CC BY
20
УДК 6.16-002.5-053.2-07
Власенко В.В., д. б. н.,професор, Власенко 1.Г., к. б. н., доцент, Буравшський В.П., астрант, Березовський 1.В., асистент © ВЫницький державный аграрный утверситет
СУЧАСН1 П1ДХОДИ ВЕТЕРИНАРНО - САН1ТАРНО1 ЕКСПЕРТИЗИ ТУШ ТА ОРГАН1В ПРИ ЛАТЕНТН1Й ФОРМ1 ТУБЕРКУЛЬОЗУ ТВАРИН
Показаний цикл розвитку збудника туберкульозу в кровг та запропоновано новий високоспециф1чний експрес-метод для виявлення мтобактерш туберкульозу (МБТ) у мазках катлярног кровг з наступним бактерюлог1чним тдтвердженням шляхом видыення чистог культури МБТ за 2-5 д1б. Цей метод дае можливкть виявити збудник туберкульозу на раншй стадИ захворювання, коли загальноприйнятою методикою вгн ще не д1агностуеться.
Ключо^^ слова: тварина, кров, м'ясо, збудник туберкульозу, ветеринарно- сантарна експертиза
Вщомо, що для багатьох антропозоонозих захворювань шнуе бюлопчний ланцюг "тварина - м'ясопродукти - людина", тобто при недостатньому контролi продукти харчування тваринного походження уражеш збудником туберкульозу можуть передавати збудника (шфекщю) людям.
Через захворювання на туберкульоз тварин вибраковуються значна кшьюсть тонн м'яса та м'ясопродукив.
Особливо критична ситуащя склалася з ощнкою якостi м'яса вщ тубiнфiкованих тварин на територiях, забруднених радiонуклiдами. Для визначення захворювання тварин на туберкульоз проводять туберкулiнодiагностику (туберкулмзацш). Як вiдомо, туберкулiн е алергеном, який виготовляють з високовiрулентного (патогенного) штаму збудника туберкульозу. За повщомленням фахiвцiв ветеринарно! медицини Ю. Колоса ( кандидат вет. наук), О. Якубчак та В. Хоменко (доктори вет. наук, професори), М. Зелшського ( головний спещалшт Держдепартаменту вет. медицини), а також В. Титаренко (заступник директора Держптаховетцентр м. Кшв) та шших, цитую: «Туберкулш е алергеном, тобто при потраплянш у сенсибшзований органiзм викликае певну алерпчну реакцiю. Щоб вона була специфiчною, в алергенi (туберкулiнi) повиннi бути частки кл^ини збудника туберкульозу. Крiм того, в даному препаратi можуть бути фшьтрувальш форми мiкобактерiй. Для того щоб вони не розвивалися i не переходили у вегетативш форми, до препарату додають консерванти (фенол, глщерин тощо). Отже, такий препарат е специфiчним алергеном. Якщо вивiльнити його вiд фiльтрувальних форм мжобактерш та залишкiв розпаду кл^ин, то вiн втратить свою специфiчнiсть i буде непридатним до використання». Природно, що,
© Власенко В.В., Власенко 1.Г., Буравшський В.П., Березовський 1.В., 2008
33
нейтралiзувавши консервант та провiвши поави на спещальт високочутливi середовища — ВКГ зi стимулятором росту чи шше специфiчне i високочутливе — можна досягти реверси фшьтрувальних форм у вегетативну форму мiкобактерiй [1].
Отже, як повщомляють автори [1], при туберкулiнодiагностицi тварин, в оргашзм вводять фiльтруючi форми вiрулентного збудника туберкульозу.
За даними Б. М. Пухлика [2], в 1996 рощ у Вшницькш областi проведено 331439 туберкулiнодiагностичних проб у дiтей i при цьому виявлено 2 хворих дитини, де вартiсть виявлення одного випадку туберкульозу склала 24850 ум. од. Ця картина е типовою для вае1 Украши, адже при щорiчному мвиконаннi плану" по туберкулшовим пробам швидкими темпами зростае захворювашсть. Це означае, що е потреба переглянути технологiю масово! туберкулiнодiагностики, яка застосовуеться в нашш кра!ш. Чому так виходить? Однiею iз найважливших причин прогресуючого поширення туберкульозу е застарше уявлення про бiологiю розвитку збудника та застосування туберкулiнодiагностики в тваринницга, яка не може виявити всiх хворих на туберкульоз тварин [2]. У зв'язку з ол^обациляршстю та адаптивнiстю форм збудника туберкульозу [3-6], велико! гостроти набула проблема своечасного виявлення збудника туберкульозу у харчовш сировиш тваринного походження. Вона водночас вщдзеркалюе й основш проблеми, що суттево впливають на захворювашсть та смертшсть людей вiд туберкульозу. О^м економiчноl шкоди з причин вибракування харчових продукив iснують i iншi. Так, сотнi тисяч людей хворшть на туберкульоз, 30-40% школярiв, 50-70% пiдлiткiв i молодi та доросле населення складае групу тдвищеного ризику з ще! небезпечно! хвороби. Отже, проблема туберкульозу в Укра1ш - це пол^ика, це -нащональна безпека, це - економжа, це проблема вЫе! наци.
Метою роботи було вивчити стадп розвитку збудника туберкульозу в системi кровi з метою розробки мiкроскопiчного дiагностичного тесту при проведеннi ветеринарно - саштарно! оцiнки харчово! тваринницько! сировини при латентнш формi туберкульозу.
Матер1ал та методи дослщження. Оскiльки мжроскотя е найбiльш доступним та швидким методом виявлення мiкобактерiй, нами було проведене всебiчне вивчення бюлогп збудника туберкульозу на рiзних поживних середовищах (рiдке, щiльне) iз застосуванням рiзних умов шкубаци, приготування мазкiв з отриманих культур та 1х мжроскопування. Матерiалом дослiдження була кров хворих на туберкульоз людей та тварин. Отриманий мазок кровi висушували. Висушеш мазки кровi спочатку фiксували, а поим фарбували або проводили фшсащю одночасно з фарбуванням. Для фшсацл використовували:
а) метиловий спирт хiмiчно чистий, 3-5 хв.;
б) метиловий спирт i ацетон у рiвних частинах, 3-5 хв.;
в) сумш Никифорова (етиловий спирт ректифiкат i ефiр порiвну), 10-20 хв.;
г) 1% осмiева кислота;
д) абсолютний етиловий спирт, 20-30 хв.
34
Дуже добре фжсуються мазки кровi таким розчином: 5 г арчанокислого цинку та 5 г хiмiчно чистого хлористого натрш всипати у мiрний цилшдр або в колбу на 100 мл i добавити до м^ки дистильовано! води. У цьому розчинi мазки фiксують 2-3 хв., пiсля чого !х зразу фарбують.
Для фарбування мазкiв кровi готову фарбу, що надходить у продаж розводили дистильованою водою, обов'язково нейтрально! реакци, iз розрахунку 1-2 краплi на 1 мл води безпосередньо перед фарбуванням (вщ тривалого зберiгання розчин фарби псуеться). Розводили фарбу iз розрахунку, приблизно 2,5-3 мл на мазок. Наливали у призначений для цього чистий цилiндр необхщну кiлькiсть дистильовано! води й пшеткою або крапельницею добавляли у воду стшьки крапель фарби, скшьки мiлiлiтрiв води взято, iз розрахунку 1 крапля на 1 мл. Якщо при перевiрцi фарби виявилось, що потрiбно взяти 3 краплi фарби на 2 мл води або 2 краплi на 1 мл, то вщповщним чином вираховували необхiдну кiлькiсть крапель для дано! фарби. Для кращого фарбування мшобактерш на 10 мл приготовлено! фарби додавали одну краплю 3% розчину фенолу.
Пофарбоваш за нашою методикою мазки кровi обстежували пiд попередньо тдготовленим мiкроскопом. Для обстеження найкраще пiдходить бiнокулярний мiкроскоп з iмерсiйним об'ективом (х 90) чи (х 100) i окуляром на (х 7) чи (х 10). Можна користуватися й монокулярним мiкроскопом, при електричному чи звичайному освiтленнi.
Обстежували не менше нiж 100 полiв зору протягом 5 хв. Обстеження проводили у певнш послiдовностi, щоб не допустити повторення. Наприклад, якщо обстеження почато у центрi лiвого краю мазка (бiля номера), то поворотом гвинта обертаючого столик мшроскопу дуже повшьно послiдовно обстежували весь мазок, заюнчивши обстеження у центрi правого краю. Кiлькiсть полiв по однш довжинi мазка вiдповiдае, як мшмум 100. Потiм посували мазок влiво, щоб з'явилась можливiсть обстежувати наступне поле.
При мiкроскопi! мазка у полi зору мiкроскопу з'являлись рiзнi агенти стадiй розвитку МБТ у виглядi артроспор, молiкутiв, коюв, паличок, зеброподiбних стебел тощо. Це дало нам можлившть виявити й описати стадшшсть розвитку збудника туберкульозу в системi кровi тварин.
Результати дослщжень.
Виходячи iз наявностi характерних ознак та змiн форм МБТ, бюлопчний цикл збудника туберкульозу нами умовно подшено на наступнi стади розвитку, якi показанi на фото-тестах.
Стад1я артроспори. Це круглi мiкобактерiальнi утворення, розмiром 0,12-0,15 мкм, яю з'являються i iснують у несприятливих умовах, а потрапляючи у сприятливi умови, збiльшуються, набуваючи грушоподiбно! чи ово!дно! форми. Для внутрiшньо! структури цих клiтин характерна наявнiсть в середиш амебоподiбних утворень. Цi кл^ини, якi мають в серединi амебоподiбнi утворення (фото 1,2 ), називаються артроспорами.
35
Фото 1. Загальний вид артроспори Фото 2. Розрiз артроспори
(х 100 тис.) (х 100 тис.)
В перюд дозрiвання з артроспори через звужений юнець виходять амебоподiбнi кл^ини, яю не мають оболонок й можуть збiльшуватись шляхом дшення чи брунькування. Клiтини, що вийшли з артроспори, отримали назву молекути (Фото 3.), тобто юитини, котр1 ще не утворили стшку.
Фото 3. Розмноження молекуив дiленням i брунькуванням (10x90)
У системi кровi молекут проникае в еритроцит чи захоплюеться фагоцитом (фото 4) i продовжуе подальший цикл розвитку. Стшка еритроцита захищае збудника вiд фагоцитозу, що сприяе розвитку його якби мовити в бюлопчному мiшку (фото 5). Шсля дозрiвання коковидних форм стшка «бюлопчного мшка» лiзуеться i коковиднi форми збудника виходять в плазму кров^ де розвиваються та розносяться током кровi по всьому оргашзму.
36
Фото 4. Проникнення молжуив збудника туберкульозу в еритроцити (7 х 90).
Фото 5 . Розвиток кокоподiбних форм збудника туберкульозу в еритроцит -«бюлопчному мшку» (комп'ютерна мжроскошя)
37
Фото 6. Лiзис стшки еритроцита i вихщ кокоподiбних форм збудника
туберкульозу.(7 х 90)
Фото 7. Розвиток кокоподiбних форм в плазмi кровi (комп'ютерна
мжроскотя Х 20 тис.)
Фото 8. Кокоподiбнi форми в кров'яному ру^ в сприятливих умовах
( 7 х 90)
38
В подальшому розвиток коковидних форм мшобактерш вщбуваеться у виглядi дробления або дшення. На цiй стади дроблення в однiй кокоподiбнiй клггит, яка збiльшуeться, може утворюватися три та бшьше перетинок, що дшять клiтииу на декшька иерiвиомiриих частин, iз яких иадалi формуються самостшт кокоподiбиi й овощт клiтиии.
Дшення — це наступна стадiя розвитку М.tuberculosis. Суть стадп полягае у тому, що кокоподiбна клiтииа дшиться порiвну ие зовиi, а всередит клiтиии без змiи зовтшиьо! структури стоики. Всередииi клiтиии утворюються двi половники, як в майбутиьому переходять у самостiйиi дочiриi клiтиии i за зовиiшиьою формою иагадують маленький пирiжок (фото 9) В кожиш дочiриiй клiтииi з'являеться 1-3 вщростки (промеиi), що ростуть верхiвкою у вигляд трубочки (фото 13 ). При дозрiваииi материиська клiтииа (пир1жок) вiдпадае (фото 14), а промшь, який утворився при забарвлеииi за Цшь-Ншьсоиом утворюе характерш иалички Коха, а за методом Грам-Муха — зерниспсть.
Фото 9. Стадiя дшення коковидио! клiтиии ( 7 Х 90
-
•• Гг*1 •» V • • ■Л * •
ио1 шптиии ( 7 X 90)_
Фото 10. В кожнш дочiриiй клiтииi з'являеться 1-3 вщростки (mромеиi) (7 х 100)
39
Фото 11. Фаза вщпадання материнсько! кл^ини i утворення палички Коха.
(7х100)
При несприятливих умовах всередиш кокоподiбно! кл^ини вiдбуваеться деструкцiя ядерно! речовини i утворюються амебоподiбнi клiтини (фото 8), тобто утворюються проартроспори (фото 9), яю зменшуються у розмiрi до 0,12 — 0,15 мкм i переходять в артроспори (фото 10).
Фото 8. Перша стадiя проартроспори Фото 9.Проартроспора, друга стадiя -при несприятливих умовах - (7х 100) зменшення в об'емi та утворення
стiнки (7х100)
40
Фото 10. Новоутворена артроспора ( х 80 тис.)
Шсля вивчення стадш розвитку збудника туберкульозу, ми розпочали розробку та впровадження сучасних мшроскошчних та мiкробiологiчних методiв дослщження, якi базуються на стадiйностi бюлопчного циклу розвитку збудника туберкульозу. Виявлення у кровi агентiв (стадiй) мжобактерш туберкульозу дае можливiсть скриншгово! дiагностики туберкульозу. Для пiдтвердження дiагнозу туберкульоз, необхiдно видiлити культуру збудника. Нами розроблено прискорений метод дiагностики туберкульозу. Прискорене виявлення збудника побудоване на новш теори бiологiчного стадiйного розвитку мжобактерш туберкульозу в кровi. В мазку кровi при мжроскопп можна виявити стадп розвитку збудника з наступним отриманням чисто! культури через 2-5 доби на поживному середовищi САМОСУМ, новизна якого захищена Патентом Укра!ни [7]. Отримавши позитивнi результати лабораторно дослщжень, ми приступили до апробаци методу в умовах виробництва Вiнницького м'ясокомбiнату. З метою об'ективно! оцiнки для дослiдження вiдiбрали субпродукти велико! рогато! худоби, хворо! на туберкульоз (дослвдш), та здорово! - (контрольш).
Вiдiбранi проби надалi дослщжували за запропонованою методикою мiкроскопiчно. Для пщтвердження чи виключення дiагнозу проби направлялись для бактерюлопчних дослiджень. В процес роботи було дослiджено мазки печшки велико! рогато! худоби - по 150 проб у контрольнш та дослщнш групах. Результати дослiджень наведет в табл. 1.
Таблиця 1.
Результати мжроскотчних та бактерюлопчних дослщжень печшки
велико! рогато!' худоби
Групи печшки МЕТОДИ ДОСЛЩЖЕНЬ ПРОБ
комп'ютерна мжроскошя бактерюлопчш
всього з позитивною % всього з позитивною %
дослвджено реакщею дослвджено реакщею
Дослщна 150 12 8 150 12 8
Контрольна 150 - - 150 - -
41
Встановлено, що iз 150 проб мазюв печшки дослщно! групи, у яких не виявлено характерних патолого-анатомiчних змш при проведеннi ветеринарно -саштарно! експертизи, при мiкроскопi! було 12 випадюв позитивних результатiв, що становить 8 %. Бактерюлопчш дослщження пiдтвердили аналогiчнi результати видiлення збудника туберкульозу з проб, що дали позитивний результат при мжроскопп.
З результаив дослiджень видно, що запропоноваш новi пiдходи мiкроскопiчного дослiдження м'яса та м'ясопродукив дають можливiсть в первинних мжроскотчних дослiдженнях виявити збудника туберкульозу незалежно вiд стадiй розвитку, тодi як за загальноприйнятою методикою потрiбно 30-90 дiб.
Запропонований метод високоспецифiчний, простий у експлуатацi!, не потребуе значних матерiальних чи фшансових витрат, нешкiдливий для людей й еколопчно безпечний для навколишнього середовища.
Висновки
1. Для скринiнгово! дiагностики туберкульозу при ветеринарно - саштарнш експертизi слiд використовувати запропонований мшроскотчний дiагностичний тест.
2. Використання поживного середовища САМОСУМ дасть змогу скоротити час дослiдження i тдвищити результативнiсть порiвняно з середовищем Левенштейна-Йенсена.
3. Запропонований метод дослiджень кровi з використанням середовища САМОСУМ дозволить скоротити перюд дослiджень харчових продукив при пiдозрi iнфiкування !х збудником туберкульозу .
4. Дослщження на середовищi САМОСУМ можуть бути використаш як основний лабораторний метод, який пщвищуе чутливiсть i скорочуе термш бактерiологiчно! дiагностики при ветеринарно - саштарнш експертизi туш та оргашв при латентнiй формi туберкульозу тварин.
5. Заборонити використовувати препарат « Туберкулш ППД для ссавщв» в якому знаходиться фiльтрувальнi форми збудника туберкульозу для дiагностичного тестування у тваринництвь
Лiтература
1. Колос Ю., Стець В., Титаренко В., Зелшський М., Якубчак О., Хоменко В. До питання дiагностики туберкульозу в тварин// Ветеринарна медицина Укра!ни - 2006- №11-С. 10-12.
2. Пухлик Б.М. Епiдемiя туберкульозу в Укра!ш причини i шляхи !! зупинення// Лiки Укра!ни 1999. №7-8.С. 10-11
3. Власенко В.В., Власенко И.Г., Василенко С.П., Колодш С.А., Лысенко А.П. Патоморфологические реакции, вызванные артроспорами микобактерий туберкулеза// Вшник морфологi! -2006- №12(1)-С. 46-48.
4. Власенко В.В. Туберкульоз в фокусе проблем современности .- Винница: Наука.-1998.-223с
5. Мельник В.М. Туберкульоз в Укра!ш на сучасному етапi й прогнознi ощнки //Укр. пульм. журн.-2004.- №3.-С.61-63.
42
6. Власенко В.В., Гаврилюк М.Д., Компанець B.C., Черниш 1.М. Hobí погляди в морфологи збудника туберкульозу // Матерiали XIV об'еднано! медико-техшчно! конференци, Вiнницький державний медичний ушверситет ím. М. I. Пирогова. - Вшниця, 1996. - С. 48.
7. Патент № 21719, Украша C12N1/00 «Живильне середовище для видшення збудника туберкульозу» /Власенко В.В., Власенко 1.Г., Колодiй С.А., Блащук ВВ., Дзюмак М.А. (Укра1на заявка №U200613852; заявлено 26.12.20006, опублiковано 15.03.2007, Бюлетень № 3 ).
Summary
V.V. Vlasenko d.b.n., professor, I.G. Vlasenko associate professor, V.P. Byravinskiy graduate student, I.V. Berezovskiy assistant Winnitca state agrarian university MODERN APPROACHES VETERINARY - SANITARY EXAMINATION OF CARCASSES AND ORGANS AT LATENT FORM OF TUBERCULOSIS
ANIMALS
Shown cycle of development of exciter of tuberculosis in a blood and a new high-specific expeditious method is offered for the exposure of mycobacteria of tuberculosis (MBT) in the strokes of capillary blood with a next bacteriological confirmation by the selection of the clean culture MBT for 2-5 days. This method enables to expose exciter of tuberculosis on the early stage of disease, when by the generally accepted method he is not yet diagnosed.
Key words: animal, blood, meat, exciter of tuberculosis, veterinario - sanitary examination
Стаття надшшла до редакцИ 17.09.2008
43
