CC BY
10
УДК: 619:616.982.2
Власенко В.В.*, Левкшськнй Д.М.,*** Войцщька О.М.,* Власенко 1.Г.**, Березовський I.B.*, Фаршшк Т.В.*
* Вшныцъкыы нацюналъныы аграрныыутеерсытет ** Вшныцъкыы торговелъно-економ1чныыушверсытет КНТУ *** Лъе1есъкыы нацюналъныыушеерсытет ветерынарногмедыцыны та бютехнологш iмет С.З. Гжицъкого
НОВЕ ПОЖИВНЕ СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ ПРИСКОРБНО! ДЕТЕКЦПЗБУДНИКА ТУБЕРКУЛЬОЗУ
Наведено результаты пор1внялъного дослгдження ростовых якостей розробленого пожывного середовыща зг стымулятором росту та традыцшного середовыща Левенштеына-Снсена. Встановлено, що темпы росту мтобактерш на розробленому середовыщ1 у 10-20 pasie выщ1 пор1вняно з традыцшнымы середовыщамы. Культуры мтобактерш nid час кулътывування на запропонованому середовыщ1 збер^аютъ тынкторыалъш, кулътуралъш та патогенш властывост1.
Ключое1 слова: мтобактерп, пожывш середовыща, бактерюскотя, прыскорет методы выявления мтобактерш.
Вступ. Бактерюлопчш дослщження мають надзвичайно важливе значения в систем! виявлення хворих на туберкульоз i е одним i3 основних KpHTepiÏB у постановщ д1агнозу. В умовах напружено! етдемюлопчио! ситуаци, яка склалася в Укршш [1], особливо гостро постала проблема швидко! та як1сно1 д1агностики туберкульозу. В зв'язку з цим, питания вдосконалення бактерюлопчних дослщжень для д1агностики туберкульозно! шфекци е особливо актуальним [2].
Ниш найбшьш вживаним методом лабораторно! д1агностики туберкульозу е мжробюлопчне дослщження матер1алу - бактерюскотя i nociB на поживш середовища. Бактерюскотчний метод дослщження залишаеться одним з основних. Перевага цього методу в його швидкостг Однак специф1чшсть i чутливкть 6aKTepiocKoniï досить низью.
Оскшьки при прямш 6aKTepiocKoniï мазка, забарвленого за Цшь-Ншьсеном, м!кобактерп туберкульозу можуть бути виявлеш тшьки за дуже велико! ÏX кшькост1 - 5000 - 10000 бактер1альних кл1тин i бшьше в 1,0 мл патолопчного матер1алу. Слщ також зазначити, що пряма мжроскотя не дае можливост1 вщдиференцшвати кислотостшю сапроф1тш 6aKTepiï вщ туберкульозних бактерш [3].
1з культуральних метод1в дослщження найчастше практикують nociB патолопчного матер1алу на так1 яечш середовища як Левенштейна-Снсена, Фшна-2 та ш. Середовище Левенштейна-Снсена рекомендоване ВООЗ для Bcix координацшних лабораторш. Даним середовищем користуеться бшьшкть лабораторш Украши [3]. Цей метод вщр1зняеться бщьшою чутливктю i мае ряд
32
переваг перед методом мшроскопи. Однак необхщно вщм1тити, що кнують фактори, яю обмежують широке застосування методу культивування, а саме повшьне розмноження мжобактерш туберкульозу i в результат! необхщшсть довго чекати результат дослщження.
Культуральний метод д1агностики туберкульозу займае не менше 4-8 тижшв, а негативними вважаються результаты за вщсутност! росту протягом 12 тижшв [4, 5].
Для вдосконалення д1агностики туберкульозу в Укра!ш розроблено «Поживне середовище 3i стимулятором росту для прискореного виявлення збудника туберкульозу».
Мета роботи - вивчення культуральних властивостей розробленого поживного середовища. Обгрунтування застосування його для прискорено! д1агностики туберкульозу велико! рогато! худоби.
Матер1али та методи. Для досл!дження ростових якостей розробленого середовища використовували тест-культури M. tuberculosis H37Rv (колекц!я РИСК iM. Л. А.Тарасевича), M. bovis 8, M. bovis BCG, M. avium 2282 (колекщя ВГНКИ), як! виавали з л!оф!л!зованого стану спочатку на середовище Левенштейна-Снсена, пот!м на середовище Павловського. Бюмасу досл!джуваних штам!в мжобактерш з поверхн! середовища Павловського зшмали в к!лькост! 1 мг за загальноприйнятою методикою i вносили !х в 1 мл стимулятора росту.
Отриману суспенз!ю гомоген!зували електромагн!тною мшалкою протягом 15 хв. У такий cnoci6 отримували робоч1 суспензи, яю в подальшому розводили в стимулятор! росту у сшввщношенш 1:10, ставили на 48 год. у термостат при температур! 37-38° С, а поим у кшькост! 1,0-1,5 мл заавали газоном на розроблене середовище. Контролем служило середовище Левенштейна-Снсена, nociB на яке проводили загальноприйнятою методикою. Для контролю якост! середовищ використовували тест-культуру Staphylococcus epidermidis 1225.
Розроблене нами середовище застосовують для прискореного виявлення мжобактерш туберкульозу. Додатково до нього у набор! додаеться стимулятор росту мкобактерш, який являе собою стерильну, прозору, безбарвну р!дину, що м!стить макро- та м!кроелементи. Для приготування запропонованого середовища брали наважку сухого середовища у к!лькост! 90 г, вносили в 1 л стерильно! дистильовано! води, кип'ятили 2-3 хв. До повного розчинення агару, фшьтрували через ватно-марлевий ф!льтр, розливали у флакони i стерил!зували при (121 ±1.0) С протягом 15 хв. в автоклав!.
Готове середовище мало жовте забарвлення з рН 7,2±0.2. Перед використанням середовище розплавляли на водян!й бан! й розливали по 18-20 мл у стерильш чашки Петр! д!аметром 90 мм.
KpiM тест-м!кроорган!зм!в для досл!дження якост! середовищ використовували бюлопчний матер!ал вщ гв!нейських свинок з експериментальною м!кобактер!альною !нфекц!ею. 3a6ip i п!дготовку
33
бюлопчного матер1алу для бактерюлопчних дослщжень здшснювали за загальноприйнятими методами.
Пщготовлений до nocißy бюлопчний матер1ал у юлькост1 1,0-1,5 мл за допомогою стерильного шприца вносили у стимулятор росту, шкубували у термостат! за температури (37,0 ±1,0) С протягом 24-48 год. Шсля цього 1,5 мл наносили на поверхню поживного середовища, розлитого у чашки Петрг Píbhomípho розподшяли по И площ1, герметизували прозорою липкою стр1чкою та шкубували при 37,0 ±1,0° С впродовж 10 д1б. Паралельно зазначену юльюсть бюлопчного матер1алу виЫвали на середовище Левенштейна-Снсена. Чашки з поЫвами продивлялись щоденно, в1зуально визначали i пщраховували характерш для м1кобактерш колони. 3 отриманих культур готували препарати i фабували ix за методом Цшь-Ншьсена.
Для вщтворення морфолопчно! картини туберкульозу проводили модельш досл1ди на морських свинках i кролях методом внутр1шньочеревного введения культур мжобактерш, вид1лених з бюлопчного матер1алу i вирощених на розробленому середовищ1. Контрольних тварин заражали cycnemiero культур M. tuberculosis H37Rv, M. bovis 8, яю вирощували на запропонованому середовищ1, а також на середовищ1 Павловського.
Через 41 добу п1сля заражения виводили тварин з досл1ду i виконували im патологоанатом1чний розтин. 1з серця в1дбирали проби кров1 у стерильн1 проб1рки з гепарином, додавали р1вний об'ем стимулятора росту i помщали в термостат при 37-38° С на 24 год., пот!м вис1вали на розроблене поживне середовище, МПА i МПБ. 3 культур, що виросли на розробленому середовищ1, готували препарати для м1кроскопи та фарбували ix за Цшь-Ншьсеном.
Для подальшого досл1дження вщ морських свинок в1дбирали naxoBi л1мфовузли, печ1нку, селез1нку й леген1, а вщ крол1в - лише печшку, селез1нку i леген1. Патолог1чний матер1ал обробляли за А. Ал1каевою i суспензш кожного органа вис1вали на середовище Левенштейна-Снсена. Також суспензш кожного органа обробляли стимулятором росту, теля чого вис1вали на запропоноване середовище. Обл1к якост1 i швидкост1 росту культур на середовищах проводили щодня протягом перших 5 д1б, дал1 - з ¿нтервалом 5 д1б до зак1нчення терм1ну ¿нкубацИ. 3 отриманих культур готували препарати для мшроскопи i фарбували i'x за методом Цшь-Ншьсена.
Результати досл1дження.
Вивчення ростових якостей запропонованого середовища проводили пор1вняно з яечним середовищем Левенштейна-Снсена. Результати дослщжень наведено у табл. 1.
Як видно з табл. 1, на розробленому середовищ1 на 2-4 добу культивування почали рееструвати picT культур референтних штам1в M. tuberculosis H37Rv, M. bovis, M. avium 2282, M. bovis BCG, яю дали picT у вигляд1 нап1впрозорих колон1й с1ро-б1лого кольору, ÍHOfli з жовтуватим в!дт1нком, що зливалися, i до 5-6 доби давали суцшьний picT на поверхн1 агаризованого середовища.
34
Таблиця 1.
По|Мвняльна кшьккна характеристика ростових якостей середовища _Левенштейна-Снсена i розробленого середовища._
Тест-м1кроорган1зм Юльюсть проб Термш реестраци росту мжобактерш на середовищах, доба
Левенштейна-Снсена Розроблене р
M. tuberculosis H37Rv 10 42±0,4 3±0,58 <0,001
M. bovis 8 20 40±0,93 4±0,88 <0,001
M. avium 2282 10 41±0,49 2±0,58 <0,001
M. bovis BCG 12 35±0,9 2±0,56 <0,001
S. epidermidis 10 Píct ввдсуттй Píct ввдсутшй
При nepecißi отриманих на даному середовищ1 культурна середовище Левенштейна-Снсена без малах1тового зеленого дослщжуват штами м1кобактер1й збертали тинкториальш та морфолопчт ознаки.
Слщ зазначити, що на запропонованому середовищ1 темпи росту дослщжуваних штам1в мжобактерш перевищували так1 на традицшному середовищ1 Левенштейна-Снсена у 10-20 раз1в. При мкроскопи препарат1в, виготовлених з культур M. tuberculosis H37Rv, M. bovis 8, M. bovis BCG, M. avium 2282, яю виросли на цьому середовищ1 протягом 2-4 д1б, пофарбованих за Цшь-Ншьсеном, спостер1гали характерт для мжобактерш коки, овощи, амебопод1бт форми з порожтм центром i зернистктю рожевого або червоно-фюлетового кольору.
У забарвлених препаратах цих самих культур, яю культивували на розробленому середовищ1, виявляли коки, диплококи, тетракоки, овощи, велику юльюсть паличок pÍ3HOi величини Í3 зернистктю, що засвщчуе 1хню здаттсть до трансформаци у морфолопчт форми кл1тин, яю спостер1гали також за тривалого культивування дослщжуваних штам1в на класичному середовищг
Таким чином, результата вивчення тинктор1альних i морфолопчних ознак м1кобактер1й, яю росли на дослщжуваних середовищах, вказують на придатшсть розробленого середовища для культивування мжобактерш. KpiM того, можливкть реестраци росту дослщжуваних мкрооргашзм1в вже на 2-4 добу культивування на даному середовищ1 може бути використано для виршення питания можливо! прискорено! д1агностики туберкульозу.
Встановлення щентичност1 за чинниками патогенност1 мшобактерш, вирощених на розробленому i традицшному середовищах, проводили in vivo при вщтворюванш шфекцшного процесу при зараженш лабораторних тварин, у яких при подальшому патолого-анатом1чному розтиш виявляли характерш для туберкульозу 3míhh в органах, а при бактерюлопчному дослщженш видшяли збудника туберкульозу.
Таким чином, попередне оброблення патолопчного матер1алу у стимулятор! росту, а також сукуптсть ycix складових запропонованого
35
середовища дае змогу отримати позитивний результат, а саме: скоротити термш бактерюлопчних дослщжень на туберкульоз.
Висновки.
1. Запропоноване середовище просте у приготуванш, що дае змогу заощадити час на пщготовщ до дослщження.
2. PicT тест-культур збудник1в туберкульозу людського, бичачого вид1в як референтних штам1в, так i з патолопчного матер1алу на запропонованому середовищ1 3i стимулятором росту спостер1гаеться на 2-4 добу.
Прискорене виявлення мжобактерш туберкульозу е перспективним напрямом покращення бактерюлопчно! д1агностики туберкульозу.
Л1тература
1. Патоморфологические реакции, вызванные артроспорами микобактерий туберкулеза / В. В. Власенко, И. Г. Власенко, С. П. Василенко и др. // В1сник морфологи. - 2006. - № 12(1). - С. 46-48.
2. Изучение термической устойчивости микобактерий туберкулеза / А.Л. Лысенко, А.П. Лемиш, В.В. Власенко [ и др]. // Пробл. Туберкулеза и болезней легких. - 2007. - № 2. - С. 42-45.
3. Про затвердження шструкци з бактерюлопчно! д1агностики туберкульозу: Наказ МОЗ Украши в1д 06.02.2002 р. №45. - С. 10-12.
4. Визель А. А. Туберкулез / А. А. Визель, М. Э. Гурылева. М.: ГЭОТАР Медицина, 1999. - С. 38.
5. Власенко В.В. Туберкулез в фокусе проблем современности / В.В. Власенко / Винница: Наука, 1998. - 223 с.
Summary
Vlasenko V.V., Levkovsky D., Vlasenko I.G., Voytsitska A.M., Berezovsky I.V., Farionik T.V.
NEW NUTRIENT MEDIUM FOR PATHOGEN DETECTION ACCELERATED TB
The results of a comparative study of growth characteristics of the developed nutrient medium with growth promoters and traditional Levenshtein-Jensen medium. Found that the growth of mycobacteria in the environment developed in 10-20 times higher than traditional media. Culture of mycobacteria in the cultivation of the proposed store tynktoryalni environment, cultural and pathogenic properties.
Key words: Mycobacterium, growth media, bakterioskopiya, accelerated methods for detection of mycobacteria.
Рецензент - к.б.н., доцент Турко 1.Б.
36
