CC BY
9
УДК 619:616.982.2
Власенко В.В.*, Власенко 1.Г. *, ЛисенкоО.П.**, Мельничук С.Д., Левк1вський Д.М. ©
*Подшьський науково - дослщний центр туберкульозу Укра1на, 00021 Вшниця, вул. Привокзальна, 42.
** Институт експериментально! ветеринара iм. С.Н. Вишелеского, Национально! академи наук Беларусi Львiвський нащональний унiверситет ветеринарно! медицини та бютехнологш
iменi С.З. Гжицького
ПРИСКОРЕНА ДЕТЕКЦ1Я ЗБУДНИКА ТУБЕРКУЛЬОЗУ З ВИКОРИСТАННЯМ СЕРЕДОВИЩА ВЛАКОН
(Результаты дослгджень в рамках мгжнародног науковог ствпрац
Украгна - Беларусь )
У статт1 пор1внюються результаты выявлення мтобактерш туберкульозу з выкорыстанням бактерюскотг за Щль-Нтьсоном, культурального дослгдження на яечных середовыщах та прыскореного методу (з выкорыстанням середовыща ВЛАКОН).
Показано, що выкорыстання запропонованого пожывного середовыща мае свог перевагы: тдвыщуеться чутлыв1сть та результатывшсть дослгджень, зявляеться можлыв1сть дыференщацп культур ргзных выдгв мтобактерш за допомогою методыка реакцп аглютынацп (РА) на склг з наступным фарбуванням та мжроскопуванням., значно скорочуеться термт д1агностыкы туберкульозу.
Ключовi слова: туберкульоз, мжобактерп, методы выявлення мтобактерш, пожывш середовыща.
Вступ. Незважаючи на широкомасштабну профилактику, бия 2 млн. людей щорiчно помирае вщ туберкульозу i половина населення планети шфжовано збудником туберкульозу[7]. Вщомо, що для багатьох антропозоонозних захворювань кнуе бюлопчний ланцюг "тварина — м'ясопродукти — людина", тобто в р^ недостатнього контролю продукти харчування тваринного походження, уражеш збудником туберкульозу, можуть передавати збудника (шфекщю) людям [4 ].
Ситуащя iз здоров'ям населення Украши набувае загрозливого стану, загострилась i епщемюлопчна ситуащя з туберкульозу. Щороку в Укра1ш виявляеться 30-40 тис. хворих на туберкульоз, загальна кшькють тих, хто перебувае тд наглядом л^вально-профшактичних закладiв, становить близько 700 тис. оЫб, у т.ч. хворих на активш форми туберкульозу — 140 тисяч. За перюд з 1990 по 2005 рш захворювашсть на туберкульоз оргашв дихання зросла в 2,4 раза [3]. В 1995 рощ ршенням ВООЗ в нашш кра!ш було оголошено про
© Власенко В.В., Власенко 1.Г., ЛисенкоО.П., Мельничук С.Д., Левшвський Д.М., 2009
12
епщемш туберкульозу. Слщ зазначити, що вщ цього захворювання щорiчно в Укра1ш помирае 10-12 тис. людей. [1].
До тепершнього часу прийнято, що "золотим" стандартом лабораторно! дiагностики туберкульозу залишаеться мжробюлопчне дослiдження, яке включае бактерiоскопiю i поЫв на поживнi середовища. Дослщження мазкiв дiагностичного матерiалу методом люмшесцентно! мжроскопи i фарбування за Цшь-Ншьсоном на кислотостiйкi бактери - найбшьш швидкий спосiб отримання результатiв. Але специфiчнiсть i чутливiсть бактерюскопи достатньо низька i культуральна дiагностика матерiалу займае не менше 4-8 тижшв, а негативними вважаються результати при вщсутност росту протягом 12 тижшв. Технологи дiагностики, якi iснують за кордоном дороп, i, поки що, малодоступш для широкого використання в Укра!ш [2 ,5].
З метою покращення дiагностики туберкульозу в Укра!ш розроблено «Живильне середовище зi стимулятором росту для прискореного виявлення збудниюв туберкульозу»", яке отримало назву „ВЛАКОН".
Метою нашо! роботи була перевiрка заявлених властивостей i якостi живильного середовища ВЛАКОН для прискорено! детекци туберкульозу.
Матер1али та методи. Для визначення ефективност середовища використовували культури мкобактерш: М. tuberculosis H37 Rv (з колекцп РИСК iм. Л.А.Тарасевича), М. bovis 8, М. bovis BCG, М. avium 2282 (з колекцп ВГНКИ), яю виавали з люфшзованого стану спочатку на середовище Левенштейна-Йенсена, потiм - на середовище Павловського. Отримаш культури на середовищi Павловського знiмали в кiлькостi 1 мг по загальноприйнятш методицi i додавали !х в 1 мл стимулятора росту мжобактерш, а отриману суспензiю гомогешзували електромагнiтною мiшалкою протягом 15 хв. Таким чином була отримана робоча суспензiя. В подальшому з робочо! суспензи готовили розведення в стимуляторi росту (1 : 10) i ставили в термостат при температурi 37-38°С на 48 год. Для визначення ростовых якостей контрольних середовищ МПБ, МПА використовували стафiлококову тест-культуру S. epidermitidis (1225)
Використання живильного середовища зi стимулятором росту для прискореного виявлення збудниюв туберкульозу» - „ВЛАКОН". Живильне середовище розфасовано по 100,0 , 250,0 , 500,0 г. Стимулятор росту розлито по 5,0 , 100,0 , 200,0 мл. Збер^али середовище ВЛАКОН у герметично закритш упаковщ з вщносною волопстю не бшьше 60,0 % при температурi вщ 5 до 25 °С. Термiн придатностi середовища ВЛАКОН 18-24 мкящв.
Середовище ВЛАКОН призначене для прискореного виявлення мiкобактерiй туберкульозу: стимулятор -для прискорення росту, живильне середовище-для культивування мжобактерш. Стимулятор росту - стерильна, прозора, безбарвна рщина, що мктить мкро та макроелементи (допускаеться жовтуватий вiдтiнок). Живильне середовище (дрiбнодисперсний, гiгроскопiчний порошок кремового кольору) Для приготування середовища „ВЛАКОН" брали наважку у кшькоси, зазначенш на етикетщ, розмiшували в 1,0 л стерильно! дистильовано! води, кип'ятили 2-3 хвилини до повного
13
розплавлення агару, фшьтрували через ватно-марлевий фшьтр, розливали у вщповщний посуд, стерилiзували при (121,0 ± 1,0) °С протягом 15 хвилин у автоклавi.
Готове середовище жовтого забарвлення з рН 7,2 ± 0,2, використовували протягом 1 мкяця за умови зберiгання його при (6,0 ± 2,0) °С.
Перед посiвом живильне середовище розплавляли на водянш банi i розливали в асептичних умовах у стерильш чашки Петрi шаром 6-8 мм ( доза18- 20 мл).
До 5,0 мл стимулятору росту додавали у асептичних умовах за допомогою стерильного шприця 1,0-1,5 мл пщготовленого шфжованого матерiалу (вiдбiр i пщготовка матерiалу здiйснюeться за загальноприйнятою методикою бактерюлопчних дослiджень згiдно Наказу МОЗ Укра!ни №45-2002р. та чинно! методично! рекомендаци МОЗ - 2001р. [5]. Стимулятор росту забезпечуе видшення мiкобактерiй iз кровi без !! попередньо! обробки. Отриману суспензiю шкубували у термостатi при температурi (37,0 ± 1,0) °С протягом 24 - 48 годин i виавали на живильне середовище.
В чашку Петрi зi свiжорозплавленим живильним середовищем вносили 1,5 мл суспензi! (шфжованого матерiалу у стимуляторi росту), рiвномiрно розподiляючи !! по всiй поверхш. Чашки Петрi не перевертали!, герметизували прозорою липкою стрiчкою та шкубували при (37,0 ± 1,0) °С протягом 10 дiб. ПоЫви продивляються щоденно. Вiзуально можна виявити характерний ркт мiкобактерiй уже через 24-48 годин.
З отриманих культур готували мазки i фарбували !х за методом Цшь-Нельсена. Для визначення видово! належностi збудникiв туберкульозу, вирощених на середовищi « ВЛАКОН», використовували метод зараження лабораторних тварин - морських свинок i кролиюв. Для контролю зараження тварин застосовували культури М. tuberculosis H37 Rv, M. bovis 8, яю вирощували на середовищi ВЛАКОН, а також на середовищi Павловского (контрольнi культури).
Через 71 добу тсля зараження провели забш i патологоанотомiчний розтин тварин. У тварин iз серця вщбирали проби кровi в стерильнi пробiрки з гепарином, додавали рiвний обсяг стимулятора росту й помщали в термостат при 37-38°С на 24 години, поим виЫвали на живильш середовища ВЛАКОН, МПА i МПБ. З культури, що виросла на середовищi ВЛАКОН, готували мазки й фарбували !х за Цiль-Нельсеном. Для подальшого дослiдження вiд морських свинок вщбирали паховi лiмфовузли, печiнку, селезшку й легенi, а вiд кролiв -лише печiнку, селезiнку та легеш. Потiм проводили обробку патолопчного матерiалу за А. Алiкаeвою i поЫв суспензi! кожного органа на живильш середовища Левентитейна-Йенсена, МПА, МПБ. Також суспензш кожного органу, обробляли стимулятором росту, тсля чого виавали на середовище ВЛАКОН, як указано вище. Облж росту культур на середовищах проводили щодня протягом перших 5 дiб, а далi регулярно з штервалом 5 дiб до закшчення термiну iнкубацi!. З отриманих культур готували мазки i фарбували !х за методом Цшь-Нельсена.
14
Для диференщаци культур рiзних видiв мжобактерш, що виросли на середовищi ВЛАКОН, ми апробували методику - реакцiю аглютинаци (РА) на CKni з наступним фарбуванням i мiкроскопуванням запропоновану професором А.Лисенко [6].
Як антиген використовували культури мiкобактерiй i3 середовища ВЛАКОН, сироватки - антисироватки до М. bovis Vallee, до антигешв атипових мжобактерш, а також негативну сироватку кровi велико! рогато! худоби. Результат реакци враховували протягом 4 хв, тсля чого скло фарбували за Цшь-Нельсеном, але без дофарбовування метиленовим сишм i мiкроскопували.
Результати та 'ix обговорення. Вивчення ростових якостей запропонованого середовища проводили в порiвнянi з яечним середовищем Левенштейна -Йенсена, МПА, МПБ (контрольнi середовища). Результати дослщжень наведенi в табл.. 1.
Таблиця 1.
Результати дослщжень росту тест-штамiв мжобактерш на контрольних та
дослщному середовищах
Назва дослщного матер1алу Кшьшсть проб на одне середовищ. Результати росту культур на поживних середовищах
МПБ МПА Середовище Левенштейна -Йенсена Середовище «Влакон»(дослщне)
Факт % Факт % Факт % Факт %
. М. tuberculosis H37 Rv, 10 Немае росту Немае росту 42 ±0,4 10 100 3 ±0,58* 10 100
М. bovis 8 20 Немае росту - Немае росту - 40±0,93 20 100 4±0,88* 20 100
М. avium 2282 10 Немае росту - Немае росту - 41±0,49 10 100 2±0,58* 10 100
М. bovis BCG 12 Немае росту Немае росту 100 35 ±0,9 12 100 2±0,56* 12 100
S. epidermitidis (1225) 10 1±0,49 10 100 1±0,53 10 100 Немае росту Немае росту
Примггка - Примггка: 1)* - Р<0,001 пор1вняно з показниками середовищем Левенш.-Йенс. (контрольне). 2) Знаменник шльшсть проб, а чисельник через який перюд (даб) отримано р1ст на вах поавах.
Як видно з результат дослiджень, що на середовищi ВЛАКОН рiст культур референтних штамiв М. tuberculosis H37RY, М. bovis 8, M.avium 2282, М. bovis BCG з'являвся на 2-4 добу у виглядi круглих натвпрозорих колонш сiро-бiлих кольорiв, iнодi з жовтуватим вiдтiнком, що зливалися до 5-6 доби в «газон». При зворотному переЫванш iз середовища ВК на середовище Левенштсйна-Йенсена без малах^ового зеленого було отримано ркт культур вах штамiв з характерною для них морфолопею.
При мiкроскопi! мазюв, приготованих з культур М. tuberculosis H37RV, М. bovis 8., , М. bovis BCG , М. avium 2282, як виросли на середовищi ВЛАКОН протягом 2-4 доби й пофарбованих за Цшь-Нельсеном, спостер^али коки, ово!ди, прямi й вигнут палички рiзно! величини, груше-, амебоподiбнi
15
форми з порожшм центром i зернистютю - рожевого або червоно-фюлетового кольору (рис.1).
Рис. 1. Утворення з кокопод1бно1 клггини зернисто!' палички (х45000)
У мазках цих же культур 1,5-мюячного росту на середовищi ВЛАКОН виявляли червоного кольору кл^ини розсипу кокiв, дипло-, тетракоки, овощи, велику кiлькiсть паличок рiзноl величини Í3 зернистiстю (рис2). Таким чином, при тривалому культивуванш мiкобактерiй на середовищi ВЛАКОН пщтверджена 1х здатнiсть трансформуватися в класичш форми збудникiв.
## +шшф ••
Рис. 2.Паличка Коха -зерна Муха ( х 50 000).
У морських свинок, заражених культурами М. tuberculosis H37Rv, M. bovis 8, 11-добового росту на середовищi ВЛАКОН i культурами тих же штамiв, вирощених на загальноприйнятих живильних середовищах й убитих через 71 добу, виявлеш патолого - анатомiчнi змши, характернi для туберкульозу.
При мжроскопи мазкiв гомогенатiв патматерiалу спостер^али клiтини рожево-червоного кольору коки дрiбнi й великi з порожнiм центром, палички коротю й довгi i зернами по полюсах, прямi й вигнут та палички рубшо-червоного кольору. При посiвi гомогенатiв патматерiалу вiд морських свинок i кролiв на середовище ВЛАКОН спостерiгали ркт на 2-4 добу у виглядi дрiбних круглих напiвпрозорих колонiй Ыро-бших кольорiв, iнодi з жовтуватим вщтшком, що зливаються до 5-6 дiб в «газон». При мжроскопи мазюв культур 6-15 добового росту, що виросли з патматериалу на середовищi ВЛАКОН , спостерiгали червонi дрiбнi й великi коки, диплококи, овощи з порожшм
16
центром, ^i6rn прям1 й вигнуп палички. При посш KpOBi з дослiдних лабораторних тварин на середовище ВЛАКОН спостеpiгали на 2-4 добу picT культур i3 Bcix зразшв у виглядi дpiбних круглих колонiй бiло-сipого кольору, що злилися в «газона». При мшроскопи мазкiв, приготовлених з культур, що виросли на сеpедовищi ВЛАКОН протягом 5 дiб, спостеpiгали клiтини рожево-червоного кольору: товстi вигнутi палички, пpямi тонкi палички iз зернистютю й mini форми ( рис. 3).
Рис. 3. Мжрокартина отриманоТ культури, що виросли на середовищi
ВЛАКОН
Встановлено, що культури мшобактерш людського й бичачого видiв iз середовища ВЛАКОН чiтко агглютинувались антисироваткою до М. bovis, i не аглютинувались негативною сироваткою кpовi КРС. Демонстративнють РА на склi тдвищувалася при фаpбуваннi (по Цiль-Нельсену, але без дофарбовування метиленовим синiм ) i наступному мiкpоскопуваннi.
Таким чином середовище ВЛАКОН призначене для прискореного виявлення мiкобактеpiй туберкульозу: стимулятор -для прискорення росту, живильне середовище-для культивування мiкобактеpiй, а сукупнiсть усix складових середовища ВЛАКОН , якi об'еднаш единим творчим задумом, дозволяе одержати техшчний результат, а саме скоротити бактеpiологiчнi дослiдження, пiдвищити чутливiсть методу. За рахунок нових ознак у способi видтення збудника туберкульозу: попередньо1 обробки пiдготовленого патматеpiалу стимулятором та нового складу живильного середовища для видтення збудника туберкульозу створюеться синерпчний ефект, який
17
обумовлюе скорочення тривалост шкубування матерiалу з одночасним тдвищенням чутливост методу, i як результат - значне скорочення тривалост бактерюлопчних дослiджень. Рахуеться, що стимулятор росту активiзуе натрш-калевi насоси i деякi ферменти мiкобактерiй, що стимулюе адаптивнi структури i спонукае швидкому проростанню в виглядi полiморфних кл^ин, що мають загальнi антигени з бацилярними формами збудника туберкульозу та щентичш дiлянки ДНК. Напевно, слщ визнати, що вiдомi ультрадрибнi, коковидш, не кислотостiйкi та iншi форми- не лише результат адаптаци збудника до факторiв iмунноl системи чи ди хiмiотерапевтичних препаратiв, але i закономiрнi етапи, в яких класична «бацила Коха»- лише одна з стадш життевого циклу збудника туберкульозу.
Висновок
1.Застосування середовища ВЛАКОН зi стимулятором росту дозволяе на 2-4 добу виявити ркт культур збудниюв туберкульозу людського, бичачого видiв як референтних штамiв, так i з патматерiалу й кровi тварин, заражених збудником туберкульозу.
2.Не встановлено ч^ких розходжень у морфологи культур збудниюв туберкульозу людського, бичачого й пташиного видiв, вирощених на середовищi ВЛАКОН i Ленвенштейна-Йенсена, а також у морфологи кл^ин при мжроскопи мазюв, пофарбованих за Цiль-Нельсеном.
3. Для диференщаци культур рiзних видiв мжобактерш, що виросли на середовищi ВЛАКОН може бути використана методика реакци аглютинаци ( РА) на скш з наступним фарбуванням i мжроскопуванням, що дозволяе диференцiювати культури людського й бичачого видiв, якi виросли на середовищi ВЛАКОН вiд пташиного виду й атипових мжобактерш.
Л1тература
1.Власенко В.В., Власенко И.Г., Василенко С.П., Колодш С.А., Лысенко А.П. Патоморфологические реакции, вызванные артроспорами микобактерий туберкулеза// Вкник морфологи. —2006. —№12(1). —С. 46-48.
2. Власенко В.В. Туберкульоз в фокусе проблем современности . —Винница: Наука, 1998. —223 с. 5.
3. Колос Ю., Стець В., Титаренко В., Зелшський М., Якубчак О., Хоменко В. До питання дiагностикитуберкульозу в тварин// Ветеринарна медицина Украши — 2006. —№11. —С. 10-12. 1.
4. Овдиенко Н. П., Найманов А. X., Солодова И. В. // Ветеринарная патология. — 2004. — № 1—2. — С. 51—54.
5.Мжробюлопчш методи обстеження хворих на туберкульоз: Методичш рекомендаци МОЗ (на пiдставi нових даних про особливост бюлопчного розвитку М.tuberculosis). —Кшв, 2001. —23 с.
6. Лысенко А. П., Лемиш А. П., Власенко В. В., и др. Изучение термической устойчивости микобактерий туберкулеза. //Проблеми туберкулеза и болезней легких . — 2007. — № 2. — С. 42—45.
18
7. Raviglione M. // Intern. J. Tubercl. Lung Dis. — 2001. — Vol. 5, N 11. - Suppl. 11. - P. 7-8.
Summary
Results of comparative analysis of detection of mycobacteria of tuberculosis using bacterioscopy by Cil-Nilson, cultural examination on Lovenshtein-lensen eggs-environs and expeditious method ( VLACON environ). It was estimated better results of VLACON environ using: decreasing the time of analysis, increasing effectiveness comparatively with Lovenshtein-lensen environ, decreasing the period of extralungs forms of tuberculosis verification, increasing sensitivity and decreasing period of bacteriology diagnostics in oligo - and abacillus tuberculosis patients.
Cmammx nadiumna do peda^ii 25.09.2009
19
