод минимальной эволюции; NJ (neighbour joining) - метод связывания ближайших соседей.
ВВЕДЕНИЕ
Bacillus thuringiensis (Bt) - грамположительные бактерии, обладающие биоинсектицидной активностью, обусловленной их способностью в процессе споруля-ции продуцировать комплекс кристаллических бел-
ковых токсинов, называемых также 6-эндотоксинами (1СР), или Сгу-белками [1]. Эти токсины активны в отношении широкого ряда видов и родов насекомых, в том числе вредителей сельскохозяйственной продукции и паразитов человека [2, 3]. Благодаря
высокой специфичности 6-эндотоксинов энтомопа-тогенные бактерии вида Bt могут заменять собой пе-стицидные средства и широко применяются при создании биотехнологических препаратов для защиты урожая [4, 5].
На основании фенотипического и генотипического анализа вид Bt был отнесен к группе B. cereus. Эта группа включает также близкородственные виды B. cereus, B. anthracis, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. weihcnstephanensis. Виды B. сєгєus и Bt невозможно различить при помощи морфологических [б], фенотипических [7] и генетических методов [8-11]. Предполагается, что эти виды могут представлять собой один общий вид B. cereus sensu lato [12, 13]. Поскольку данная группа близкородственных бактерий представляет большой интерес для сельского хозяйства и медицины, актуальным остается детальное изучение таксономии этих видов, а также создание инструментов и технологий для их дифференциации и выделения.
Традиционно вид Bt выделяли и разделяли на подвиды на основании наличия или отсутствия кристаллических IcP и кодирующих их генов cry и cty [1, 3]. Однако этот метод имеет свои недостатки: гены IcP располагаются на плазмиде, и бактерии в процессе конъюгации способны терять их, передавать другим штаммам Bt или близкородственным видам [14]. При помощи серологического анализа жгутиковых антигенов (Н-серотипирования) выявлено более 82 сероваров Bt [15, 1б]. Однако эта классификация не всегда соответствовала истинным филогенетическим взаимоотношениям внутри данного вида [17-19].
Генетическое разнообразие бактерий Bt и возможность разделения двух видов Bt и B. cereus изучали с использованием различных методов: ДНК-ДНК-гибридизации [20], анализа нуклеотидных последовательностей 16s рРНК, 23S рРНК, 16S-23S рРНК [8, 11], MLST [21], MEE [12, 18], AFLP [22-24], RFLP [25], AP-ПЦР [26-29] и др. Однако эти методы также не позволили установить истинные филогенетические взаимоотношения среди Bt.
Цель данной работы заключалась в оценке применимости модифицированного нами метода геномного фингерпринтинга (saAFLP) для выявления филогенетических различий изолятов и штаммов Bacillus sp., выделенных в различных экологогеографических зонах Украины. Для определения таксономических отношений на уровне род-вид мы анализировали нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и gyrB; для изучения структуры на внутривидовом уровне применяли метод saAFLP наряду с другими информативными методами (rep-ПЦР). Такая комплексная диагностика в совокуп-
ности с данными физиолого-биохимических тестов предоставляет большие возможности для изучения таксономической структуры близкородственных организмов. Однако следует отметить, что выборку штаммов Bt в дальнейшем нам будет необходимо расширить.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактериальные штаммы
В работе использовали пять энтомопатогенных штаммов и 20 изолятов бактерий Bt, обладающих уникальными биохимическими свойствами, из коллекций полезных микроорганизмов различных научных учреждений Украины и России (Института сельского хозяйства Крыма Национальной академии аграрных наук Украины, ИСХК НААН, Симферополь, АР Крым, Украина; Института сельскохозяйственной микробиологии Национальной академии аграрных наук, Чернигов; Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, ВКПМ ФГУП «ГосНИИге-нетика», Москва). Пять штаммов из коллекции ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетики» использовали в качестве типовых. Изоляты из коллекции ИСХК НААН были выделены в разных эколого-географических зонах Украины.
Выделение ДНК
Препараты суммарной клеточной ДНК выделяли из штаммов, которые культивировали на агаризо-ванной среде TY (г/л): дрожжевой экстракт - 1.0; пептон - 10.0; СаС12 - 0.4; агар - 20.0. ДНК выделяли из свежих культур на 1-2 сут роста с использованием метода сорбции на магнитных частицах (набор Минипреп, «Силекс», Россия).
Фенотипическая характеристика
Морфологические и физиолого-биохимические характеристики чистых культур бактерий определяли, руководствуясь общей стратегией фенотипической дифференциации, описанной в руководствах «Определитель бактерий» [30], «Методы общей бактериологии» [31].
ПЦР-амплификация и секвенирование гена 16S рРНК
ПЦР-анализ и последующее определение нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК [32] проводили на генетическом анализаторе с использованием универсальных праймеров 27£ (5'-GTTTGATСMTGGСTСAG-3'), 1492Б (5'-TAСGGYTAССTTGTTAСGAСTT-3') [33]. Ам-плифицированные фрагменты детектировали при помощи электрофореза в 1.5% агарозном геле.
Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секвенаторе Genetic Analyzer 3130xl ABI («Applied Biosystems», США).
ПЦР-амплификация и секвенирование гена gyrB Ген gyrB амплифицировали и секвенировали с использованием ранее разработанных универсальных праймерных систем UP1 и UP2r [34], разработанных нами специфичных для рода Bacillus праймеров gyrB_F (5'-CTTGAAGGACTAGARGCAGT-3') + gyrB_Rf (5'-CCTTCACGAACATCYTCACC-3') и gyrB_Fr (5'-GGTGARGATGTTCGTGAAGG-3') + gyrB_R (5'-TGGATAAAGTTACGACGYGG-3') и протокола. Температурно-временной профиль реакции был следующим: первоначальная денатурация при 94оС - 2 мин; затем 30 циклов: 94оС - 30 с, 62оС - 30 с, 72оС - 1 мин; окончательная элонгация -5 мин при 72оС. Амплифицированные фрагменты выявляли при помощи электрофореза в 1.5% агарозном геле. Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секвенаторе Genetic Analyzer 3130xl ABI («Applied Biosystems», США).
ПЦР с использованием праймеров к различным повторяющимся элементам (rep-ПЦР)
Для проведения rep-ПЦР использовали описанные ранее праймерные системы [26, 27]: ERIC1R 5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'; ERIC2 5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'; BOXA1R 5'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3'.
Амплификацию проводили в 25 мкл смеси: 1х буфер для полимеразы BioTaq (17 мМ (NH4)SO4, 6 мМ Трис-HCl, pH 8.8, 2 мМ MgCl2), 5 нМ dNTP, 50 нг ДНК-матрицы, 12.5 пМ праймера и 1.25 ед. акт. BioTaq-ДНК-полимеразы («Диалат ЛТД», Россия). Температурно-временной профиль: первый цикл - 94оС, 2 мин; последующие 40 циклов - 94оС,
20 с; 40оС, 30 с и 72оС, 90 с; окончательная элонгация - 7 мин при 72оС. Продукты ПЦР анализировали при помощи электрофореза в 1.5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, при напряженности поля 6 В/см и документировали с использованием системы BioDoc Analyze («Biometra», Германия).
saAFLP-анализ [35]
Ранее мы модифицировали метод AFLP, разработанный и запатентованный Забеу и Восом [36], и в данной работе оценили его применимость для анализа близкородственных бактерий Bt. Ранее при помощи модифицированного нами метода saAFLP были успешно проанализированы филогенетические отношения близкородственных штаммов разных видов рода Rhizobium [35]. Процедура saAFLP состоит
из трех шагов: (i) одновременная обработка в одной пробирке экстрагированной ДНК бактерии с помощью одной из эндонуклеаз рестрикции (XmaJI, XbaI, PstI) и лигирование с одним одноцепочечным адаптером Ad.CTAG1; (ii) ПЦР-амплификация с одним праймером, комплементарным последовательности Ad.CTAG1; (iii) электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов в агарозном геле. Принципиально новое в случае данного saAFLP - проведение рестрикционного анализа и лигазной реакции в одной пробирке, применение эндонуклеазы рестрикции XmaJI (XbaI, PstI) для изучения филогенетических отношений штаммов Bt, выделенных в различных эколого-географических зонах Украины, а также применение одного одноцепочечного адаптера Ad.CTAG1.
Рестрикционный анализ проводили одновременно с лигированием в 10 мкл смеси, содержащей 80 нг образца ДНК, лигазный буфер («Fermentas», США), 10 пМ одноцепочечного адаптера Ad.CTAG1 (5'-ctagCTGGAATCGATTCCAG-3'), 5 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы («Fermentas», США) и 1 ед. акт. рестриктазы XmaJI (XbaI, PstI). Полученную смесь инкубировали при 37оС в течение 2 ч, после чего доводили реакционный объeм до 100 мкл. ПЦР проводили на амплификаторе Mastercycler Gradient Eppendorf в 25 мкл смеси, содержащей 1х буфер для ПЦР, 2.8 мМ MgCl2, 0.2 мМ dNTP, в качестве ДНК-матрицы - 2 мкл рестриктазно-лигазной смеси, 0.4 мкМ праймера Pr.CTAG1 (5'-CTGGAATCGATTCCAGctag-3'), комплементарного адаптеру и 1 ед. акт. ДНК-полимеразы BioTaq («Диалат ЛТД», Россия). ПЦР-амплификацию проводили в следующем режиме: первоначальная денатурация - 94оС, 2 мин; затем 30 циклов - 94оС, 30 с; 40оС, 30 с; 72оС, 3 мин; окончательная элонгация -5 мин при 72оС.
Анализ нуклеотидных последовательностей
Первичный сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей, полученных в данной работе и представленных в базе данных GenBank, проведeн при помощи программы NCBI Blast [37]. Выравнивание последовательностей проводили с использованием программы CLUSTALW 1.75v. [38], проверку и редактирование - с помощью редактора BioEdit 7.0.5.3 [39] и Mega 3.1 [40]. Филогенетические деревья были построены в программе Mega 3.1 [40] при помощи методов объединения ближайших соседей (NJ) [41] и минимальной эволюции ME [42]. Статистическую значимость порядка ветвления полученных деревьев рассчитывали с использованием бутстрэп-анализа путем построения 1000 альтернативных реплик, или деревьев.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рPНК
Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК часто применяется с целью таксономической локализации и идентификации рода/вида бактерий. Мы амплифицировали и секвенировали ПЦР-фрагменты гена 16S рРНК (размер секвенированной области составил 1386 п.н.) пяти типовых штаммов рода Bacillus и 20 изолятов из Украины, требующих подтверждения таксономической принадлежности к роду Bacillus. Аналогичные нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК B. cereus, Bt, B. anthracis, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. weihenstephanensis получены из базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) США и использованы для сравнения. В качестве удаленных кон-тролей при проведении филогенетического анализа были выбраны нуклеотидные последовательности B. pumilus, B. licheniformis, B. subtilis. По выровненным последовательностям при помощи алгоритма ME построено филогенетическое дерево, отражающее эволюцию анализируемого гена (рис. 1). Попарные генетические расстояния рассчитывали с использованием двухпараметрической модели Кимуры.
Топология полученного дерева имела значительное сходство с филогенетической структурой рода, установленной методом ДНК-ДНК-гибридизации [43] и полученной для группы B. cereus в результате анализа фрагментов 16S рРНК, 23S рРНК [8, 11] и межгенной области 16S-23S рРНК [44], rep-ПЦР [29] и AFLP [23].
Анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК подтвердил принадлежность изучаемых изолятов к роду Bacillus. Однако вследствие высокой консервативности последовательности гена 16S рРНК (99.7-100.0% гомологии) этот метод не позволяет достоверно выделить отдельные виды внутри группы B. cereus, что неоднократно отмечали и в других работах [8, 29].
Штаммы вида B. anthracis, хотя и были сгруппированы в единый кластер, однако с низкой степенью значимости. В этот кластер B. anthracis были помещены и штаммы Bt. Как и в работе Бавыкина и соавт. [45], мы выделили две группы B. cereus (I и II). Такое разделение не подтверждено статистически (статистическая значимость порядка ветвления < 50%). Группа B. cereus I включала в себя патогенный штамм B. cereus ATCC 14579Т и целый ряд непатогенных се-роваров Bt. Группа B. cereus II состояла из различных сероваров Bt и непатогенного штамма B. cereus ATCC 10987Т. Большинство штаммов Bt с низким уровнем значимости ветвления формировали единый кластер,
объединяющий различные серовары этого вида. В отдельную подгруппу были сгруппированы штаммы видов B. mycoides и B. weihenstephanensis.
Штаммы, представляющие коммерческую ценность, а также типовой штамм Bt ser. Ьєтїіпєт АТСС 10792Т, были объединены в группу Bt II со значимостью ветвления 56%. К этой группе отнесли 17 изучаемых нами украинских изолятов различных серо-типов, выделенных из различных насекомых-хозяев в основном в Луганской и Херсонской областях, а также в Красногвардейском и Симферопольском районах. Штамм Bt 0376 р.о. (серотип 1), предложенный для производства экологически безопасного эн-томопатогенного препарата <^ТАК-Ь> (ООО «Симби-тор»), предназначенного для регуляции численности личинок колорадского жука (Leptinotaтsa decemїin-eata), картофельной моли (Phtoтimea opeтcuїeїїa Zeї.) и нутового минера (Liтiomiza ciceтina Rd.) во время вегетации и хранения картофеля и нута, был отнесен к данной группе и имел группоспецифические замены А^77, Т/С90, Т/А92, С/Т192, С/А1015 в гене 16S рРНК. Все исследованные нами изоляты группы Bt II имели полностью идентичные нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК. Штамм Bt уаг. thuтingiensis 994 (серотип 1, аналог биоагента препарата Битоксибациллин), применяемый для производства препарата «Акбитур», штамм Bt 408 (серотип 3), проявляющий высокую энтомопатогенную активность в отношении L. decemїineata, и штамм Bt уаг. daтmstadiensis Н10 (X серотип) также вошли в группу Bt II.
Штаммы Bt 836 (серотип 4), Bt уаг. kuтstaki 0293 (серотип 3, аналог штамма-биоагента препарата Ле-пидоцид) и Bt уаг. тот^опі 109 (серотип X) были отнесены к группе Bt I. Внутри каждой группы найдены как специфические нуклеотидные замены, характерные для каждой из групп, так и случайные. У В. ап-Лта^ нашли 16 замен; у В. сєтєш I - 30; у В. сєтєш II - 32; у Bt I - 28; у Bt II - 21. Однако следует отметить, что большинство нуклеотидных замен носило случайный характер, они были штаммоспецифичными.
Таким образом, ген 16S рРНК не может использоваться для оценки и изучения филогении на уровне ниже рода и вида Bt, так как не позволяет выделить нуклеотидные замены, специфичные для отдельных видов данной группы.
Генетическое разнообразие последовательностей гена дутВ
В таксономических исследованиях и для идентификации бактерий наряду с геном 16S рРНК применяют нуклеотидную последовательность гена дутВ [34]. В настоящее время опубликован ряд работ, в которых
62
99
----- EF210294 B. thuringiensis ser tohokuensis EBC-T17
1 AB617500 B. thuringiensis ser neoleonensis B. thuringiensis H10 B. thuringiensis 5681st B. thuringiensis ser israelensis B-5246 B. thuringiensis 1b B. thuringiensis 1a B. thuringiensis 0371-2 B. thuringiensis 411
■ EU429669 B. thuringiensis ser toumanoffi
NZ ACNF01000156 B. thuringiensis ser berliner ATCC 10792 B. thuringiensis 994
■ ■ EF2103U0 B. thuringiensis ser alesti IEBC-T0 B. thuringiensis 0409
B. thuringiensis 072 D16281 B. thuringiensis IAM12077 B. thuringiensis Г4 B. thuringiensis 408 B. thuringiensis 787 B. thuringiensis A/N
B. thuringiensis subsp. thuringiensis B-1223 JQ669397 B. thuringiensis
Bf II
huringiensis ser israelensis SB67
NZ ACNA01000167 B. thuringiensis subsp. thuringiensis T01001 B. thuringiensis 0371-1 B. thuringiensis 410 B. thuringiensis A/M
CP001907 B. thuringiensis ser chinensis CT-43
■ EF210314 B. thuringiensis ser ostriniae IEBC-T08A001 ' B. thuringiensis 0376 p.o.
I— EF210311 B. thuringiensis ser wratislaviensis IEBC-T47 ■87 EF210312 B. thuringiensis ser entomocidus IEBC-T06 ' B. thuringiensis ser subtoxicus B-822 AB617494 B. thuringiensis ser kumamotoensis
EF210299 B. thuringiensis ser bolivia IEBC-T63 EF210295 B. mycoides ATCC 6462 NZ ACMU01000002 B. mycoides DSM 2048 “ EF210293 B. thuringiensis ser vazensis IEBC-T67 NR 024697 B. weihenstephanensis DSM11821 EF210284 B. thuringiensis ser oswaldocruzi IEBC-T38 EF210310 B. thuringiensis ser thompsoni IEBC-T12 JQ669398 B. thuringiensis ser kurstaki AB142 EF210309 B. thuringiensis ser sotto IEBC-T04001 B. thuringiensis 109
AB617476 B. thuringiensis ser sumiyoshiensis
EF210315 B. thuringiensis ser kenyae IEBC-T04B001
99
Bf + B. mycoides +
+ B. weihenstephanensis
\
, EF210287 B. thuringiensis ser shadongiensis IEBC-T22 — EF210289 B. thuringiensis ser zhaodongensis IEBC-T62 “■ EF210308 B. thuringiensis ser higo IEBC-T44 EU429662 B. thuringiensis ser galleriae B. thuringiensis 836 B. thuringiensis 0293
- EU429670 B. thuringiensis ser morrisoni
------------------AB617495 B. thuringiensis ser fochigiensis BGSC 4Y1
------------AB617485 B. thuringiensis ser darmsfadiensis
r- EF210286 B. thuringiensis ser seoulensis IEBC-T35 T AB671487 B. thuringiensis ser kyushuensis EF210288 B. thuringiensis ser folworfhi IEBC-T09 ACNC01000278 B. thuringiensis ser pakisfani T13001 AB617496 B. thuringiensis ser yunnanensis AY461760 B. thuringiensis ser aizawai U AE016877 B. cereus ATCC 14579
— EF210303 B. thuringiensis ser azorensis BGSC 4CB1 AE017334 B. anthracis str. Ames Ancestor AE017225 B. anthracis str. Sterne AE016879 B. anthracis str. Ames
— EF210304 B. thuringiensis ser roskildiensis IEBC-T45 - AE017194 B. cereus ATCC 10987 ' B. thuringiensis ser finifimus B1162
— AB6174/3 B. thuringiensis ser finifimus
■ ' EF210285 B. thuringiensis ser pulsiensis IEBC-T65 AB617504 B. thuringiensis ser monferrey CP001746 B. cereus biovar anthracis str. Cl ACNG01000003 B. thuringiensis ser andalousiensis BGSC 4AW1 EF210302 B. thuringiensis ser graciosensis IEBC-T66
“ NC 005957 B thuringiensis ser konkukian 97-27 — EF210305 B. thuringiensis ser poloniensis IEBC-T54
—-------------------AY167879 B. pumilus SAFR-032
98------------------------ NC 006322 B. licheniformis ATCC 14580
Bf I
B. cereusI
B. anthracis
B. cereus II
CP002183 B. subfilis subsp. spizizenii W23
0.005
Рис. 1. Филогенетическое дерево бактерий рода Bacillus, построенное по результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК с использованием алгоритма ME. Масштаб соответствует 0.5 заменам на 100 п.н. (эволюционным расстояниям). Цифрами указана статистическая значимость порядка ветвления (в %), определенная с помощью бутстрэп-анализа 1000 альтернативных деревьев
A
100
86
B
: 100
92-
NC 014335 B. cereus biovar anthracis str. Cl NC 005945 B. anthracis str. Sterne EU761168 B. thuringiensis ser monterrey IEBC-T28 NC007530 B. anthracis str. Ames Ancestor NC003997 B. anthracis str. Ames 99 EF210265 B. thuringiensis ser oswaldocruzi IEBC-T38 EF210266 B. thuringiensis ser pulsiensis IEBC-T65 CM000755 B. thuringiensis ser pondicheriensis BGSC 4BA1 CM000754 B. thuringiensis ser andalousiensis BGSC 4AW1 NC 005957 B. thuringiensis ser konkukian 97-27 CM000746 B. thuringiensis ser tochigiensis BGSC 4Y1 AAEK01000032 B. cereus G9241 1001— B. thuringiensis ser finitimus B-1162 • AE017194 B. cereus ATCC 10987 ' EF210281 B. thuringiensis ser poloniensis IEBC-T54
---EF210274 B. thuringiensis ser graciosensis IEBC-T66
EF210270 B. thuringiensis ser bolivia IEBC-T63
99
rp-
100 <
}
Bt +
■' + Ba
B. cereus II
EF210271 B. thuringiensis ser finitimus IEBC-T02
Bt III
100
76
Bt I
97
73
—- CM000756 B. thuringiensis ser huazhongensis BGSC 4BD1 EF210277 B. thuringiensis ser tolworthi IEBC-T09
■ EU761180 B. thuringiensis ser canadensis IEBC-T05A001 CM000750 B. thuringiensis ser pakistani T13001 AE016877 B. cereus ATCC 14579 EF210272 B. thuringiensis ser azorensis IEBC-T64 EF210278 B. thuringiensis ser zhaodongensis IEBC-T62
^ EU761170 B. thuringiensis ser nigeriensis IEBC-T08B001 73j ■ EU761172 B. thuringiensis ser entomocidus IEBC-T06A001 EU761182 B. thuringiensis ser jegathesan IEBC-T28A001 B. thuringiensis subsp. subtoxicus B-822 AY461770 B. thuringiensis H-10
EU761194 B. thuringiensis ser kumamotoensis IEBC-T18 EU761190 B. thuringiensis ser yunnanensis IEBC-T20 EU761192 B. thuringiensis ser galleriae BGSC-4G2 AY461777 B. thuringiensis H18 EF210257 B. thuringiensis ser kenyae IEBC-T04B001 EU761169 B. thuringiensis ser londrina IEBC-T10A001 B. thuringiensis 836 — B. thuringiensis ser galleriae B-197 B. thuringiensis 0293 AY461778 B. thuringiensis ser aizawai
■ EF210260 B. thuringiensis ser thompsoni IEBC-T12 EU761176 B. thuringiensis ser kurstaki BGSC-4D2 EF210256 B. thuringiensis ser higo IEBC-T44 EU761183 B. thuringiensis ser yosoo IEBC-T18A001
AF090331 B. thuringiensis IAM12077 CP001907 B. thuringiensis ser chinensis CT-43 CM000748 B. thuringiensis ser thuringiensis T01001 B. thuringiensis subsp. thuringiensis B-1223 B. thuringiensis H10 B. thuringiensis A/N B. thuringiensis A/M B. thuringiensis 994 B. thuringiensis 787 B. thuringiensis 5681st B. thuringiensis 410 B. thuringiensis 411 B. thuringiensis 409 B. thuringiensis 408 B. thuringiensis 1b B. thuringiensis 1a B. thuringiensis 14 B. thuringiensis 072 B. thuringiensis 0371-2 B. thuringiensis 0371-1 B. thuringiensis subsp. israelensis B-5246 CM000753 B. thuringiensis ser berliner ATCC 10792 ■ B. thuringiensis 0376 p.o.
EF210275 B. thuringiensis ser ostriniae IEBC-T08A001
- EF210276 B. thuringiensis ser tohokuensis IEBC-T17
- AY461779 B. thuringiensis ser galleriae
- AY461780 B. thuringiensis ser israelensis ' EU761175 B. thuringiensis ser alesti BGSC-4C1 .г ■ B. thuringiensis 109 • EU761186 B. thuringiensis ser sotto T04001 i EU761185 B. thuringiensis ser darmstadiensis IEBC-T10 ■ EU761196 B. thuringiensis ser mirrisoni BGSC-4K1 99 ■ EU761173 B. thuringiensis ser sumiyoshiensis IEBC-T03B001
-----■ EF210279 B. thuringiensis ser fukuokaensis IEBC-T03C001
■ EU761174 B. thuringiensis ser toumanoffi IEBC-T11 )0 r EF210261 B. thuringiensis ser wratislaviensis IEBC-T47 — — EU761191 B. thuringiensis ser neoleonensis IEBC-T24 Л ■ EF210268 B. thuringiensis ser shandongiensis IEBC-T22 72 ;r EF210258 B. thuringiensis ser seoulensis IEBC-T35 87; ■ EU761167 B. thuringiensis ser kyushuensis IEBC-T11A001 10 0 ■— EF210267 B. thuringiensis ser roskildiensis IEBC-T45 ^ CP000001 B. cereus E33L 99 ■ AF090332 B. mycoides ATCC 6462 j B. mycoides
100 P_NZ ACMU01000094 B. mycoides DSM2048 J
B. cereusI
84
j
ij1 ■
77
100
99
Bt II
99 ■ -
100 Г N
-----■ El
99 J, N
97-
EF210269 B. thuringiensis ser vazensis IEBC-T67 NC010184 B. weihenstephanensis KBAB4 EU761171 B. thuringiensis ser novosibirsk IEBC-T24A001 NC009848 B. pumilus SAFR-032
■ NC006270 B. licheniformis ATCC 14580
}
Bt + Bw
NC014479 B. subtilis subsp. spizizenii W23
0.05
Рис. 2. Филогенетическое дерево бактерий группы В. cereus, построенное по результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена дугВ, с использованием алгоритма МЕ. Масштаб соответствует 5 заменам на 100 п.н. Цифрами указана статистическая значимость порядка ветвления (в %), определенная с помощью бутстрэп-анализа 1000 альтернативных деревьев
II
изучали изменчивость последовательности данного гена у различных видов бактерий рода Bacillus (например, B. subtilis [46], группы B. cereus [47]). С помощью предложенных ранее универсальных праймеров [34] и созданных нами праймерных систем, специфичных для 3'-конца гена gyrB бактерий группы B. cereus, амплифицировали и секвенировали ПЦР-фрагменты гена (размер секвенированной области составил 1800 п.н., 81.82% всего гена). Этот фрагмент гена gyrB выбран нами на основании распределения уровня полиморфизма (энтропии) нуклеотидной последовательности гена с помощью программного обеспечения DNAsp v. 5 [48]. Уровень полиморфизма был выше среднего на участках 150-700 и 1650-2000 п.н. от начала гена (данные не представлены). Однако вследствие ограниченного количества представленных в GenBank последовательностей гена gyrB штаммов группы B. cereus данной длины для анализа мы выбрали участок с 385 по 1507 п.н. от начала гена (аннотация дана для штамма Bt ser. berliner ATCC 10792Т), что составило 60% общей длины гена. Для 25 изученных нами штаммов, изолятов и референсных последовательностей штаммов рода Bacillus, депонированных в GenBank, при помощи алгоритма ME построено филогенетическое дерево, представленное на рис. 2. В качестве удаленных контролей при проведении филогенетического анализа использовали нуклеотидные последовательности видов B. pumilus, B. licheniformis, B. subtilis.
Топология построенного дерева имела значительное сходство с филогенетическими деревьями, полученными ранее для гена 16S рРНК и межгенного региона 16S-23S рРНК, и не зависела от применяемых для построения алгоритмов (NJ, ME). Выявлены межвидовые и внутривидовые различия между видом B. anthracis и группой B. cereus - Bt. Результаты проведенных исследований показали, что нуклеотидная последовательность гена gyrB обладает большей разрешающей способностью, чем последовательности генов 16S рРНК и межгенного региона 16S-23S рРНК [34, 4б], и соответственно более пригодна для таксономического изучения близкородственных видов.
Как и в случае гена 16S рРНК, но с большей степенью значимости, внутри группы B. cereus можно выделить пять подгрупп: B. anthracis, B. cereus I и II, Bt I и II. На филогенетической кладограмме со статистической значимостью порядка ветвления 92% выделена еще одна группа - Bt III, в которую вошли штаммы Bt ser. bolivia IEBC-T63 и Bt ser. finitimus IEBC-T02. Большинство штаммов с высокой степенью значимости формировали группу штаммов Bt II, в которой также находились штаммы, применяемые в производстве энтомопатогенных препаратов. Однако, как и предполагалось, исходя из опубликован-
ных данных, различить между собой виды B. cereus и Bt не представлялось возможным [45]. Так, штаммы Bt были сгруппированы вместе со штаммами видов B. anthracis, B. сєгєш и B. weihenstephanensis в подгруппы B. anthracis, B. cereus I и II и B. weihenstephanensis. Вследствие большей разрешающей способности и вариабельности нуклеотидной последовательности gyrB при сравнении последовательностей данного гена штамма Bt 0376 р.о. и других штаммов данной группы удалось выявить две специфические для данного штамма замены: A/G861 и A/G1149. В целом в группе B. сєгєш уровень сходства нуклеотидных и аминокислотных последовательностей составил 87.1-95.2% и 95.1-99.2% соответственно.
Стоит отметить кластеризацию штаммов в две группы с высоким уровнем статистической значимости порядка ветвления. Кластер I образован группами А и B. Группа А объединила (достоверно сгруппированные) патогенные штаммы B. anthracis, непатогенный штамм B. cereus ATCC 10987Т и энто-мопатогенные штаммы Bt ser. finitimus B-1162 и Bt ser. poloniensis IEBC-T54 группы B. cereus II, энто-мопатогенные штаммы группы Bt III. Группа В образована патогенным для человека штаммом B. ce-reus ATCC 14579Т, энтомопатогенными штаммами Bt группы B. cereus I и энтомопатогенными штаммами группы Bt I. В кластер II вошли бактерии видов B. weihenstephanensis, B. mycoides и группа Bt II, включающая большинство штаммов, применяющихся в промышленном производстве энтомопатогенных препаратов. Подобная кластеризация бацилл может свидетельствовать в пользу парафилетичной структуры как самой группы B. cereus в целом, так и отдельных ее видов.
Полиморфизм Bt, выявленный saAFLP и rep-ПЦP-маркерами
Для выявления различий между близкими видами и штаммами бактерий наряду с генами домашнего хозяйства применяют методы геномного фингер-принтинга. Наиболее часто применяется метод rep-ПЦР, основанный на использовании олигонуклеотид-ных праймеров, гомологичных последовательностям межгенных повторяющихся элементов различного типа. В нашей работе различия между близкородственными штаммами Bt выявляли при помощи rep-ПЦР (BOX-, ERIC-ПЦР) и saAFLP. Полученные результаты представлены на рис. 3, 4.
Все исследуемые нами штаммы анализировали методом saAFLP с применением трех эндонуклеаз рестрикции - XmaJI, XbaI и PstI. Информативные спектры для всех штаммов Bt получены только с использованием XmaJI. Метод saAFLP, модифициро-
тт т-~ттш*т---------
еч іа і* и р и <>• в и и *- г т м я е»...
2
!ППЙ"Й"** * —
>™НИьН' »Я
4 3 5 2 6
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2930
Рис. 3. Результаты электрофоретического анализа продуктов saAFLP на препаратах ДНК Bf. Дорожки 17, 18, 29 - маркер GeneRuler™ молекулярной массы ДНК (1 kb ladder, «Fermentas»); 1 - Bf Н10, R-тип; 2 - Bf A/N;
3 - Bf 408; 4, 19 - Bf 5681st; 5, 23 - Bf 0376 p.o.; 6 — Bf 787; 7 - Bf 411; 8 - Bf 072; 9 - Bf 0371-1; 10, 27 - Bf 109; 11 - Bf 14; 12 - Bf 994; 13 - Bf 1b; 14 - Bf A/M; 15 - Bf 836; 16, 25 - Bf 0293; 20 - Bf subsp. israelensis B-5246;
21 - Bf 0371-2; 22 - Bf subsp. thuringiensis B-1223; 24 - Bf subsp. subfoxicus B-822; 26 - Bf subsp. galleriae B-197; 28 — Bf subsp. finitimus B-1162; 30 - контрольная ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы
ванный нами, позволил различать штаммы на уровне вид-группа штаммов. Из результатов анализа видно, что полученные спектры разделили выборку штаммов Bt на шесть групп (рис. 3). Все штаммы относились к виду Bt, однако, предположительно, к разным подвидам. Группа 1 включала типовые штаммы Bt subsp. thuringiensis, а также Bt 0376 p.o. Этот штамм содержал уникальный saAFLP-фрагмент длиной 1000 п.н., отличающий его от других штаммов группы 1 (отмечен белой стрелкой на рис. 3). Группы 2, 3, 4, 5 представлены либо малым числом штаммов, либо одним штаммом. Следует отметить, что такое группирование соответствовало данным, полученным ранее с использованием генов 16S рРНК и gyrB. Важно, что каждая группа имела свой специфический спектр и saAFLP-фрагменты, отличающие ее от штаммов других групп. Удалось выявить маркеры, уникальные для отдельных штаммов, например, коммерческого штамма Bt 0376 p.o., отличающие его от всех штаммов группы 1. Таким образом, предлагаемый нами метод более специфичен и может использоваться для быстрого поиска специфических маркеров и изучения полиморфизма популяции.
В своей работе мы также использовали методы ERIC-ПЦР (рис. 4А) и BOX-ПЦР (рис. 4Б) для срав-
нения результатов, получаемых при помощи «стандартных» праймеров и при помощи разработанного нами saAFLP-анализа. На основании анализа полученных ERIC- и BOX-спектров все исследуемые штаммы Bt были разделены на шесть групп. Однако различий между ERIC- и BOX-спектрами штаммов внутри каждой группы не выявлено. Видно, что число специфических ПЦР-маркеров, а также общее количество фрагментов, получаемых методом saAFLP, больше, чем при использовании ERIC-и BOX-праймеров. Это свидетельствует в пользу более высокой чувствительности, специфичности и информативности метода saAFLP. Характер полученных результатов можно объяснить тем, что методы, в которых используются ERIC- и ВОХ-праймеры, позволяют анализировать отдельные участки генома, которые являются весьма консервативными (промоторные регионы (ERIC1R-ERIC2, BOX, REP2-I-REP1R-I), или область функциональных генов (например, тРНК), поэтому спектры, получаемые на основе таких праймеров, содержат общую, а не штаммоспецифичную информацию, и подходят, скорее, для паспортизации штаммов. Спектры, получаемые методом saAFLP, не привязанного к какому-либо определенному участку генома, отражают инди-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1819 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
А
Б
Рис. 4. Результаты электрофоретического анализа продуктов ПЦР на препаратах ДНК Bf с применением праймеров к мобильным элементам ERIC (А) и BOX (Б). Дорожки 17, 19, 30 — маркер GeneRuler™ молекулярной массы ДНК (1 kb ladder, «Fermentas»); 1 — Bf Н10, R-тип; 2 — Bf A/N; 3 — Bf 408; 4, 19 — Bf 5681st; 5, 23 — Bf 0376 p.o.;
6, 20— Bf 787; 7 — Bf 411; 8 — Bf 072; 9, 24 — Bf 0371-1; 10, 28 — Bf 109; 11 — Bf 14; 12 — Bf 994; 13 — Bf 1b; 14 — Bf A/M; 15 — Bf 836; 16, 26 — Bf 0293; 18 — контрольная ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы; 21 — Bf subsp. israelensis B-5246; 22 — Bf subsp. thuringiensis B-1223; 25 — Bf subsp. subfoxicus B-822; 27 — Bf subsp. galleriae B-197; 29 — Bf subsp. finitimus B-1162
видуальность каждого конкретного микроорганизма. Фингерпринты на основе этого метода выявляют различия между всеми проанализированными штаммами [34]. Специфичность спектров дает возможность делать предварительные заключения о характере родства, не прибегая к данным других праймеров или методов, за исключением определения родовой принадлежности микроорганизма, например, с помощью генов 16S рРНК или gyrB.
Однако для подтверждения достоверности подобных результатов и получения полной картины генетических взаимоотношений между близкородственными бактериями необходим анализ суммарных данных, полученных и методом saAFLP, и с помощью ERIC- и BOX-ПЦР.
В нашей работе при помощи трех методов - ERIC-, BOX-ПЦР и saAFLP - выявлены 36 полиморфных признаков (уникальных фрагментов) среди исследуемых штаммов и по полученным данным построена их дендрограмма (рис. 5). Генетические расстояния между парами штаммов определяли по алгоритмам
Пирсона (Pearson’s correlation), простого различия (Simple difference) и расстояния Козине (Cosine) (данные не представлены). Полученные матрицы расстояний использовали при проведении кластерного анализа с помощью метода NJ. По результатам этого анализа все изучаемые нами штаммы были разделены на пять кластеров. Статистическая значимость порядка ветвления составила от 58 до 99%. Кластеры выделяли на основании сходства >80% и/или величины значимости ветвления >50%. Кластер 1 включал в себя штаммы Bt Н10 R-типа, Bt A/N, Bt 408, Bt 409, Bt 410, Bt 5681st, Bt 787, Bt 411, Bt 072, Bt 0371-1, Bt 14, Bt 994, Bt 1а, Bt 1b, Bt A/M, Bt subsp. israelensis B-5246, Bt 0371-2 и типовой штамм Bt subsp. thur-ingiensis B-1223. Внутри данного кластера с высокой статистической значимостью порядка ветвления выделен штамм Bt 037б р.о. Кластер 2 был образован двумя подвидами - Bt subsp. galleriae и Bt subsp. sub-toxicus. Значимость ветвления <50% показывает, что, возможно, данные штаммы принадлежат разным подвидам и при увеличении выборки будут фор-
99
94
84
78
100
52
Bt 5681st
Bt subsp. thuringiensis B-1223 Bt subsp. israelensis B-5246 Bt A/M Bt 1b Bt 1a Bt 994 Bt 14 Bt 0371-1 Bt 0371-2 Bt 411 Bt 410 Bt 787 Bt 072 Bt 409 Bt 408 Bt H10 Bt A/N
■ Bt 0376 p.o.
---- Bt subsp. subtoxicus B-822
Bt subsp. galleriae B-197 , Bt0293 5 Bt836 Bt 109
Bt subsp. finitimus B-1162
} 3 > 4
} 5
Рис. 5. Дендрограмма 25 штаммов Bt, выделенных на территории Украины. Дендрограмма построена методом NJ по суммарным результатам ERIC-, BOX-ПЦР и saAFLP для 36 полиморфных признаков. Цифрами показана статистическая значимость порядка ветвления (в %), определенная с помощью бутстрэп-анализа 1000 альтернативных реплик
0.1
мировать отдельные кластеры. Для подтверждения или опровержения данной гипотезы следует в дальнейшем расширить выборку штаммов. В кластер 3 вошли штаммы Bt 0293 и Bt 836, кластер 4 был представлен штаммом Bt 109, а кластер 5 - штаммом Bt subsp. ^тЫтш В-1162.
На основании опубликованных и полученных нами данных можно сделать вывод о том, что для изучения и идентификации вида Bt группы В. сетеш необходим комплексный подход, объединяющий анализ и биохимических свойств штамма, и молекулярнобиологические методы. Вид Bt можно успешно изучать с использованием нуклеотидной последовательности гена дутВ, на внутривидовом уровне - методом
saAFLP вместе с другими методами АР-ПЦР (rep-ПЦР). При помощи данных методов изученную нами выборку штаммов разделили на пять групп, что также соответствовало их уникальным биохимическим свойствам, определенным ранее в работах наших коллег [49]. Разработанный нами метод saAFLP позволил выявить фрагмент ДНК, уникальный для штамма Bt 0376 p.o., впервые выделенного нашими коллегами из ИСХК НААН и применяемого в производстве эн-томопатогенного препарата «STAR-t». В дальнейшем планируется расширить выборку штаммов, изучить состав генов cry, определить нуклеотидные последовательности уникальных ДНК-фрагментов, выявленных в отдельных saAFLP-группах и штаммах.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hofte H., Whiteley H.R. // Microbiol. Rev. 1989. V. 53. P. 242-255.
2. Feitelson J.S. // Advanced engineered pesticides / Ed. Kim L. N.Y.: Marcel Dekker, 1993. P 63-72.
3. Crickmore N., Zeigler D.R., Feitelson J., Schnepf E., Vanrie J., Lereclus D., Baum J., Dean D.H. // Microbiol. Rev. 1998. V. 62.
P. 807-813.
4. Aronson A.I., Beckman W., Dunn P. // Microbiol. Rev. 1986.
V. 50. P 1-24.
5. Rowe G.E., Margaritis A. // Crit. Rev. Biotechnol. 1987. V. 6.
P. 87-127.
6. Baumann L., Okamoto K., Unterman B.M., Lynch M.J., Baumann P // J. Invertebr. Pathol. 1984. V. 44. P. 329-341.
7. Aronson A.I. // Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology, and molecular genetics /
Eds Sonenshein A.B., Hoch J.A., Losick R. Washington, D.C.: Amer. Soc. Microbiol., 1993. P. 953-963.
8. Ash C., Farrow J.A.E., Dorsch M., Stackebrandt E., Collins M.D. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. V. 41. P 343-346.
9. Carlson C.R., Caugant D.A., Kolsto A.-B. // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. P. 1719-1725.
10. Wunschel D., Fox K.F., Black G.E., Fox A. // Syst. Appl. Microbiol. 1994. V. 17. P 625-635.
11. Bourque S.N., Valero J.R., Lavoie M.C., Levesque R.C. // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. P. 1623-1626.
12. Helgason E., Okstad O.A., Caugant D.A., Johansen H.A., Fouet A., Mock M., Hegna I., Kolsto A.-B. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P 2627-2630.
13. Chen M.L., Tsen H.Y. // J. Appl. Microbiol. 2002. V. 92.
P. 912-919.
14. Thorne C.B. // Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria / Ed. Soneshein A.L. Washington, D.C.: Amer. Soc. Microbiol., 1993. P. 113-124.
15. de Barjac H., Franchan E. // Entomophaga. 1990. V. 35.
P. 233-240.
16. Lecadet M.-M., Frachon E., Cosmao Dumanoir V., Ripouteau H., Hamon S., Laurent P., Thiery I. // J. Appl. Microbiol. 1999.
V. 86. P. 660-672.
17. Hansen B.M., Damgaard P.H., Eilenberg J., Pedersen J.C. // J. Invertebr. Pathol. 1998. V. 71. P. 106-114.
18. Helgason E., Caugant D.A., Lecadet M.-M., Chen Y., Mahillon J., Hegna I., Kvaloy K., Kolsto A.-B. // Curr. Microbiol. 1998.
V. 37. P. 80-87.
19. Priest F.G., Barker M., Baillie L.W.J., Holmes E.C., Maiden M.C.J. // J. Bacteriol. 2004. V. 186. № 23. P. 7959-7970.
20. Somerville H.J., Jones M.L. // J. Gen. Microbiol. 1982. V. 73.
P. 257-265.
21. Ko K.S., Kim J.M., Kim J.W., Jung B.Y., Kim W., Kim I.J., Kook Y.H. // J. Clin. Microbiol. 2003. V. 41. P. 2908-2914.
22. Kiem P., Kalif A., Schupp J., Hill K., Travis S.E., Richmond K., Adair D.M., Hugh-Jones M., Kuske C.R., Jackson P. // J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 818-824.
23. Hill K., Ticknor L., Okinaka R., Asay M., Blair H., Bliss K., Laker M., Pardington P., Richardson A., Tonks M., et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 1068.
24. Ticknor L.O., Kolsto A.-B., Hill K.K., Keim P., Laker M.T., Tonks M., Jackson P.J. // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67.
P. 4863-4873.
25. Joung K.-B., Cote J.-C. // J. Appl. Microbiol. 2001. V. 90.
P. 115-122.
26. Epplen J.T., Ammer H., Epplen C. / Oligonucleotide Fingerprinting Using Simple Repeat Motifs: A Convenient, ubiquitously Applicable Method To Detect Hypervariability for Multiple Purposes // Eds Burke G., Dolf G., Jeffreys A.J., Wolff R. Basel: Birkhauser, 1991. P. 50-69.
27. Louws F.J., Fulbright D.W., Stephens C.T., de Bruijn F.J. // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. P. 2286-2295.
28. Chaley M.B., Korotkov E.V., Skryabin K.G. // DNA Res. 1999. V. 6. P. 153-163.
29. Boulygina E.S., Ignatov A.N., Tsygankova S.V., Korotkov E.V., Kuznetsov B.B. // Microbiology. 2009. V. 78. № 6. P. 703-710.
30. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Ed. // Eds Logan N.A., De Vos P. N.Y.: Springer, 2009. № 3. P. 21-128.
31. Manual of Methods for General Bacteriology // Eds
Gerhardt P., Murray R.G., Costilow R.N., Nester E.W., Wood M.W., Krieg N.R., Phillips G.B. Washington, DC.: Am. Soc. Microbiol., 1981. P. 232-234.
32. Sanger F., Air G.M., Barrell B.G. // Nature. 1977. V. 265.
P. 687-695.
33. Lane D.J. / 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics // Eds Stackebrandt E., Goodfellow M. N.Y.: Wiley, 1991. P. 115-175.
34. Yamamoto S., Harayama S. // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. P. 1104-1109.
35. Zotov V.S., Punina N.V., Khapchaeva S.A., Didovich S.V., Melnichuk T.N., Topunov A.F. // Ekologicheskaya genetika. 2012. V. 2. P. 49-62.
36. Zabeau M., Vos P. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerprinting // European Patent Office. Munich. Germany. 1993. Publication 0534858A1.
37. Altschul S.F., Gish W., Miller W. // J. Mol. Biol. 1990. V. 215.
P. 403-410.
38. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. // Nucl. Acids Res. 1994. V. 22. P. 4673-4680.
39. Hall T.A. // Nucl. Acids Symp. Ser. 1999. V. 41. P. 95-98.
40. Kumar S., Tamura K., Nei M. // Briefings in Bioinformatics. 2004. V. 5. P. 150-163.
41. Nei M., Kumar S. Molecular evolution and phylogenetics.
N.Y.: Oxford Univ. Press, 2000. P. 336.
42. Rzetsky A., Nei M. // Mol. Biol. Evol. 1992. V. 9. P. 945-967.
43. Priest F.G. / DNA homology in the genus Bacillus. In The Aerobic Endospore-Forming Bacteria // Eds Berkeley R.C.W., Goodfellow M. London: Acad. Press, 1981. P. 33-57.
44. Daffonchio D., Cherif A., Borin S. // Appl. Environ.
Microbiol. 2000. V. 66. P. 5460-5468.
45. Bavykin S.G., Lysov Y.P., Zakhariev V., Kelly J.J., Jackman J., Stahl D.A., Cherni A. // J. Clin. Microbiol. 2004. V. 42. № 8.
P. 3711-3730.
46. Wang L.T., Lee F.L., Tai C.J., Kasai H. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 1846-1850.
47. La Duc M.T., Satomi M., Agata N., Venkateswaran K. // J. Microbiol. Meth. 2004. V. 56. P. 383-394.
48. Librado P., Rozas J. // Bioinformatics. 2009. V. 25. P. 1451-1452.
49. Parkhomenko A.L., Parkhomenko T.U., Lesovoy N.M. // Scientific notes of Taurida V. Vernadsky National University. Series: Biology, Chemistry. 2009. V. 22. № 3. P. 96-100.
