CC BY
91
15. Kudelina R.I., Olsufiev N.G. Differentiation of geographical races of Francisella tularensis with the aid of some antibiotics. ZHMEI. 1973; 4: 3-9.
16. Svensson K., Larsson P., Johansson D., Bystrom M., Forsman M., Johansson A. Evolution of subspecies of Francisella tularensis. J. Bacteriol. 2005; 187(11): 3903-8.
Received 01.08.14
CITRULLINUREIDASE GENE DIVERSITY IN THE GENUS FRANCISELLA
Timofeev V. S, Bakhteeva I. V., Pavlov V. M, Mokrievich A. N.
State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Moscow Region, Russia
This work describes the results of the in silico analysis of the genetic diversity of the citrullinureidase gene (ctu) in two species
of bacteria of the genus Francisella: tularensis (ssp. tularensis, holarctica, mediasiatica, novicida) and philomiragia. The strains of the Central Asiatic subspecies possessing the citrullinureidase activity differ in the gene ctu from the ssp. tularensis Schu by three nucleotide substitutions leading to two insignificant amino acid substitutions in the encoded polypeptide. In the strain F. tularensis of the ssp. holarctica the gene ctu encodes inactive enzyme, which is probably due to amino acid substitutions: 151 Gly ^ Asp, 183 Pro ^ Leu, 222 Asp ^ Asn. Except for the Japan biovar bacteria, in all strains of the Holarctic subspecies there are two stop codons in the gene ctu.
The bacteria of the subspecies novicida contain the ctu gene only in the strain 3523, whereas the other strains contain the gene FTN_0827 encoding the C-N hydrolase, which probably provides the citrullinureidase activity.
Key words: Francisellа, citrullinureidase, С-N hydrolase, enzymatic activity
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 579.852.11:579.252].034.1
Микшис Н.И., Каштанова Т.Н., Кутырев В.В.
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ BAcILLUS ANTHRAcIS И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИ РОДСТВЕННЫХ ВИДОВ, ОСНОВАННЫЙ НА ВЫЯВЛЕНИИ
различий в структуре хромосомных генов биосинтеза флагеллина
И МЕТИОНИНА
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора», 410005, г. Саратов
В процессе анализа нуклеотидных последовательностей ряда генов, ответственных за экспрессию отличительных признаков сибиреязвенного микроба - подвижности и пенициллиназной активности, выявлен хромосомный локус, перспективный для межвидовой дифференциации. Установлено, что в гене fliC, детерминирующем синтез флагеллина, присутствует протяженная область, отличающая возбудителя сибирской язвы от большинства непатогенных и условно-патогенных бацилл. Предложен оригинальный способ индикации и идентификации сибиреязвенного микроба, основанный на выявлении различий в структуре хромосомных генов fliC и hom2. С использованием двух хромосомных ДНК-мишеней тестировано 60 штаммов различных бациллярных видов - B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. megaterium, B. subtilis и др. Разработанный алгоритм позволяет выявлять патогенный микроорганизм и надежно дифференцировать его от представителей других видов рода Bacillus. Введение в условия мультиплексной ПЦР праймеров, комплементарных специфичным последовательностям плазмид pXO1 и pXO2, предоставляет дополнительную информацию о предполагаемой вирулентности изолята.
К л юче вые слова : Bacillus anthracis; подвижность; фла-геллин; хромосомные ДНК-мишени; мультиплексная ПЦР.
В Российской Федерации насчитывается несколько тысяч стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов. Несмотря на достаточно эффективные противоэпидемические и профилактические мероприятия, ежегодно регистрируются случаи инфицирования людей этим особо опасным заболеванием [1]. Возбудитель сибирской язвы - грамположительная спорообразующая бактерия, принадлежащая к роду Bacillus. В наиболее близком филогенетическом родстве с Bacillus anthracis состоят виды B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides и B. weihenstephanensis. Сходство генетических, морфологических и физиологических характеристик позволяет выделить их в особую таксономическую группу [2].
Одним из признаков, отличающих штаммы B. anthracis от представителей других видов рода Bacillus, является наличие плазмид pXO1 и pXO2. Практически все отечественные и зарубежные тест-системы, предназначенные
для молекулярной диагностики сибиреязвенного микроба, основаны на выявлении в первую очередь последовательностей плазмидных генов. Однако бактериальные плазми-ды являются менее стабильными генетическими элементами, чем хромосомная ДНК, и могут с разной частотой элиминироваться. Необходимо также учитывать, что в исключительных случаях репликоны, идентичные pXO1 и pXO2, обнаруживают и у штаммов близкородственных бациллярных видов. Как правило, их выделяют от людей или животных с симптомами заболевания, напоминающего сибирскую язву [3-5].
Достоверность индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы повышается при использовании мультиплексных ПЦР с праймерами на фрагменты плаз-мидных и хромосомных генов. Ранее ввиду высокой гомологии хромосомных ДНК возбудителя сибирской язвы и отдельных представителей близкородственных видов, межвидовую дифференциацию проводили преимущественно на основании полиморфизма единичных нуклеотидов [6-9]. В ряде случаев обнаружение штаммов B. cereus или B. thuringiensis, содержащих идентичные с B. anthracis последовательности полиморфных генов, ставило под сомнение уникальность выявленных ДНК-мишеней [10, 11].
Осуществляемые в последнее десятилетие работы по секвенированию геномов патогенных микроорганизмов расширяют потенциальные возможности их молекулярной диагностики. В частности, сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей бациллярных штаммов позволил разработать специфичные мультиплексные ПЦР для обнаружения возбудителя сибирской язвы в биологическом материале и пробах из окружающей среды [12, 13]. С использованием современных технологий в геноме B. anthracis удалось выявить относительно протяженные участки хромосомной ДНК, отличающие возбудителя сибирской язвы от других видов рода Bacillus. Так, в кодирующем АТФ-синтазу гене
yeaC сибиреязвенного микроба обнаружена делеция 72 п.н. [14], а в гене hom2, детерминирующем один из ферментов метаболизма метионина, - делеция 42 п.н. [15]. Тем не менее поиск эффективных ДНК-мишеней для генодиагностики возбудителя сибирской язвы и дифференциации его от непатогенных и условно-патогенных бацилл не теряет своей актуальности.
Цель настоящего исследования - выявить различия в структуре хромосомных генов, кодирующих признаки, отличающие B. anthracis от других бациллярных видов; изучить возможности использования новых ДНК-мишеней при разработке способов индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы. В работе использовали штаммы B. anthracis: М29, 81/1, И-29, И-302, СТИ-1, Sterne 34F2, 55, Их-тиман, Wright, Pasteur, 17JB, 2-я вакцина Ценковского; кроме того, изогенные производные штамма B. anthracis 81/1: КМ35 (pXO1+pXO2-), KM34 (pXO1-pXO2+), KM86/6 (pXO1-pXO2-); штамма B. anthracis Sterne 34F2: KM89 (pXO1+pXO2-), KM90 (pXO1-pXO2-); штамма B. anthracis 55: KM92 (pXO1+pXO2-), KM92/3 (pXO1-pXO2-), KM97 (pXO1-pXO2-pUB110nA-1+(pag)), штамма B. anthracis СТИ-1: KM91 (pX01-pX02"). В ПЦР также тестировали штаммы B. cereus: 569, 336, 8, 104, 108, 504, 687 var. alb.; штаммы B. thuringiensis: 2090, 8a, 482-3, 482-7, 15a, 351, 17/5, 13 M, 48, 69/6, HD-1 s. kurstaki, v. tompsoni 18B, v. tompsoni 11M, v. tolworti, s. israelensis, 10M v. finitimus, 35 v. galeria; штаммы B. subtilis: 36, 37, 350, 33, IE-4; B. mycoides 2, 10; B. megaterium 1, 3; B. pseudoanthracis 103, 104; B. anthracoides 9, 1312 и штаммы B. mesentericus 6, B. fluorescens B-688.
Все штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий (ГКПБ) (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», Саратов).
Питательные среды. Выращивание бациллярных штаммов осуществляли в/на бульоне и агаре BHI («Difco», США), бульоне и агаре Хоттингера (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», Саратов).
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов. Анализ путей биосинтеза флагеллина осуществляли с использованием базы данных KEGG Metabolic Pathways. Анализ нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих компоненты бактериального жгутика и b-лактамазу, проводили с применением алгоритма BLAST и программного обеспечения MEGA 4,0. Сравнивали последовательности изучаемых генов у представленных в базе данных NCBI GenBank бациллярных штаммов: B. anthracis Ames, Ames 0581, Sterne, CDC 684, A0248, H9401; B. cereus ATCC 14579, ATCC 10987, ZK, AH187, B4264, AH820, G9842, Q1, 03BB102, NC7401, FRI-35; B. thuringiensis 97-27, Al Hakam, BMB171, HD-771, serovar kurstaki HD73, serovar finitimus YBT-020; B. weihenstephanensis KBAB4_4052, B. licheniformis ATCC 14580, DSM13; B. megaterium QM B1551, DSM 319; B. subtilis subsp. spizizenii, BSU35150, BSn5.
Расчет праймеров. Праймеры рассчитывали в программе Vector NTI9, анализировали с помощью компьютерной программы BLAST на web-сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/) для подтверждения их специфичности и отсутствия гомологии с нуклеотидными последовательностями штаммов бациллярных видов, присутствующих в базах данных (GenBank, EMBL, DDBJ). В работе использовали оригинальные праймеры на гены hom2 и fliC, имеющие следующие последовательности - fliC-F: 5'-TGGAGCAGTAACAATTGG-3', fliC-R: 5'-GCACCACTGATAGAAATGTTAG-3' (размер продукта амплификации 165 п.н.), hom2-F: 5'-GACGTGTTAAAAGAAGCCCA-3', hom2-R: 5'-CACCAATTTCGTCTTTTACA-3' (размер продукта амплификации 550 п.н.); hom1113-F: 5'-AGATGTGAAGGTAA AAGGGA-3'; hom1113-R: 5'-CATAATCAGCAAGAGAAGCA-3' (размер продукта амплификации для штаммов B. anthracis - 509 п.н., для штаммов других бациллярных видов - 551 п.н.). Оли-гонуклеотидные праймеры синтезировали в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» на автоматическом синтезаторе ДНК «АСМ-800» (Биосет, Россия). Для постановки мультиплексной ПЦР использовали также праймеры на последовательности плазмид-ных генов pagA и capA, - pag67/68-F, pag67/68-R, cap57/58-F, cap57/58-R [16].
Выделение ДНК из биологического материала, предварительно обеззараженного по стандартной методике, проводили в соответствии с МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-IV групп патогенно-сти» (М., 2009) с использованием «Набора реагентов для подготовки проб (выделения ДНК)» (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»).
Условия проведения полимеразной цепной реакции. Полиме-разную цепную реакцию осуществляли на программируемом термостате Терцик («ДНК-Технология», Москва) по стандартной методике (МУ 1.3. 2569-09). Амплификацию фрагментов хромосомных генов hom2 и fliC проводили по схеме: один цикл 94 °С в течение 5 мин, 30 циклов при 94 °С - 30 с, 58 °С - 30 с, 72 °С - 30 с, и завершающий цикл - 3 мин при 72 °С. Аналогичные режимы соблюдали в мультиплексной ПЦР с праймерами на последовательности хромосомных и плазмидных генов. Для постановки ПЦР с парой праймеров - hom1113-F и hom1113-R, использовали следующую схему: один цикл 94 °С в течение 4 мин, 35 циклов при 94 °С - 15 с, 56 °С - 20 с, 72 °С - 15 с и завершающий цикл 3 мин при 72 °С.
Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов проводили в 2 % агарозном геле в горизонтальной камере («Bio-Rad», США) относительно стандарта маркеров молекулярных масс «О' GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder Plus redy-to-use» («Fermentas», Литва). Результаты учитывали визуально в ультрафиолетовом свете на основании наличия или отсутствия амплифицирован-ных фрагментов соответствующего размера.
Определение нуклеотидных последовательностей генов проводили на генетическом анализаторе модели CEQ 8000 («Beckman Coulter», США) по методу Сэнгера. Сравнение нуклеотидных последовательностей штаммов, представленных в базе данных NCBI GenBank и полученных из ГКПБ, осуществляли с использованием алгоритма BLAST и программного обеспечения Mega 4,0.
Результаты исследования
С целью выявления специфичных для возбудителя сибирской язвы хромосомных мутаций на первом этапе исследования осуществили сравнение in silico нуклеотидных последовательностей ряда генов, ответственных за экспрессию отличительных признаков - пеницилли-назной активности и подвижности. В генах, кодирующих b-лактамазу (blal и bla2) не выявлено синонимичных и несинонимичных замен, делеций или вставок, характерных только для B. anthracis. Перспективный для межвидовой дифференциации локус был обнаружен нами в гене fliC, детерминирующем синтез флагеллина - главного компонента бактериального жгутика.
Флагеллин синтезируется в большом количестве у всех жгутиковых бактерий. Структуру и функцию бактериального жгутика кодирует около 50 генов. Сибиреязвенный микроб, как известно, не обладает подвижностью. Часть генов, ответственных за подвижность и хемотаксис у возбудителя сибирской язвы, содержат мутации со сдвигом рамки считывания, в их числе fliF, fliN, fliM, flgL, flhH [5]. Отличительной особенностью B. anthracis является также наличие только одного гена fliC, детерминирующего синтез флагеллина. Представленные в базах данных KEGG и NCBI GenBank штаммы других бациллярных видов, как правило, имеют от двух до четырех подобных генов. Существенным для межвидовой дифференциации возбудителя сибирской язвы оказалось то обстоятельство, что область с 409 по 640 п. н. от начала гена fliC является высокоспецифичной. Компьютерный анализ показал, что данная последовательность нуклеотидов уникальна и характерна только для штаммов B. anthracis.
На следующем этапе с использованием праймеров, фланкирующих участок хромосомного генаfliC от 417 до 581 п. н., провели тестирование 12 штаммов B. anthracis, 8 - B. cereus и 17 - B. thuringiensis. Образование амплифи-цированного фрагмента размером 165 п. н. отмечали в образцах с ДНК всех исследованных штаммов сибиреязвен-
ного микроба, что свидетельствовало о наличии у них комплементарных последовательностей. При исследовании генетического материала из штаммов близкородственных видов амплификации не происходило. Регистрируемое в некоторых случаях неспецифичное взаимодействие было устранимо при изменении условий проведения ПЦР - повышении температуры отжига праймеров и снижении концентрации магния. Сравнение результатов секвенирова-ния амплифицированного фрагмента ДНК B. anthracis СТИ-1 с нуклеотид-ными последовательностями генаfliC присутствующих в NCBI GenBank бациллярных штаммов подтвердило наличие протяженного специфичного участка в установленных рамках.
Отличать штаммы возбудителя сибирской язвы от представителей близкородственных видов рода Bacillus позволяет также выявленная нами ранее мутация в хромосомном гене hom2, кодирующем фермент го-мосериндегидрогиназу [15]. Предположительно она могла возникнуть на ранних эволюционных этапах формирования B. anthracis в качестве самостоятельного вида, вследствие чего ее можно рассматривать как видоспецифичный генетический маркер. Если сравнивать геномы наиболее близких в филогенетическом отношении видов, то в позициях с 1042 по 1083 от начала этого гена в штаммах B. anthracis отсутствует участок протяженностью в 42 нуклеотида. Фенотипическим проявлением мутации является абсолютная зависимость роста всех штаммов сибиреязвенного микроба от присутствия в среде метионина, что не характерно для других бациллярных видов.
Первоначально были рассчитаны праймеры, фланкирующие вариабельную область гена hom2. В этом случае в ПЦР с образцами ДНК штаммов B. anthracis образовывался ампликон размером 509 п.н., а с образцами ДНК штаммов других бациллярных видов - 551 п.н. Однако ввиду относительно небольшой протяженности делеции в гене hom2, для формата ПЦР с электрофоретическим учетом результатов логичнее использовать альтернативный алгоритм. Он предполагает наличие последовательности одного из праймеров, приходящейся на область делеции. По этой схеме в ПЦР с образцами, выделенными из штаммов возбудителя сибирской язвы, продукт амплификации не образуется. Тестирование коллекционных бациллярных штаммов с рассчитанными таким образом праймерами дало ожидаемые результаты. В образцах, содержащих генетический материал из штаммов B. anthracis, при электрофоретическом исследовании продуктов ПЦР ни в одном из случаев не регистрировали специфичный ответ. В то же время для исследованных штаммов близкородственных бактериальных видов B. cereus и B. thuringiensis было характерно образование амплифицированного фрагмента размером 550 п.н.
Наиболее информативно совместное использование хромосомных ДНК-мишеней на вариабельные нуклео-тидные последовательности генов fliC и hom2. Под эту задачу оптимизировали условия ПЦР, после чего тестировали 60 бациллярных штаммов. Список включал 21 штамм B. anthracis, 7 - B. cereus, 17 - B. thuringiensis, 2 - B. mycoides, 2 - B. megaterium, 5 - B. subtilis, 2 - B. anthracoides, 2 - B. pseudoanthracis и по одному - B.
Рис. 1. Результаты ПЦР-анализа образцов ДНК бациллярных штаммов с праймерами на
фрагменты генов fliC и hom2.
Образцы, полученные из штаммов: 1 - B. anthracis Pasteur; 2 - B. anthracis 55; 3 - B. anthracis Ихтиман; 4 - B. anthracis И-29; 5 - B. anthracis И-302; 6 - B. anthracis Sterne 34F2; 7 - B. anthracis СТИ-1; 8 - B. anthracis 81/1; 9 - B. anthracis М29; 10 - B. anthracis 2-я вакцина Ценковского; 12 - B. thuringiensis HD-1 s. kurstaki; 13 - B. thuringiensis 2090; 14 - B. thuringiensis 69/6; 15 - B. cereus 569; 16 - B. cereus 108; 17 - B. cereus 8; 18 - B. pseudoanthracis 104; 11 - маркеры молекулярных масс. Размеры амплифицируемых фрагментов с праймерами на последовательности генов: fliC - 165 п.н., hom2 - 550 п. н.
mesentericus, В. Аио^сет. Всю панель штаммов исследовали в 3 повторах опыта.
В результате в ПЦР с образцами ДНК всех взятых в эксперимент штаммов В. ап^га^ регистрировали исключительно продукт амплификации размером 165 п.н., что подтверждает наличие специфичной последовательности в хромосомном гене АС и делеции в гене Иот2
Рис. 2. Результаты мультилокусной ПЦР с праймерами на фрагменты хромосомных и плазмидных генов - fliC, hom2, pagA и capA.
Образцы, полученные из штаммов: 1 - B. anthracis 81/1; 2 -B. anthracis КМ35 (pXO1+pXO2-); 3 - B. anthracis KM34 (pXO1-pXO2+); 4 - B. anthracis KM86/6 (pXO1-pXO2-); 5 - маркеры молекулярных масс; 6 - B. thuringiensis 8а; 7 - B. thuringiensis v. tompsoni 18B; 8 - B. thuringiensis v. tompsoni 11M; 9 - B. thuringiensis v. tolworti. Размеры амплифицируемых фрагментов с праймерами на последовательности генов: fliC - 165 п.н., hom2 - 550 п. н., pagA (pXO1) - 747 п. н., capA (pXO2) - 264 п. н.
(рис. 1). При исследовании образцов ДНК штаммов других бациллярных видов, напротив, характерным ответом была амплификация фрагмента размером 550 п.н., свидетельствующая об интактном гене hom2. В пробах, полученных из штаммов B. cereus 108; B. thuringiensis HD-1 s. kurstaki, 2090, 69/6; B. megaterium 1 и 3, в отдельных повторах опыта на уровне электрофоретиче-ской подвижности, соответствующей размеру 165 п.н., отмечали слабо выраженный сигнал. По-видимому, коррекция праймеров позволит устранить отмеченную двойственность. Во всех случаях достоверным отличием от штаммов вида B. anthracis являлось присутствие амплифицированного продукта размером 550 п.н.
Включение в состав реакционной смеси праймеров на фрагменты плазмидных генов еще более повышает специфичность и расширяет функциональность мультиплексной ПЦР за счет дополнительной возможности определения принадлежности выделенного штамма B. anthracis к вирулентным, вакцинным или атипичным вариантам. В связи с этим мы протестировали эффективность совместного использования ДНК-мишеней, выявляющих специфичные последовательности хромосомных генов fliC, hom2 и плазмидных детерминант pagA, capA. Исследование проводили на той же панели бациллярных штаммов, включающей изогенные производные B. anthracis различного плазмидного состава. На рис. 2 представлены результаты мультиплексной ПЦР с образцами ДНК диплазмидного (pXO1+pXO2+), моно-плазмидных (pXO1+pXO2- и pXO1-pXO2+) и бесплазмид-ного (pXO1pXO2) штаммов B. anthracis и нескольких штаммов B. thuringiensis. Во всех пробах с ДНК сибиреязвенного микроба происходила амплификация с праймерами на специфичные последовательности гена fliC и, в зависимости от плазмидного состава - с прай-мерами на фрагменты генов pagA (pXO1) и capA (pXO2). Различия в структуре хромосомных генов позволяют выявлять возбудителя сибирской язвы и проводить его межвидовую дифференциацию, а наличие плазмидных детерминант дает сигнальную информацию о потенциальной вирулентности изолята.
Таким образом, обнаружен хромосомный локус, перспективный для дифференциации B. anthracis от непатогенных и условно-патогенных бацилл. У штаммов сибиреязвенного микроба в гене fliC, кодирующем синтез флагеллина, присутствует протяженная последовательность, характерная только для данного вида. Кроме того, штаммы B. anthracis характеризуются отсутствием части нуклеотидов в одном из генов, детерминирующих ферменты промежуточного метаболизма метионина. На основании различий в структуре хромосомных генов fliC и hom2 возможна разработка мультилокусных ПЦР различного формата - с электрофоретическим учетом результатов и с учетом результатов в режиме реального времени. Введение праймеров, комплементарных фрагментам плазмидных генов, расширяет функциональность способа выявления патогенного микроорганизма в биологическом материале и объектах окружающей среды и дифференциации его от представителей других видов рода Bacillus.
Сведения об авторах:
Микшис Наталья Ивановна; e-mail: rusrapi@microbe. ru, 410005, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46;
Каштанова Татьяна Николаевна; e-mail: rusrapi@micro-be.ru;
Кутырев Владимир Викторович; e-mail rusrapi@micro-be.ru.
ЛИТЕ РА Т У РА/REFERENCES
1. Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Буравцева Н.П., Цыганкова О.И., Аксенова Л.Ю., Антюганов С.Н. и др. Анализ заболеваемости сибирской язвой в 2012 г., прогноз на 2013 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2013; 1: 18-20.
Eremenko E.I., Ryazanova A.G., Buravtseva N.P., Tsygankova O.I., Ak-senova L.Yu., Antyuganov S.N. et al. Analysis of the incidence of anthrax in 2012, the forecast for 2013. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2013; 1: 18-20. (in Russian)
2. Tourasse N., Helgason E., Okstad O., Hegna I., Kolsto A. The Bacillus cereus group: novel aspects of population structure and genome dynamics. J. Appl. Microbiol. 2006; 101: 579-93.
3. Avashia S., Riggins W., Lindley C., Hoffmaster A., Drumgoole R., Neko-moto T. et al. Fatal pneumonia among metalworkers due to inhalation exposure to Bacillus cereus containing Bacillus anthracis toxin genes. Clin. Infect. Dis. 2007; 44: 414-6.
4. Hoffmaster A., Ravel J., Rasko D., Chapman G., Chute M., Marston C. et al. Identification of anthrax toxin genes in a Bacillus cereus associated with an illness resembling inhalation anthrax. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101: 8449-54.
5. Klee S., Brzuszkiewicz E., Nattermann H., Brüggemann H., Dupke S., Wollherr A. et al. The genome of a Bacillus isolate causing anthrax in chimpanzees combines chromosomal properties of B. cereus with B. anthracis virulence plasmids. PLoS One. 2010; 5(7): e10986.
6. Easterday R., Van Ert M., Simonson T., Wagner D., Kenefic L., Allender C., Keim P. Use of single nucleotide polymorphisms in the plcR gene for specific identification of Bacillus anthracis. J. Clin. Microbiol. 2005; 43 (4):1995-7.
7. Hurtle W., Bode E., Kulesh D., Kaplan R., Garrison J., Bridge D. et al. Detection of the Bacillus anthracis gyrA gene by using a minor groove binder probe. J. Clin. Microbiol. 2004; 42: 179-85.
8. Patra G., Sylvestre P., Ramisse V., Thérasse J., Guesdon J. Isolation of a specific chromosomic DNA sequence of Bacillus anthracis and its possible use in diagnosis. FEMSImmunol. Med. Microbiol. 1996; 15: 223-31.
9. Qi Y., Patra G., Liang X., Williams L., Rose S., Redkar R., DelVecchio V. Utilization of the rpoB gene as a specific chromosomal marker for real-time PCR detection of Bacillus anthracis. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67(8): 3720-7.
10. Patra G., Vaissaire J., Weber-Levy M., Le Doujet C., Mock M. Molecular characterization of Bacillus strains involved in outbreaks of anthrax in France in 1997. J. Clin. Microbiol. 1998; 36: 3412-4.
11. Zasada A., Gierczynski R., Raddadi N., Daffonchio D., Jagielski M. Some Bacillus thuringiensis strains share rpoB nucleotide polymorphisms also present in Bacillus anthracis. J. Clin. Microbiol. 2006; 44: 1606-7.
12. Irenge L., Durant J., Tomaso H., Pilo P., Olsen J., Ramisse V. et al. Development and validation of a real-time quantitative PCR assay for rapid identification of Bacillus anthracis in environmental samples. Appl. Mi-crobiol. Biotechnol. 2010; 88: 1179-92.
13. Wielinga P., Hamidjaja R., Âgren J., Knutsson R., Segerman B., Fricker M. et al. A multiplex real-time PCR for identifying and differentiating B. anthracis virulent types. International J. Food Microbiol. 2011; 145: 137-44.
14. Ahmod N., Gupta R., Shah H. Identification of a Bacillus anthracis specific indel in the yeaC gene and development of a rapid pyrosequencing assay for distinguishing B. anthracis from the B. cereus group. J. Microbiol. Methods. 2011; 87: 278-85.
15. Микшис Н.И., Живова Ю.Н., Новикова Л.В., Шарапова Н.А., Попов Ю.А., Кутырев В.В. Определение различий в структуре генов биосинтеза метионина у штаммов Bacillus anthracis и филогенетически родственных видов. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012; 2: 21-5.
Mikshis N.I., Zhivova Yu.N., Novikova L.V., Sharapova N.A., Popov Yu.A., Kutyrev V.V. Identification of the differences in the genes responsible for methionine biosynthesis in Bacillus anthracis strains and phylogeny-related species. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2012; (2): 21-5. (in Russian)
16. Ramisse V., Patra G., Garrigue H., Guesdon J., Mock M. Identification and characterization of Bacillus anthracis by multiplex PCR analysis of sequences on plasmids pXO1 and pXO2 and chromosomal DNA. FEMS Microbiol. Letters. 1996; 145: 9-16.
Поступила 16.12.13 Received 16.12.13
A METHOD FOR DIFFERENTIATION OF BACILLUS ANTHRACIS STRAINS AND PHYLOGENETI-CALLY RELATED SPECIES BASED ON DETERMINATION OF THE STRUCTURAL DIFFERENCES BETWEEN CHROMOSOMAL GENES FOR BIOSYNTHESIS OF FLAGELLIN AND METHIONINE Mikshis N. I., Kashtanova T. N., Kutyrev V. V.
Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Federal Service
for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, Saratov, Russia
Nucleotide sequence analysis of several genes responsible for the anthrax pathogen definitive properties - motility and penicillinase activity - determined a chromosomal locus promising for interspecies differentiation. We demonstrated that the gene fliC encoding flagellin synthesis contains extended region, distinguishing B. anthracis strains from the majority of non-pathogenic and opportunistic bacilli. A novel method for the anthrax pathogen indication and identification based on determination of the differences in the chromosomal genes fliC and hom2 structure was suggested. A total of 60 strains of different Bacillus spp. (B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis; B. mycoides,
B. megaterium, B. subtilis, etc.) were tested using two chromosomal DNA targets. The algorithm developed in this work permits to detect the pathogenic microorganism and reliably differentiate it from other Bacillus spp. representatives. The introduction of primers complementary to specific sequences of pXOl and pXQ2 plasmids into the multiplex PCR makes it possible to receive additional information on proposed virulence of the isolate. Key words: Bacillus anthracis; motility; flagellin; chromosomal DNA targets; multiplex PCR.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 616.98:578.833.41]-078.33
Петрова И.Д.1, Петров В.С.1, Серегин С.В.1, Малкова Е.М.2
ОПЫТ ВЫЯВЛЕНИЯ МАРКЕРОВ КРАСНУШНОЙ ИНФЕКЦИИ ВО ВРЕМЯ ЛОКАЛЬНЫХ ВСПЫШЕК НА ТЕРРИТОРИИ зАПАДНОЙ СИБИРИ
Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»), 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская обл. ; ^Государственное автономное учреждение образования Новосибирский центр повышения квалификации работников здравоохранения, 630087,
Новосибирск, ул. Немировича-Данченко 126
Представлен анализ результатов обследования образцов от 75 пациентов на наличие вируса краснухи, вирусной РНК, специфических антител. Для всех образцов выявляемость РНК была выше, чем изоляция вируса. Установлено, что из каждого шестого клинического образца не удалось изолировать вирус краснухи при наличии в нем вирусной РНК. Определены первичные структуры участка (с 8072-го по 8291-й нуклеотид) генома вируса краснухи из 14 образцов. В данной работе показано, что все образцы вируса краснухи относятся к первому генотипу, подгруппам Щ а также с большой долей вероятности к подгруппам 1а и №. Впервые показана циркуляция вируса краснухи первого генотипа как до начала массовой вакцинации на территории Западной Сибири, так и после.
Ключевые слова: краснуха; вирус краснухи; вирусная РНК; ОТ-ПЦР; филогенетический анализ; генотип.
Социальная значимость краснухи обусловлена повсеместным распространением инфекции и тератогенным действием вируса - способностью формировать врожденные дефекты развития, приводящие к инвалидности или смертельному исходу у новорожденных. Краснуха встречается у людей, живущих на всех континентах, и, несмотря на успехи программ вакцинации населения в экономически развитых странах, еще встречаются локальные вспышки этой болезни [1, 2].
Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) придает важное значение молекулярной эпидемиологии краснухи. Оценка эффективности вакцинации включает серологический мониторинг состояния коллективного иммунитета к краснухе, выделение и генотипирование циркулирующего вируса [3]. Изучение вариабельности генома вируса краснухи (ВК) в нашей стране до настоящего времени проводится недостаточно интенсивно.
ВОЗ для изучения эпидемиологии и этиологии краснухи рекомендует проводить изоляцию вируса [4]. Изоляция ВК - это длительный и дорогостоящий процесс. Отсутствие цитопатического действия ВК во многих культурах клеток делает сложным подтверждение роста вируса. Обычно для этого используют выявление вирусной РНК в зараженной культуре методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Некоторые авторы предпринимают попытки найти более быстрый и простой способ для первичного генотипирования ВК [5].
Для подтверждения диагноза краснухи можно использовать следующие маркеры: 1) РНК ВК, 2) выделенный на культуре клеток ВК, 3) антитела классов ^М и
IgG. Для генотипирования вируса определяется нуклео-тидная последовательность участков вирусного генома.
В настоящем исследовании изучение краснухи проводили во время локальных вспышек краснухи в период 1998-2001 гг. в Новосибирске и 2004-2006 гг. в Западной Сибири.
Материалы и методы
Образцы от пациентов с диагнозом краснухи собраны на территории Западной Сибири России. Забор образцов осуществляли с письменного согласия пациентов и в соответствии с требованиями этического комитета ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Все клинические образцы хранили замороженными при -70°С вплоть до проведения лабораторных исследований.
Для обнаружения специфических антител и определения индекса авидности IgG использовали стандартный им-муноферментный анализ (ИФА) с применением тест-систем: «ВектоРубелла-IgG», «ВектоРубелла-IgM», «ВектоРубелла-IgG-авидность» (ФСП 42-0117-4696, 42-0117-4694-03 и 42-01174695-03, соответственно) производства ЗАО «Вектор-Бест» (Кольцово, Новосибирская область).
Для обнаружения генетического материала ВК в клинических образцах из 200 мкл биологической жидкости выделяли суммарную РНК с использованием набора «Вектор РНК-экстракция» производства ЗАО «Вектор-Бест». Для проведения ОТ-ПЦР использовали специфические праймеры, разработанные нами для диагностики краснухи [6, 7].
Для выявления ВК в клинических образцах проводили заражение клеток Vero биологическими жидкостями (кровь, моча и носоглоточный смыв - н-г.смыв) по описанной ранее методике [8] и проводили 2 пассажа. Выделение вирусной РНК из культу-ральной жидкости проводили с использованием того же набора, что и в случае клинических образцов.
ДНК нужного размера вырезали из геля и очищали с использованием набора Q-Biogene GeneCleanIII extraction kit (Carlsbad, California, США) согласно приложенным инструкциям. Определение нуклеотидных последовательностей полученных фрагментов проводили на автоматическом анализаторе Beckman СЕQ 2000XL при помощи набора CEQ2000 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (оба «Beckman Coulter», «Fullerton», California, USA) согласно инструкциям производителя. Реакцию секвени-рования проводили по обеим цепям.
Установленные в этой работе нуклеотидные последовательности опубликованы в базе данных GenBank под номерами JX846963-JX846965 и KC255389- KC255399.
Для множественного выравнивания нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали программы BioEdit v.7.0 [9] и ClustalX v.1.8 [10].
