Межмолекулярные взаимодействия в системах биополимер - вода по данным спектров ПМР Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

равновесия измеряют рНь Затем добавляют точно 0,5 мл 0,1 п. раствора щавелевой кислоты в качестве стандарта, перемешивают раствор и измеряют рН2. По формуле (3) вычисляют значение суммы ТК карамели. Время одного определения не более 3 мин. Результаты рН-метрического определения ТК в разных сортах карамели приведены в таблице. Расхождение с данными титриметрпчес-

Таблица

Сорт карамели Значения ,ТК п їа» к ! и СО в 1 у х

по ГОСТ рН-мет-рнчес-ким методом

Золотистая 7,4 7,4 5 2,78 1.01

Барбарис 8,6 8,6 7 2,45 0,42

Дюшес 15,1 14,9 7 2,45 0,78

Театральная 3,2 3,3 5 2,78 0,58

Ме^та 7,2 7,0 5 2,78 0,92

кого анализа по ГОСТ 5948—87 не превышали ±10%- Основные достоинства нового метода — экспрессность, простота исполнения, что позволяет автоматизировать контроль ТК, исключив титрование.

Выводы

1. Разработанный новый рН-метрический метод определения титруемых кислот карамели основан на взаимодействии суммы кислот с реагентом — уротропином (гексамети-лентетрамином).

2. Новая методика экспрессна, проста в исполнении, возможна автоматизация контроля ТК в карамели.

■ ЛИТЕРАТУРА

1. А. с. 740886 (СССР). Способ определения кислотных чисел масел в маслосодержащих материалах /Я. И. Турьяп, И С. Арутюнян, С. II. Даннль-

чук, С. П. Диденко, В. В. Ключкин. А. Б. Белова, А. М. Чудновская /Опубл. в Б. II. — 1980 — № 277.

2. А.с. 989476 (СССР). Способ автоматического и непрерывного контроля кислотных чисел /Я. И. Турьян, П. II. Кудинов, А. М. Малышев, II. К. Стрижов, И. С. Арутюнян //Заявл. 22.03.76 № 2335891. — Опубл. в Б. И. — 1982. — № 2.

3. А. с. 1097946 (СССР). Способ определения суммы органических кислот в продуктах переработки винограда, ягод и плодов /Я. И. Турьян, И. М. Павленко, И. К. Стрижов, Г. Л. Лошкарев, Т. Л. Парфентьева, Л. М. Макарова и др. //Заявл. 30.09.80 г. № 2991449.

4. А. с. 1605200 (СССР). Способ потенциометрического определения суммы органических кислот в продуктах переработки винограда ягод и плодов /Я. И. Турьяп, О. Е. Рувинский, Л. М. Макарова, Герасименко //Заявл. 01.09.87 г. № 432010.

5. А. с. 1002940 (СССР). Способ количественного определения инвентарного сахара в растворе /О. Е. Рувинский, М. Б. Ланатина, Л. В. Тюрина. — Опубл. в Б. И. — 1983. — № 9.

6. А. с. 1300375 (СССР). Способ определения ип-вертного сахара в продуктах виноделия /Р. И. Сту-пакова, О. Е. Рувинский. — Опубл. в Б. И. — 1987. — № 2.

7. ГОСТ 10858—77. — М.: Изд-во стандартов, 1986.— 7 с.

8. ГОСТ 5476—80. — М.: Изд-во стандартов, 1982. — 9 с.

9. ГОСТ 26971—86. Зерно, крупы, мука, толокно для продуктов детского питания. Метод определения кислотности.

10. ГОСТ 5948—87. Изделия кондитерские. Методы определения кислотности и щелочности.

11. Г о и ч а р е и ко Б. И., Рыбалко Г. К., С и-

доров А. С. п др. Экспресс-информация. Пит.

пром-сть. — М.: АгроНИИТЭИПП, 1988. — Сер. 20. — Вып. 1. — 16 с.

12. Турьяп Я. И., Р у в и н с к п й О. Е., М а к а-р о в а Л. М., Герасименко Е. О. Косвенное потенциометрическое определение смеси слабых кислот (оснований) //Электрохимия. — 1985. — 21. — № 7. — С. 984.

Кафедра аналитической химии Поступила 18.12.91

мецак і

! /Жі-ППІ

’ГО Ори

і 'У-'. 1 ■:

ТЬдї

с.ич::-

■I |

г,1 1-І).-

о |>.ч ч ;

\ і_1

“С г--. |.-:м я і. -.';ч..ч

фьіУ-.: г 1.^14 ./ і!іі + -і-; Оі.у,- <■ ■:и. м: у І

Г.'РНОЯ 11 і- р. .. ТГІ.: і і НТГН

і-.і-Ч.'Р'ї.

ШьІК' І,

и--:п -а

:.фГ( І и : 1-е. .С':!

Ь ,

М^К7ІГЯ

' "" С;?

#1 ГГІКЛ:

664.8.037.1:66.093.4

Л1ЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В СИСТЕМАХ БИОПОЛИМЕР-ВОДА ПО ДАННЫМ

СПЕКТРОВ ПМР

Т. Д. ПИЛИПЕНКО, Ю. Л. ЖЕРЕБИН, Е. Н. ПОЛУЭКТОВА,

М. Ю. КОРНИЛОВ, В. Д. БОИЧЕПКО ;-

Одесский технологический институт пищевой промышленности им. М. В. Ломоносова Киевский ГоИмрственный университет мм. Т. Г. Шевченко

"■'“гЛ -

При изучении подвижности и состояния Такое явление обнаружено нами для образ- и Хеии

воды при гидратации биополимеров методом нов геля пектина, высокобелковой кукуруз- ™ЮрI*VI

протонного магнитного резонанса (ПМР) пой пасты, полученной из отходов кукурузо- Б(.чм |

обнаружено явление расщепления основного крахмального производства, и меланина, по- рт хемт:!*

сигнала воды на дублет со смещением одного лученного из кварцетина. гггм

сигнала в сильное, другого — в слабое поле. Мы предположили, что два частично сов-

I Ill

!!?l!

i.l'V-n I' і .■ il і: I і ft •■■■< "і з - V' 5

■ иу.м Г-1

і^ ■ і:.jт'к■

I V!

II, I .и

Чї

jmh " i“ "

й I ......

■

I Ik ■■

і:..H-y. N

ї. .і my !:■ I

i,. 198G.

|І982. —

HI II "Mil :i;i..' .!■ .( ■

Методы

С и-Пищ.

— Сер.

h£-f=z;i: И" Vifc - і;! -

[II Г V>\

КЙ:'№-4

мещенных сигнала принадлежат поде с одинаковой степенью связи с макромолекулами, по ориентированными различным образом в пространстве.

Подобное явление наблюдали другие исследователи в спектрах пленок ацетилцеллюлозы [1], частично ориентированной пленки монтмориллонита [1, 2], ионообменных мембран [3] п частично ориентированных пленок слоистых силикатов [4]. Ширина линии поглощения магнитно/'! энергии для пленок ацетилцеллюлозы, ориентированных параллельно и перпендикулярно магнитному полю, была в 100 раз меньше, чем для измельченных образцов. Это говорит о большей подвижности молекул воды, ориентированных в определенной плоскости. Причем смещение в сильное поле относительно сигнала свободной воды для перпендикулярно ориентированных пленок больше, чем смещение в слабое поле параллельно ориентированных пленок ацетилцеллюлозы.

Авторы [5], исследуя спектры ЯМР воды, адсорбированной на коллагене, также пришли к выводу, что величина дублетного расщепления сигнала воды должна зависеть от ориентации образца в магнитном поле. Другие исследователи [6] пришли к аналогичным вывода м.

В нашем случае, в спектре ПМР образца пектинового студня при +20°С видно (рис. 1), что суммарный спектр представляет собой асимметричную линию.

i-Vp.i J "V к і у ;■ о -

,Lli-

I ! . 1І-КЇ-:

Интенсивный сигнал представляет собой дуплет с расщеплением на сигналы большей и меньшей интенсивности, расстояние между которыми 5 Гц или 0,05 м. д.

Если предположить, по аналогии с экспериментом [1], что полоса поглощения меньшей интенсивности, смещенная в сильное поле, соответствует молекулам воды, ориентирован-

ным перпендикулярно полю, а полоса большей интенсивности, смещенная в слабое поле, молекулам, ориентированным параллельно полю, то оказывается, что в пектиновом геле, кроме свободной воды, существует вода, определенное количество которой ориентировано по полю и перпендикулярно полю магнитов спектрометра.

Молекулы этой воды расположены в анизотропных слоях, прилегающих к спиралеобразным макромолекулам полисахарида, образуя мицеллы. Ориентация коллоидных частиц в магнитном поле и образование из них упорядоченных агрегатов показано ранее другими авторами [7].

Регулярное строение пектинового геля приводит к поглощению магнитной энергии в обеих ориентациях в отличие от существующего мнения, что при параллельной ориентации молекул связанной воды сигнал ЯМР должен совпадать с сигналом свободной воды [8].

Рис. 2

В спектре ПМР с добавкой 020 образца высокобелковой кукурузной пасты при +23°С (рис. 2) видно более ярко выраженное расщепление на два сигнала, расстояние между которыми 8 Гц или 0,08 м. д.

В спектре ПМР образца меланина в Н+-форме, полученном пз кверцетина в интервале температур —3...—38°С и нерастворимом в НгО н ОзО, также наблюдается дублетное расщепление сигнала, которое появляется при понижении температуры образца, набухшего в Н20, когда более подвижная часть влаги, связанной с образцом, вымораживается. Расстояние между сигналами составляет 3 Гц или 0.03 м. д. Более интенсивный сигнал, по аналогии с предыдущими исследованиями, можно отнести к перпендикулярно ориентированным молекулам воды. Эта составляющая спектра при понижении температуры до —13°С уменьшается интенсивнее, чем параллельно ориентированная, что говорит о ее изотропном состоянии. Очевидно, параллельно ориентированная влага, находящаяся в адсорбированном на поверхности анизотропном слое, сохраняет свою подвижность при более низких температурах — до —38°С благодаря большей энергии, выделяющейся при переориентации молекул в этом

слое, так как они оолее кооператпвны в своем движении, чем расположенные перпендикулярно полю. Расстояние между Ми ! ориентированными составляющими спсктров меланина в процессе понижения температуры остается до —28ЧС постоянным и исчезает при —38сС, т. е. сигналы полностью совмещаются.

Разница в положении сигналов | | и | ориентации молекул образца зависит, по мнению [1]. от природы окружающей среды и количества адсорбированной воды, причем большее смещение в магнитном поле наблюдается Цля I ориентированных молекул.

Основными источниками смещении сигналов ЯМР, по данным [1], являются взаимодействия с парамагнитными центрами па поверхности, роль которых в меланинах могут выполнять неспаренные электроны радикалов (наличие их подтверждают спектры ЭПР), влияние неоднородности магнитной восприимчивости, релаксационные процессы, образование связей между адсорбированными молекулами и активными центрами поверхности. Автор [1] рекомендует учитывать эти явления про анализе спектров ЯМР адсорбированных молекул. |

07Л

оЛ

оА

оу\

a,si 4,2-

< so 40

02 \

Рис. 3 ’

Исследование температурных зависимостей химических сдвигов || и | ориентаций протонов воды в спектрах ПМР набухшего в воде меланина, полученного пз кверцетина, также показывает (рис. 3) большую величину смещения с температурой для^ ориентированных молекул.

Интересно отметить, что обе ориентации резко уменьшают химический сдвиг при —23°С, ’образуя на кривых впадины. При —7°С эти кривые пересекаются, очевидно, при этой температуре химические сдвиги обеих составляющих одинаковы, равно как и их магнитные свойства. ■.

Аналогичное явление обнаружено [9] при изучении изменения ширины линии ПМР воды с температурой у зеленого горошка и перца, где при —7=С наблюдались на кривых аномальные ушпрения линий спектров, что связано, очевидно, с определенным поведением молекул воды в магнитном поле, независимо от свойств образца.

Температурная зависимость химических

сдвигов протонов воды в спектрах ПМР раствора меланина в МН4+-форме, полученного из растительных отходов, имеет аналогичную форму, однако незначительное уменьшение

химического сдвига здесь наблюдается при температуре —18...—23°С. Резкое увеличение химического сдвига в положительную сторону наблюдается в интервале 0...—4°С, что связано с образованием в растворе мицеллярной системы, инициированной ассоцнатами макромолекул меланина. Форма кривой свидетельствует о большем интервале изменений химических сдвигов протонов воды водорастворимой формы меланина, т. е. об ее устой-

чивости в растворе, возможно, за счет образования аквакомплексов.

Таким образом, при изучении гидратации биополщмеров методом протонного магнит-1 пого резонанса (ПМР) обнаружено расщепление сигнала ПМР воды на дублет. Смещение сигналов интерпретируется как зависящее от различной ориентации в магнитном поле молекул адсорбированной воды, имеющих одинаковую степень связи с макромолекулами.

Увеличение химического сдвига предположительно связано со структурой макромолекул, влияющей па поведение мнцеллярных и ассоциативных систем при понижении температуры. ; ;

ЛИТЕРАТУРА

1. Манк В. В. Особенности спектров ЯМР молекул в гетерогенных системах //Укр. хим. ж. — 1978. — 44. — № 9. — С. 911.

2. Манк В. В., Кучерук Д. Д. Исследование состояния воды в полупроницаемых мембранах из

ацетилцеллюлозы методом ЯМР //Коллондн. ж. — 19,73. — 35. — Вып. 6. — С. 1073.

3. М а и к В. В., Куче р у к Д. Д., Куриленко

О. Д. Ядерный магнитный резонанс протонов воды в ионообменных мембранах //Журн. физ. химии. — 1977. — 51. — № 7. — С. 1603.

Й.

Манк В. В. Про причини розширення ліній адсорбованих молекул //Докл. АН УССР, сср

ЯМР

Б. —

1973. — № 10.

Г а б у д а С. П. нитный резонанс ванных белках. 157 с.

С. 924.

Р ж а в и н А. Ф. Ядерный маг-і кристаллогидратах и гидратиро-- Новосибирск: Наука. 1978. —

6. Lenk R., Bonzon М., Greppin И. Di-namically or iented Biological Water as studied bv NMR //Chem. Phys. Gen. — 1980. — V. 78, N 1. — P. 175.

7. Ефремов И. Ф. Периодические коллоидные структуры. — Л.: Химия /Ленингр. отд. — 1971. — 192 с.

І.Г IIII

РЧ

Jj

А

[J.J.I

УіМ d

I L .. I: - О

С-0; :і к II'jjli::

-k’UJIO H£U7lll JiO- !■." L'iU. IО

Сдч і -к?* г і m kt's

і

“.V. ті.^І t по.-.--::.

T' l U'ji л ;ц

L'J пт

к::л*гр

і T X FII .j Tfi к tr;1 ке/mp к

"-'.'1 (L

■r Щ:

їгил

В n StU К

jj, я

п.іП .-■] Г?

ГСкА ґ<\і

фуіщ

fULM.T| MhiT•*<]'■

i: с j- li \\

Г | IH ргл| KHfV ]

к Щ ■.

0-::м.п .тпліі :! і ІСГЛ

m ini

I

і ігк.і rt к 11: к к v

:: 1 . :'J

I ;j.:i f и

. L І-1 Л

U. 1-і:-.

'I-.I.IiOiO

I'. 'I - ч ) 11':

L1LL '!r

l -і i;n crropo;rv

> tfifT \,Г. \У< VT

I r. t' "гГ-

■;i г■ jv||hi ^ ..і

fc л'С ігиі -нОрї

ip.il ПІ( Tl

„гип.'ч-

■K.I.U -1? f ! ll ^L- .11

: і f № l .'Jiili'.i ■-Li-.;. 14-

■■.-.I'j.'n-

iWcjft.-

vpi .j-; и

IT U-.'.I

I

Го —

"Is.ll'J iJ-i|ii. JV ..=■ !. „f.

I |l 1 I* if. 5. ■HC S '"■h. SJ'.! II.

I П :;hP

...- n -1-

[ЧД-Ї- .|H>

І.І H ПІ-

rj|::- .V uOt. —

nv. ■ і. і

- m\.

ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, № 2, 1992:

8. Gradztajn S.. Conard I., Benoit H. Stude de la Surface de Solides par RNM de Liquides Adsorbe. J. Origine du deplacement et de la Largeur des Raies dans le Cas des Carbones //J.Phys. Chem. Solids. — 1970. — V. 31, N f.

9. Пилипенко Т. Д., Кротов Е. Г., М а и к В. В. Изменение биохимического состава плодов и овощей в процессе холодильной обработки и его влияние на обратимость воды по данным ПМР //Холодильная техника. — 1986. — № 4. — С. 20.

Кафедра аналитической химии Поступила 28.06.90 Кафедра органической химии

— С. 1121.

- ГДУ ■ ■■ -Г». — ™.

663.262.002.612

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ И ЭКСТРАКТОВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ

5АССНАНОМУСЕБ САРЬЗВЕРОЕКБІЗ

Г. ЦНХОШ. Е. РЫМАШЕВСКИ, М. КУЯВСКП, X. КОСТЫРА

Институт технологии молочного дела Сельскохозяйственно-техническая академия в Ольштыне, Польша

При характеристике ферментов, синтезируемых некоторыми расами дрожжей, важно не только дать оценку их протеолитнческой, сбраживающей или декарбоксилирующей активности, но также определить физико-химические свойства и изучить структуру ферментного белка. Эти данные особенно необходимы при попытках изолировать ферменты, синтезируемые в клетках дрожжей.

Одним из способов характеристики таких сложных систем, как внутриклеточные экстракты и экстракты клеточной стенки дрожжей Sacch. carlsbergensis, является спек-трофотометрия в инфракрасном диапазоне [1,2]. На основании присутствия в ИК-сиектре полос, характерных для определенных групп и связей, можно судить о химическом составе исследуемых проб.

В этой работе, предшествующей попыткам изолировать протеазы. мы хотели бы представить характеристику внутриклеточных экстрактов и экстрактов клеточной стенки некоторых рас дрожжей Sacch. carlsbergensis ira основании спектров поглощения ПК и УФ, а также хроматографического разделения на сефадексе G-75.

В опыте использовали 5 рас дрожжей Sacch. carlsbergensis — АТСС, В2, Di,

Mis, SW. Дрожжи размножали па питательной среде из пивного сусла (ферментатор New Brunshwick FS-314) в условиях, описанных ранее [3, 4]. Дрожжевые клетки центрифугировали при 3600 g в течение 15 мин (центрифуга Beckman J-21 С ). Осадок промывали стерильной дистиллированной водой и снова центрифугировали. Полученную биомассу замораживали при —20°С и дезинтегрировали механическим методом иод давлением с помощью дезинтегратора Biotex •— Х-25 (давление 200 МПа) [5].

Осадок дезинтегрированных клеток разбавляли фосфатно-цнтратным буфером pH 6,6. а после 2 ч мацерации центрифугировали

при 3600 g в течение 15 мин, получая таким образом внутриклеточный экстракт.

Оставшийся после центрифугирования осадок разбавляли 2 М раствором NaCl и после 2 ч мацерации центрифугировали в указанных условиях, получая экстракт клеточной стенки [6]. Экстракты консервировали по методу сублимационной сушки (Heto ■— Дания) и хранили при +4°С. Восстанавливали экстракты путем растворения лиофилизатов в стерильной дистиллированной воде.

Хроматографическое разделение проводили па колонке Pharmacia 26/100, наполненной сефадексом G-75. Наносили 100 мг белка и элюировали Na-фосфэтным буфером pH 7,0 со скоростью 60 см3/ч [7]. Поглощение при 280 нм регистрировалось автоматически — проточная кювета 0,5 см в аппарате ISCO (США). Элюат собирали с помощью автоматического коллектора фракций и определяли присутствие нуклеиновых кислот путем измерения поглощения при 260 нм (спектрофотометр Zeiss VSh-2).

В экстрактах, а также в полученных путем хроматографического разделения фракциях определяли содержание белка [8].

Относительную молекулярную массу фракций вычисляли по следующей формуле [7].

logM = 5,624—0,752 —^ ,

V О

где log М — относительная молекулярная

масса;

Ve — объем фракции;

Vo — наружный объем колонки.

Спектр поглощения в УФ определяли по

Leggett Baillev [9]. С целью исключения нуклеиновых кислот пробы подвергли гидролизу с использованием 98% муравьиной кислоты при 170°С в течение 1 ч [1].

Спектр поглощения в НК определяли

в диапазоне 46-100 — 7-100 см-1 (спектрофотометр IR-71 Carl Zeiss— йена). Из проб экстрактов изготовили таблетки с бромистым