CC BY
7
УДК 619:616.98:578
Власенко 1.Г., кандидат бюл. наук, доцент © ВЫницький торговельно - економгчний ¡нститут КНТЕУ
ПЕРСПЕКТИВИ ВИКОРИСТАННЯ КОМП'ЮТЕРНИХ ТЕХНОЛОГ1Й ДЛЯ ОЦ1НКИ БЮЛОГ1ЧНО1 БЕЗПЕКИ МОЛОКА КОР1В 1НФ1КОВАНИХ ЗБУДНИКОМ ТУБЕРКУЛЬОЗУ
В работе исследуется современное состояние и перспективы улучшения качества и безопасности молока в Украине. Предложены новые подходы к усовершенствованию качества и безопасности молока с использованием компьютерных технологий и новых питательных сред.
Вщповщно до сучасних мiжнародних вимог щодо безпечност молока лише якюний контроль е вже недостатшм тому, що вш не може гарантувати повну безпеку. Особливо критична ситуацiя склалася з оцiнкою якостi молока вщ тубiнфiкованих тварин на територiях забруднених радiонуклiдами. Для виявлення тубiнфiкованих корiв використовують туберкулiн для ссавцiв.
Як вщомо, туберкулiн е алергеном, який виготовляють з високовiрулентного (патогенного) штаму збудника туберкульозу. За повiдомленням фахiвцiв ветеринарно! медицини: Ю. Колоса (канд. вет. наук), О. Якубчак та В. Хоменко (доктори наук, професори), М. Зелшського (головний спещалют Держдепартаменту вет. медицини), а також В. Титаренко (заступник директора Держптаховетцентр м. Ки!в) та шших, цитую: «Туберкулш е алергеном, тобто при потраплянш у сенсибiлiзований органiзм викликае певну алергiчну реакцiю. Щоб вона була специфiчною, в алергенi (туберкулiнi) повинш бути бiлки збудника туберкульозу. Крiм того, в даному препаратi можуть бути фiльтрувальнi форми мiкобактерiй. Для того щоб вони не розвивалися i не переходили у вегетативш форми, до препарату додають консерванти (фенол, глщерин тощо). Отже, такий препарат е специфiчним алергеном. Якщо вивiльнити його вiд фiльтрувальних форм мжобактерш, то вiн втратить свою специфiчнiсть i буде непридатним до використання. Природно, що, нейтралiзувавши консервант та провiвши посiви на спещальш високочутливi середовища — ВКГ зi стимулятором росту чи iнше специфiчне i високочутливе — можна досягти реверси фшьтрувальних форм у вегетативну форму мжобактерш» [1]. Отже, як повщомляють автори [1], при туберкулiнодiагностицi тварин, в органiзм вводять фiльтруючi форми вiрулентного збудника туберкульозу, а вщтак цей збудник розвиваеться i з органiзму корiв видiляеться в значш кiлькостi з молоком корiв. Iснуючi бактерiологiчнi методи визначення збудника ще! небезпечно! хвороби в продуктах харчування досить складш та тривал1 Це заважае оперативному визначенню тубшфшованого сирого молока. Вiдомо, що для туберкульозу та багатьох антропозоонозних захворювань юнуе бiологiчний ланцюг "тварина — молоко — людина", тобто в разi недостатнього контролю продукти харчування
© Власенко 1.Г., 2008
44
тваринного походження, уражеш збудником туберкульозу, можуть передавати збудника (шфекцш) людям [2 ].
Ситуащя Í3 здоров'ям населення Украши набувае загрозливого стану, загострилась i епщемюлопчна ситуацiя з туберкульозу. Щороку в Укра1ш виявляеться 30-40 тис. хворих на туберкульоз, загальна кiлькiсть тих, хто перебувае пщ наглядом лiкувально-профiлактичних закладiв, становить близько 700 тис. оаб, у т.ч. хворих на активш форми туберкульозу — 140 тисяч. За перюд з 1990 по 2005 рш захворювашсть на туберкульоз оргашв дихання зросла в 2,4 раза [3]. В 1995 рощ ршенням ВООЗ в нашш кра!ш було оголошено про епiдемiю туберкульозу. Слщ зазначити, що вiд цього захворювання щорiчно в Укра1ш помирае 10-12 тис. людей. [1].
Вступ Украши до СОТ забов'язуе нас виконувати Постанову (£С) № 178/ 2002. Дiя постанови поширюеться на вс краши GC. Мета постанови (£С) № 178/ 2002 - створення основ для високого рiвня захисту здоров'я людини та споживчих штереав в галузi продуктiв харчування, беручи до уваги рiзноманiття асортименту харчових продукив. Це стало передумовою для створення мщно! науково! основи для розтзнавання в сирому молоцi стадшного розвитку збудника туберкульозу пiсля проведення туберкулмзаци у дiйних корiв.
Метою нашо! роботи було пiдтвердити чи виключити наявнiсть фiльтруючих форм мжобактерш в туберкулiнi ППД для ссавщв i можливiсть iнфiкування ним продукпв харчування та розробити експрес-методу ощнки безпеки молока з використанням комп'ютерно! системи для виявлення збудника туберкульозу.
Матер1ал та методи. Для визначення ефективностi комп'ютерно! оцiнки бюлопчно! безпеки молочно! сировини використовували культури мжобактерш: М. tuberculosis Н37 Rv (з колекцп ГИСК 1м. Л.А.Тарасевича), М. bovis 8, М. bovis BCG, як вщновили з лiофiлiзованого стану спочатку на середовищi Левенштейна-Йенсена, поим - на середовищi Павловского.
Гомогешзоваш культури суспензували в стимуляторi росту до концентраци 1 мг/мл, поим готували розведення (1 : 10) i ставили в термостат при температурi 37-38°С на 48 год, з наступним посiвом на поживне середовище «Влакон».
В якостi бюлопчно! моделi використовували морськi свинки, яю роздiлили на двi групи. Перша група слугувала контролем, а друга - дослщом. В роботi використовували туберкулш ППД для ссавцiв Сумсько! бiофабрики серiя 45 та 80, який вводили морським свинкам друго! (дослщно! групи), що пройшли карантин, внутрiбрюшино в кiлькостi 3 мл на стерильному мшеральному маслi i через мюяць цим тваринам проводили евтаназш. Для виявлення iнфiкованостi пщдослщних тварин, вiдбирали печiнку, селезiнку та легеш морських свинок i виавали на поживнi середовища. Суспензiю внутршшх органiв обробляли 10% розчином трьохзамщеного фосфорнокислого натрiю. Для виявлення фшьтруючих форм (артроспор) збудника туберкульозу використовували бактерiальний фiльтр Millpore з дiаметром 0,22 мiкрона. До отриманого фшьтрату додавали стимулятор росту ВКГ, тсля чого iнкубiрували в термостатi 24 год при температурi 37°С.
45
Культуральш i бактерюлопчш дослщження проводили згщно з Наказом МОЗ Укра!ни № 45-2002 року [4].
Проводили вiдбiр молока вiд корiв, що реагували позитивно на туберкулiн за загальноприйнятою методицою. В пробiрки з молоком в кшькост 10 мл додавали 2-3 краплi 5% розчину фенолу з метою iнгiбування росту супутньо! мiкрофлори. При дослiдженнi молока використовували збагачення препаратом ВКБ. Запропонований метод збагачення препаратом ВКБ (Власенко В., Конопко I., Березовський I., 2003) дае можливють концентрувати збудник туберкульозу. Метод полягае в тому, що до молока в кшькост 10 мл додають таку ж кшьюсть препарату ВКБ ) i пвд^вають до 50-60°С. Пiсля охолодження вмiст виливають в центрифужнi пробiрки, центрифугують при 1500 об/хв протягом 25-30 хвилин, надосадну рiдину зливають, а з осаду роблять бактерюлопчш поави та тоню мазки, яю висушують, фiксують та фарбують за методом Цшь-Ншьсена. При бактерiологiчному дослщженш до осаду додавали стимулятор росту в сшввщношенш 1:1 i ставили в термостат при температурi 37-38°С на 48 год, з наступним посiвом на поживне середовище «Влакон». Мiкроскопiю мазкiв проводили за загальноприйнятою методикою за допомогою iмерсiйноl системи з використанням комп'ютерних технологiй мжроскопування, яка запатентована нами в Укра!ш.
Результати дослщжень.
Встановлено, що шокулящя матерiалу (туберкулiну), який мiстить фiльтруючi форми МБТ (вiдсутнiсть росту на традицшних поживних середовищах i ркт на середовищi ВКГ та Влакон), в макроорганiзмi морських свинок за короткий час (один мшяць тсля зараження) розвиток патологiчних характерних змш для туберкульозу спостерiгалось лише у 8% тварин, а при бактерюлопчному дослщженш у вах тварин, яким вводили туберкулш виявляеться збудник туберкульозу, тодi як на посiвах контрольно! групи тварин рют був вщсутнш, а патологiчнi змiни не спостершались. Результати визначення ефективностi комп'ютерно! оцшки бюлопчно! безпеки молочно! сировини наведет в табл. 1.
Як видно з табл. 1, результати мшроскошчних i бактерюлопчних дослiджень тест-культур з середовища Павловського рiзницi не мали, а при дослiдженнi мазкiв молока св^ловим мiкроскопом виявилось позитивних мазюв лише 10%, тодi як при комп'ютерш мшроскопи-100%. Культури отриманi на середовищах Влакон i Левенштейна - Йенсена за мшроскошчною картиною були щентичш. Пiсля посiву дослiджуваних проб через 2-4 доби на дослщжуваному середовищi з'являлися круглi напiвпрозорi дрiбнi колонil сiро-бiлих кольорiв, iнодi - з жовтуватим вiдтiнком, що легко зшмаються iз середовища при приготуванш мазкiв. В процесi перегляду мазюв з колонiй, що виросли на 2-4 добу на дослщжуваному середовищ^ виявлеш полiморфнi форми: дрiбнi коки та палички рiзноl величини, прямi й вигнутi, iз зернистютю (при фарбуваннi за Цiль-Нiльсеном - вщ рожевого до червоно-фiолетових кольорiв). Тобто рiст культур з молока корiв iнфiкованих збудником туберкульозу на середови1Щ «Влакон» був в 100% дослщжуваних проб, а на середовищi Левенштейна -Йенсена - вiдсутнiй.
46
Отже, можна думати, що малах^овий зелений який входить до складу середовища Левенштейна-Йенсена, шпбуе рют не лише супутньо! мiкрофлори, але i збудника туберкульозу, який мае понижену ферментативну активнiсть. При переглядi мазюв культур, вирощених на дослiджуваному середовищi протягом 1,5 мiс. i пофарбованих за Цiль - Нiльсеном, виявлеш розсипи кокiв, ди - i тетракокiв, у великiй кiлькостi - палички рiзноl величини iз зернисистю, а також iншi форми червоних кольорiв.
Таблиця 1
*езультатн по|мвняльннх методiв дослщжень_
Назва дослвдного матер1алу Юльшст ь проб Результата мжроскопи Бактерюлопчш дослвдження (р1ст)
Свгглова мшроскошя Комп'ютерна Середовище Левенштейна -Йенсена Середовище «Влакон»
Факт % Факт % Факт % Факт %
М. tuberculosis Н37 R v 5 5 100 5 100 5 100 5 100
М. bovis 8 10 10 100 10 100 10 100 10 100
М. bovis BCG 10 10 100 10 100 10 100 10 100
Молоко шфжованих кор1в збудником туберкульозу 10 1 10 10 100 10 100
Таким чином, при культивуваннi мiкобактерiй на дослщжуваному середовищi пiдтверджена !хня здатнiсть трансформуватися в класичнi палички.
При комп'ютернш мшроскопи мазкiв з молока корiв, що реагували позитивно на туберкулш, спостерiгали клiтини рожево-червоного кольору: коки, дрiбнi й великi, палички коротю i довгi iз зернами, прямi на вигнуту.
Для запобiгання хибних результаив при проведеннi бактерюскопи виникае необхщшсть оцiнити наявнiсть живих мшобактерш в мазку, так як вони не фарбуються за методом Цшь-Ншьсена, а тому дуже важливо визначити життездатшсть мiкобактерiй. З цiею метою приготовлений мазок молока вщ вищезгаданих корiв фiксували над полум'ям, фарбували 1,0% розчином малахiтового зеленого (рН 4,1) протягом 10 хвилин, пвд^ваючи мазок до появи пари. Шсля цього фарбу зливали, мазок промивали водою i фарбували карболовим фуксином (в розведенш 1:5) протягом 5 хвилин. Живi мшобактери фарбуються в зелений колiр, а нежиттездатнi — в червоний.
Для пщтвердження того, що з молока видшена культура збудника туберкульозу була проведена бюлопчна проба на морських свинках. У процес проведено! бюлопчно! проби виявлено здатшсть отриманих культур з молока визивати характерш туберкульознi патологоанатомiчнi змши у лабораторних тварин та видшити з них збудника туберкульозу на середовищi Левенштейна -Йенсена без малахпового зеленого. Таким чином, пщтверджена гiпотеза, що малахiтовий зелений, шпбуе не лише ршт супутньо! мжрофлори, а i збудника туберкульозу, який мае понижену ферментативну актившсть, проте за сприятливих умов здатний викликати захворювання.
47
В результат проведених дослщжень встановлено, що Bci дослщжуваш мазки молока вщ корiв, якi реагували на введений туберкулта позитивно мали в 100 полях зору мжроскопа вщ 7 до 43 клiтин збудника туберкульозу. Можна думати, що при фшсацп над полум'ям спиртiвки мазюв молока мжобактери не гинуть остаточно, а тому погано фарбуються за методом Цшь - Нiльсена.
Висновки
1. Основою гарантування безпеки молочно! продукци в Укра!ш е система мошторингу санiтарно небезпечних збудникiв та залишкових кiлькостей токсичних речовин в молочних продуктах харчування.
2. Запропонований метод збагачення мiкобактерiй в сирому молощ препаратом ВКБ та результата комп'ютерно! мкроскопи мазкiв молока , можуть бути використанi як експрес-метод ощики бюлопчно! безпеки молочних продукпв.
3.Середовище "Влакон" придатне для контролю якост молока та молокопродуктiв, так як дае можливкть виявляти полiморфнi форми збудника туберкульозу (фуксинофiльнi коковидш утвори, зернистi палички), яю викликають специфiчне туберкульозне ураження внутрiшнiх оргашв морських свинок.
4. Культури музейного штаму М. bovis 8, М. bovis BCG та з молока корiв, iнфiкованих туберкульозом, отриманi на середовищах Влакон i Левенштейна -Йенсена е щентичш за мжроскошчною картиною.
5. Впровадження у практику комп'ютерно! мжроскопи та поживного середовища "Влакон" суттево прискорить виявлення мжобактерш туберкульозу значно зменшить витрати на лабораторну дiагностику при контролi безпеки харчових продукпв.
6. Туберкулiн ППД для ссавцiв сумсько! бiофабрики серiя 45 та 80 мiстить живого збудника туберкульозу i тсля введення в органiзм вiн може визвати характернi патологiчнi змiни лише у 8% випадюв, а при бактерюлопчному дослiдженнi у всiх тварин, яким вводили туберкулiн виявляеться збудник туберкульозу, що е вкрай небезпечним для харчово! сировини.
Л1тература
5. Колос Ю., Стець В., Титаренко В., Зелшський М., Якубчак О., Хоменко В. До питання дiагностики туберкульозу в тварин// Ветеринарна медицина Укра!ни - 2006- №11-С. 10-12.
6. Власенко В.В. Туберкульоз в фокусе проблем современности. - Винница: Наука. - 1998.-223с.
7. Власенко В.В., Власенко И.Г., Василенко С.П., Колодий С.А., Лысенко А.П. Патоморфологические реакции, вызванные артроспорами микобактерий туберкулеза// Вшник морфологи -2006- №12(1)-С. 46-48.
8. Методичш рекомендаци «Мжробюлопчш методи обстеження хворих на туберкульоз».(на пiдставi нових даних про особливостi бiологiчного розвитку M. tuberculosis ). МОЗ. Ки!в - 2001-23с.
Summary
In work the modern state and prospects of improvement of quality and safety of milk in Ukraine is explored. Offered new approaches to the improvement of quality and safety of milk from the use of computer technologies and new nourishing environments.
Стаття надшшла до редакцИ 18.09.2008
48
