CC BY
12
УДК 619:616.982.2
Власенко В.В., Власенко 1.Г., Палш Г.К., Бабшчук Ю.В., Левктський Д.М. ©
Подтьський науково - дослгдний центр туберкульозу Льв1вський нацюнальний утверситет ветеринарног медицини та бютехнологт ¡мет С.З.Гжицького
СЕРЕДОВИЩЕ ВЛАКОН ДЛЯ ПРИСКОРЕНОГО ВИЯВЛЕННЯ ЗБУДНИКА ТУБЕРКУЛЬОЗУ
У статт1 пор1внюються результати виявлення мтобактерш туберкульозу з використанням бактер1оскотг за Цыь-Ныьсеном, культурального дослгдження на яечних середовищах та прискореного методу (з використанням середовища ВЛАКОН).
Показано, що використання запропонованого поживного середовища мае свог переваги: тдвищуеться чутлив1сть та результативтсть дослгджень, з 'являеться можлив1сть диференщацп культур ргзних видгв мтобактерш за допомогою методики реакцп аглютинацИ (РА) на склг з наступним фарбуванням та мжроскопуванням., значно скорочуеться термт д1агностики туберкульозу.
Ключо^^ слова: туберкульоз, мшобактерп, методи виявлення мтобактерш, поживю середовища.
Вступ. Незважаючи на широкомасштабну профшактику, бия 2 млн. людей щорiчно помирае вщ туберкульозу i половина населення планети шфжовано збудником туберкульозу [7]. Вщомо, що для багатьох антропозоонозних захворювань шнуе бюлопчний ланцюг "тварина — м'ясопродукти — людина", тобто в разi недостатнього контролю продукти харчування тваринного походження, уражеш збудником туберкульозу, можуть передавати збудника (шфекщю) людям [4 ].
Ситуащя iз здоров'ям населення Укра!ни набувае загрозливого стану, загострилась i епщемюлопчна ситуащя з туберкульозу. Щороку в Укрш'ш виявляеться 30-40 тис. хворих на туберкульоз, загальна кiлькiсть тих, хто перебувае тд наглядом л^вально-профшактичних закладiв, становить близько 700 тис. оаб, у т.ч. хворих на активш форми туберкульозу — 140 тисяч. За перюд з 1990 по 2005 рж захворюванiсть на туберкульоз оргашв дихання зросла в 2,4 раза [3]. В 1995 рощ ршенням ВООЗ в нашш кра!ш було оголошено про епщемш туберкульозу. Слiд зазначити, що вщ цього захворювання щорiчно в Укра!ш помирае 10-12 тис. людей. [1].
До тепершнього часу прийнято, що "золотим" стандартом лабораторно! дiагностики туберкульозу залишаеться мiкробiологiчне дослiдження, яке включае бактерiоскопiю i посiв на поживш середовища. Дослiдження мазкiв дiагностичного матерiалу методом люмшесцентно! мжроскопп i фарбування за Цшь-Ншьсеном на кислотостiйкi бактери - найбiльш швидкий спосiб отримання
© Власенко В.В., Власенко 1.Г., Палш Г.К., Баб1йчук Ю.В., Левшвський Д.М., 2010
16
результат. Але специфiчнiсть i чутливють бактерюскопп достатньо низька i культуральна дiагностика матерiалу займае не менше 4-8 тижнiв, а негативними вважаються результати при вщсутност росту протягом 12 тижнiв. Технологи дiагностики, якi iснують за кордоном дороп, i, поки що, малодоступш для широкого використання в Укра1ш [2 ,5].
З метою покращення дiагностики туберкульозу в Укра1ш розроблено «Живильне середовище зi стимулятором росту для прискореного виявлення збудниюв туберкульозу»", яке отримало назву „ВЛАКОН".
Метою нашо! роботи була перевiрка заявлених властивостей i якостi живильного середовища ВЛАКОН для прискорено! детекци туберкульозу.
Матер1али та методи. Для визначення ефективност середовища використовували культури мшобактерш: М. tuberculosis H37 Rv (з колекцп РИСК iм. Л.А.Тарасевича), М. bovis 8, М. bovis BCG, М. avium 2282 (з колекци ВГНКИ), яю висiвали з люфшзованого стану спочатку на середовище Левенштейна-Йенсена, потiм - на середовище Павловського. Отримаш культури на середовищi Павловського зшмали в кiлькостi 1 мг по загальноприйнятш методицi i додавали !х в 1 мл стимулятора росту мжобактерш, а отриману суспензiю гомогенiзували електромагштною мiшалкою протягом 15 хв. Таким чином була отримана робоча суспензiя. В подальшому з робочо! суспензи готовили розведення в стимуляторi росту (1 : 10) i ставили в термостат при температурi 37-38°С на 48 год. Для визначення ростовых якостей контрольних середовищ МПБ, МПА використовували стафiлококову тест-культуру S. epidermitidis (1225)
Використання живильного середовища зг стимулятором росту для прискореного виявлення збуднитв туберкульозу» - „ВЛАКОН". Живильне середовище розфасовано по 100,0 , 250,0 , 500,0 г. Стимулятор росту розлито по 5,0 , 100,0 , 200,0 мл. Збер^али середовище ВЛАКОН у герметично закритш упаковщ з вщносною волопстю не бшьше 60,0 % при температурi вщ 5 до 25 °С. Термш придатностi середовища ВЛАКОН 18-24 мшящв. Середовище ВЛАКОН призначене для прискореного виявлення мшобактерш туберкульозу: стимулятор -для прискорення росту, живильне середовище-для культивування мжобактерш. Стимулятор росту - стерильна, прозора, безбарвна рщина, що мютить мiкро та макроелементи (допускаеться жовтуватий вiдтiнок). Живильне середовище (дрiбнодисперсний, гiгроскопiчний порошок кремового кольору) Для приготування середовища „ВЛАКОН" брали наважку у кiлькостi, зазначенш на етикетцi, розмiшували в 1,0 л стерильно! дистильовано! води, кип'ятили 2-3 хвилини до повного розплавлення агару, фшьтрували через ватно-марлевий фшьтр, розливали у вiдповiдний посуд, стерилiзували при (121,0 ± 1,0) °С протягом 15 хвилин у автоклава
Готове середовище жовтого забарвлення з рН 7,2 ± 0,2, використовували протягом 1 мшяця за умови збер^ання його при (6,0 ± 2,0) °С.
Перед посiвом живильне середовище розплавляли на водянiй баш i розливали в асептичних умовах у стерильш чашки Петрi шаром 6-8 мм (доза18-20 мл).
До 5,0 мл стимулятору росту додавали у асептичних умовах за допомогою стерильного шприца 1,0-1,5 мл пщготовленого шфжованого матерiалу (вiдбiр i
17
пщготовка MaTepiany здшснюеться за загальноприйнятою методикою бактерюлопчних дослщжень згiдно Наказу МОЗ Укра!ни №45-2002р. та чинно! методично! peкомeндaцi! МОЗ - 2001р. [5]. Стимулятор росту забезпечуе видшення мiкобaктepiй Í3 кpовi без !! попередньо! обробки. Отриману су-спeнзiю iнкyбyвaли у термостаи при тeмпepaтypi (37,0 ± 1,0) °С протягом 24 -48 годин i виавали на живильне середовище.
В чашку Пeтpi зi свiжоpозплaвлeним живильним середовищем вносили 1,5 мл суспензи (iнфiковaного мaтepiaлy у стимyлятоpi росту), piвномipно pозподiляючи !! по всiй повepхнi. Чашки Пeтpi не перевертали!, герметизували прозорою липкою стpiчкою та iнкyбyвaли при (37,0 ± 1,0) °С протягом 10 дiб. Посiви продивляються щоденно. Вiзyaльно можна виявити характерний рют мiкобaктepiй уже через 24-48 годин.
З отриманих культур готували мазки i фарбували !х за методом Цшь-Нiльсeнa. Для визначення видово! нaлeжностi збyдникiв туберкульозу, вирощених на сepeдовищi « ВЛАКОН», використовували метод зараження лабораторних тварин - морських свинок i кролиюв. Для контролю зараження тварин застосовували культури М. tuberculosis H37 Rv, M. bovis 8, як вирощували на сepeдовищi ВЛАКОН, а також на сepeдовищi Павловского (контpольнi культури).
Через 71 добу тсля зараження провели забш i пaтологоaнотомiчний розтин тварин. У тварин iз серця вiдбиpaли проби кpовi в стepильнi пpобipки з гепарином, додавали piвний обсяг стимулятора росту й помщали в термостат при 37-38°С на 24 години, поим виавали на живильнi середовища ВЛАКОН, МПА i МПБ. З культури, що виросла на сepeдовищi ВЛАКОН, готували мазки й фарбували !х за Цшь-Ншьсеном. Для подальшого дослiджeння вiд морських свинок вщбирали пaховi лiмфовyзли, пeчiнкy, сeлeзiнкy й легеш, а вiд кpолiв -лише печшку, сeлeзiнкy та легеш. Поим проводили обробку пaтологiчного мaтepiaлy за А. Алiкaeвою i поав сyспeнзi! кожного органа на живильш середовища Левентитейна-Йенсена, МПА, МПБ. Також суспензш кожного органу, обробляли стимулятором росту, тсля чого виавали на середовище ВЛАКОН, як указано вище. Облж росту культур на середовищах проводили щодня протягом перших 5 дiб, а дaлi регулярно з штервалом 5 дiб до заюнчення тepмiнy iнкyбaцi!. З отриманих культур готували мазки i фарбували !х за методом Цшь-Ншьсена.
Для диференщаци культур piзних видiв мiкобaктepiй, що виросли на сepeдовищi ВЛАКОН, ми апробували методику - peaкцiю аглютинаци (РА) на склi з наступним фарбуванням i мiкpоскопyвaнням запропоновану професором А.Лисенко [6].
Як антиген використовували культури мшобактерш iз середовища ВЛАКОН, сироватки - антисироватки до М. bovis Vallee, до aнтигeнiв атипових мiкобaктepiй, а також негативну сироватку кpовi велико! рогато! худоби. Результат реакци враховували протягом 4 хв, тсля чого скло фарбували за Цшь-Ншьсеном, але без дофарбовування метиленовим синiм i мiкpоскопyвaли.
Результати та ix обговорення. Вивчення ростових якостей запропонованого середовища проводили в поpiвнянi з яечним середовищем
18
Левенштейна -Йенсена, МПА, МПБ (контрольш середовища). Результати дослщжень наведенi в табл.. 1.
Таблиця 1.
Результати дослщжень росту тест-штамiв мжобактерш на контрольних та __ дослщному середовищах_
Назва дослщного матер1алу Юльшсть проб на одне середовищ. Результати росту культур на поживних середовищах
МПБ МПА Середовище Левенштейна - Йенсена Середовище «Влакон»(досл1дне)
Факт % Факт % Факт % Факт %
М. tuberculosis H37 Rv, 10 Немае росту - Немае росту - 42 ±0,4 10 100 3 ±0,58* 10 100
М. bovis 8 20 Немае росту - Немае росту - 40±0,93 20 100 4±0,88* 20 100
М. avium 2282 10 Немае росту - Немае росту - 41±0,49 10 100 2±0,58* 10 100
М. bovis BCG 12 Немае росту Немае росту 100 35 ±0,9 12 100 2±0,56* 12 100
S. epidermidis (1225) 10 1±0,49 10 100 1±0,53 10 100 Немае росту - Немае росту -
Примгтка - Примгтка: 1)* - Р<0,001 пор1вняно з показниками середовищем Левенш.-Йенс. (контрольне). 2) Знаменник шльшсть проб, а чисельник через який перюд (д1б) отримано р1ст на вах поавах.
Як видно з результат дослiджень, що на середовищi ВЛАКОН рiст культур референтних штамiв М. tuberculosis H37RY, М. bovis 8, M.avium 2282, М. bovis BCG з'являвся на 2-4 добу у виглядi круглих напiвпрозорих колонш сiро-бiлих кольорiв, iнодi з жовтуватим вiдтiнком, що зливалися до 5-6 доби в «газон». При зворотному переЫванш iз середовища ВК на середовище Левенштсйна-Йенсена без малах^ового зеленого було отримано ршт культур вах штaмiв з характерною для них морфолопею.
При мшроскопи мaзкiв, приготованих з культур М. tuberculosis H37RV, М. bovis 8., , М. bovis BCG , М. avium 2282, яю виросли на середовищi ВЛАКОН протягом 2-4 доби й пофарбованих за Цшь-Нельсеном, спостер^али коки, овощи, прямi й вигнутi палички рiзноl величини, груше-, aмебоподiбнi форми з порожшм центром i зернистютю - рожевого або червоно-фiолетового кольору. У мазках цих же культур 1,5-мюячного росту на середовищi ВЛАКОН виявляли червоного кольору кл^ини розсипу кокiв, дипло-, тетракоки, овощи, велику кiлькiсть паличок рiзноl величини iз зернистiстю (рис2). Таким чином, при тривалому культивувaннi мiкобaктерiй на середовищi ВЛАКОН пiдтвердженa 1х здaтнiсть трансформуватися в класичш форми збудникiв.
У морських свинок, заражених культурами М. tuberculosis H37Rv, M. bovis 8, 11-добового росту на середовищi ВЛАКОН i культурами тих же штaмiв, вирощених на загальноприйнятих живильних середовищах й убитих через 71 добу, виявлеш патолого - aнaтомiчнi змши, хaрaктернi для туберкульозу.
19
При мжроскопи мaзкiв гомогетаив пaтмaтерiaлy спостерiгaли клiтини рожево-червоного кольору коки дрiбнi й велик з порожнiм центром, пaлички коротю й довгi i зернaми по полюсax, прямi й вигнyтi тa пaлички рубшо-червоного кольору. При посiвi гомогенaтiв пaтмaтерiaлy вiд морськиx свинок i кролiв нa середовище ВЛAKОН спостерiгaли рiст нa 2-4 до6у y виглядi дрiбниx круглж нaпiвпрозориx колонiй сiро-бiлиx кольорiв, iнодi з жовтyвaтим вiдтiнком, що зливaються до 5-6 дiб в «газон». При мжроскопп мaзкiв культур 6-15 добового росту, що виросли з пaтмaтериaлy та середовищi ВЛAKОН , спостерiгaли червонi дрiбнi й велию коки, диплококи, овощи з порожшм центром,фуксинофшьш дрiбнi прямi й вигнут пaлички. При посiвi кровi з дослщнж лaборaторниx твaрин нa середовище ВЛAKОН спостерiгaли нa 2-4 добу рют культур iз всix зрaзкiв у виглядi дрiбниx крyглиx колонш бiло-сiрого кольору, що злилися в «гaзон». При мiкроскопiï мaзкiв, приготовлениx з культур, що виросли та середовищi ВЛAKОН протягом 5 дiб, спостерiгaли клiтини рожево-червоного кольору: товст вигнyтi пaлички, прямi тонкi пaлички iз зернистiстю й iншi форми. Встaновлено, що культури мiкобaктерiй людського й бичaчого видiв iз середовищa ВЛAKОН чiтко aгглютинyвaлись aнтисировaткою до M. bovis, i не aглютинyвaлись негативною сировaткою кровi KPC. Демонстрaтивнiсть PA нa склi пiдвищyвaлaся при фaрбyвaннi (по Цшь-Нельсену, aле без дофaрбовyвaння метиленовим синiм ) i таступному мiкроскопyвaннi.
Тaким чином середовище ВЛAKОН признaчене для прискореного виявлення мiкобaктерiй туберкульозу: стимулятор -для прискорення росту, живильне середовище-для кyльтивyвaння мiкобaктерiй, a сyкyпнiсть yсix склaдовиx середовищa ВЛAKОН , якi об'едташ единим творчим зaдyмом, дозволяе одержaти теxнiчний резyльтaт, a сaме скоротити бaктерiологiчнi дослiдження, пiдвищити чyтливiсть методу. 3a рaxyнок новиx ознaк у способi видiлення збyдникa туберкульозу: попередньох' обробки пiдготовленого пaтмaтерiaлy стимулятором тa нового склaдy живильного середовищa для видшення збyдникa туберкульозу створюеться синерпчний ефект, який обумовлюе скорочення тривaлостi iнкyбyвaння мaтерiaлy з одночaсним пщвищенням чyтливостi методу, i як резyльтaт - знaчне скорочення тривaлостi бaктерiологiчниx дослiджень. Paxyеться, що стимулятор росту aктивiзyе татрш-кaлевi нaсоси i деяю ферменти мiкобaктерiй, що стимулюе aдaптивнi структури i спонyкaе швидкому проростaнню в виглядi полiморфниx кл^ин, що мaють зaгaльнi aнтигени з бaцилярними формaми збyдникa туберкульозу тa iдентичнi дiлянки ДНK. Нaпевно, слщ визнaти, що вiдомi yльтрaдрiбнi, коковидш, не кислотостiйкi тa iншi форми- не лише резyльтaт aдaптaцiï збуднига до фaкторiв iмyнноï системи чи дп xiмiотерaпевтичниx препaрaтiв, aле i зaкономiрнi етaпи, в якиx клaсичнa «бaцилa Kоxa»- лише однa з CTaArn життевого циклу збyдникa туберкульозу.
Висновки:
1.3aстосyвaння середовищa ВЛЛЕОН зi стимулятором росту дозволяе нa 2-4 добу виявити рют культур збудниюв туберкульозу людського, бичaчого видiв як референтниx штaмiв, тaк i з пaтмaтерiaлy й кровi твaрин, зaрaжениx збудником туберкульозу.
20
2.Не встановлено ч^ких розходжень у морфологи культур збудниюв туберкульозу людського, бичачого й пташиного видiв, вирощених на середовищi ВЛАКОН i Ленвенштейна-Йенсена, а також у морфологи кл^ин при мжроскопи мазюв, пофарбованих за Цiль-Нiльсеном.
3. Для диференщаци культур рiзних видiв мжобактерш, що виросли на середовищi ВЛАКОН може бути використана методика реакци аглютинаци ( РА) на с^ з наступним фарбуванням i мшроскопуванням, що дозволяе диференцiювати культури людського й бичачого вцщв, якi виросли на середовищi ВЛАКОН вiд пташиного виду й атипових мжобактерш.
Л1тература
1.Власенко В.В., Власенко И.Г., Василенко С.П., Колодш С. А., Лысенко А.П. Патоморфологические реакции, вызванные артроспорами микобактерий туберкулеза// Вкник морфологи. —2006. —№12(1). —С. 46-48.
2. Власенко В.В. Туберкульоз в фокусе проблем современности . — Винница: Наука, 1998. —223 с. 5.
3. Колос Ю., Стець В., Титаренко В., Зелшський М., Якубчак О., Хоменко В. До питання дiагностики туберкульозу в тварин// Ветеринарна медицина Украши —2006. —№11. —С. 10-12. 1.
4. Овдиенко Н. П., Найманов А. X., Солодова И. В. // Ветеринарная патология. — 2004. — № 1—2. — С. 51—54.
5.Мшробюлопчш методи обстеження хворих на туберкульоз: Методичш рекомендаци МОЗ (на пiдставi нових даних про особливост бюлопчного розвитку M.tuberculosis). —Кшв, 2001. —23 с.
6. Лысенко А. П., Лемиш А. П., Власенко В. В., и др. Изучение термической устойчивости микобактерий туберкулеза. //Проблемы туберкулеза и болезней легких . — 2007. — № 2. — С. 42—45.
7. Raviglione M. // Intern. J. Tubercl. Lung Dis. — 2001. — Vol. 5, N 11. -Suppl. 11. - P. 7-8.
Summary
Results of comparative analysis of detection of mycobacteria of tuberculosis using bacterioscopy by Cil-Nilson, cultural examination on Lovenshtein-lensen eggs-environs and expeditious method ( VLACON environ). It was estimated better results of VLACON environ using: decreasing the time of analysis, increasing effectiveness comparatively with Lovenshtein-lensen environ, decreasing the period of extralungs forms of tuberculosis verification, increasing sensitivity and decreasing period of bacteriology diagnostics in oligo - and abacillus tuberculosis patients.
Стаття надшшла до редакцИ 7.09.2010
21
