CC BY
55
î
'.il іри
f
і ігк.і rt к 11: к к V
:: 1 . ■)
I , j.:i f n . LI-1 Л
U. I*:-
Ч-.І.ІІ'.ТО 'I - 4 L1LL "!r
L -і r;n
^-ropci’j-ï-.n \,r. \y< fl
І r. t' "гГ-
■;i г■
..і
nOpï
îfa.âmf ті „гип.'ч-
■K.I.U -1Í ¡r ! il -K.' .11 : і ■ ■ il № L .'Jiill'.l .-l!-.;. 14-
■■.-.l'j.'n-
Урі .J-l 11 IT ft id
I
' >.î.li ■ I —
1.1 rill“ Ï J-i|iii Г,
!. „f.
I il 1 I- .h s. ■Hi: 's. “■■..K.
V И-I II
... її ■:і-[ЧД-Ї- .|гі>
1.1 н Пі-
rj|::- .V uöt.----------
nv. ■ і. і
- m\.
8. Gradztajn S.. Conard I., Benoit H. Stude de la Surface de Solides par RNM de Liquide? Adsorbe. J. Origine du déplacement et de la Largeur des Raies dans le Cas des Carbones //J.Phys. Chem. Solids. — 1970. — V. 31, N f.
9. Пилипенко Т. Д., Кротов Е. Г., М а и к В. В. Изменение биохимического состава плодов и овощей в процессе холодильной обработки и его влияние на обратимость воды по данным ПМР //Холодильная техника. — 1986. — № 4. — С. 20.
Кафедра аналитической химии Поступила 28.06.90 Кафедра органической химии
— С. 1121.
- ГДУ ■ ■■ -Г». — ™.
663.262.002.612
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ И ЭКСТРАКТОВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ
SACCHAROMYCES CARLS BERGENS IS
Г. ЦНХОШ. Е. РЫМАШЕВСКИ, М. КУЯВСКП, X. КОСТЫРА
Институт технологии молочного дела Сельскохозяйственно-техническая академия в Ольштыне, Польша
При характеристике ферментов, синтезируемых некоторыми расами дрожжей, важно не только дать оценку их протеолитнческой, сбраживающей или декарбоксилирующей активности, но также определить физико-химические свойства и изучить структуру ферментного белка. Эти данные особенно необходимы при попытках изолировать ферменты, синтезируемые в клетках дрожжей.
Одним из способов характеристики таких сложных систем, как внутриклеточные экстракты н экстракты клеточной стенки дрожжей Sacch. carlsbergensis, является спек-трофотометрия в инфракрасном диапазоне [1,2]. На основании присутствия в ИК-спектре полос, характерных для определенных групп и связей, можно судить о химическом составе исследуемых проб.
В этой работе, предшествующей попыткам изолировать протеазы. мы хотели бы представить характеристику внутриклеточных экстрактов и экстрактов клеточной стенки некоторых рас дрожжей Sacch. carlsbergensis ив основании спектров поглощения ПК и УФ, а также хроматографического разделения на сефадексе G-75.
В опыте использовали 5 рас дрожжей Sacch. carlsbergensis — АТСС, В2, Di,
Mis, SW. Дрожжи размножали па питательной среде из пивного сусла (ферментатор New Brunshwick FS-314) в условиях, описанных ранее [3, 4]. Дрожжевые клетки центрифугировали при 3600 g в течение 15 мин (центрифуга Beckman J-21 С ). Осадок промывали стерильной дистиллированной водой и снова центрифугировали. Полученную биомассу замораживали при —20°С и дезинтегрировали механическим методом иод давлением с помощью дезинтегратора Biotex •— Х-25 (давление 200 МПа) [5].
Осадок дезинтегрированных клеток разбавляли фосфатно-цнтратным буфером pH 6,6, а после 2 ч мацерации центрифугировали
при 3600 g в течение 15 мин, получая таким образом внутриклеточный экстракт.
Оставшийся после центрифугирования осадок разбавляли 2 М раствором NaCl и после 2 ч мацерации центрифугировали в указанных условиях, получая экстракт клеточной стенки [6]. Экстракты консервировали по методу сублимационной сушки (Heto ■— Дания) и хранили при +4°С. Восстанавливали экстракты путем растворения лиофилизатов в стерильной дистиллированной воде.
Хроматографическое разделение проводили па колонке Pharmacia 26/100, наполненной сефадексом G-75. Наносили 100 мг белка и элюировали Na-фосфатньш буфером pH 7,0 со скоростью 60 см3/ч [7]. Поглощение при 280 нм регистрировалось автоматически — проточная кювета 0,5 см в аппарате ISCO (США). Элюат собирали с помощью автоматического коллектора фракций и определяли присутствие нуклеиновых кислот путем измерения поглощения при 260 пм (спектрофотометр Zeiss VSh-2).
В экстрактах, а также в полученных путем хроматографического разделения фракциях определяли содержание белка [8].
Относительную молекулярную массу фракций вычисляли по следующей формуле [7].
logM = 5,624—0,752 —^ ,
V О
где log М — относительная молекулярная
масса;
Ve — объем фракции;
Vo — наружный объем колонки.
Спектр поглощения в УФ определяли по
Leggett Bailley [9]. С целью исключения нуклеиновых кислот пробы подвергли гидролизу с использованием 98% муравьиной кислоты при 170°С в течение 1 ч [1].
Спектр поглощения в ПК определяли
в диапазоне 46-100 — 7-100 см“1 (спектрофотометр IR-71 Carl Zeiss— йена). Из проб экстрактов изготовили таблетки с бромистым
калием (2 мг лиофилизата смешивали с 800 мг КВг) [1].
Хроматографическое разделение на сефа-дексе С-75, вполне пригодное для фракционирования пекарских дрожжей ЗассЬ. сеге\лэ1ае [10], не выявило существенных различий между внутриклеточными экстрактами и экстрактами клеточной стенки (табл. 1). В результате разделения экстрактов БассЬ. сагЬЬе^ег^в АТСС, В2 и получили по две внутриклеточные фракции и по две фракции клеточной стенки. Во всех
фракциях, кроме белка, присутствовали также нуклеиновые кислоты. По всей вероятности, нуклеиновые кислоты образуют комплекс с ферментными белками, причем это относится как к внутриклеточным экстрактам, так и к экстрактам клеточной стенки. Молекулярная масса нуклепротенда внутриклеточных экстрактов составляла 45 тыс. даль-тонов для фракции 1 и менее 5 тыс. дальто-пов для фракции II. Подобные результаты получили для экстрактов клеточной стенки.
Таблица 1
Раса Фракция Внутриклеточный экстракт Эк стракт клеточной стенки
содержание белка относительная молекулярная масса, дальтон содержание белка относительная молекулярная масса, дальтон
мг/1мл %• мг/мл 1 %
I 0,19 8,04 45 000 0,07 6 40 000
АТСС II 0,33 61,66 5 000 0,35 45 5 000
I 0,37 5,00 45 000 0,16 18 45 000
в2 II 0,88 34,12 5 000 0,30 42 5 000
I 0,25 20,41 45 000 0,32 21 45 000
II 0,42 31.22 5 000 0,29 48 5 000
I 0,29 22,42 45 000 0,33 19 45 000
М15 II 0,10 9,96 40 000 — — 40 000
III 0,36 46,35 5 000 0,18 21 5 000
I 0,34 9,91 45 000 0,11 4 45 000
II 0,91 30,20 45 000 0,16 22 40 000
III 0,44 51,48 5 000 0,39 68 5 000
В результате хроматографического разделения экстрактов дрожжей Sacch. carlsbergen sis Mi5 и SW получено по три фракции. Молекулярная масса соответствующих фракций внутриклеточных экстрактов и экстрактов клеточной стенки была подобной. Она составляла 45 тыс. дальтонов для фракции I и менее 5 тыс. дальтонов для фракции III. В свою очередь, молекулярная масса фракций II была различной (40 тыс. дальтонов —• экстракты Mis и экстракт клеточной стенки SW, 45 тыс. дальтонов — внутриклеточный экстракт SW).
По отдельным фракциям количество полученного белка по отношению к нанесенному на колонку было различным: от 4,41 до
22,4% Для фракции I, от 10,0 до 68,5% для фракций II и III. Ни в одном из случаев не получили 100% нанесенного белка, так как часть его была элюирована во время разделения.
Для исследуемых экстрактов определили также спектры поглощения УФ. На рис. 1 представлен УФ-спектр внутриклеточных экстрактов (А) и экстрактов клеточной стенки (В) различных рас дрожжей Sacch. carlsbergen-sis (сплошные кривые — перед гидролизом, штриховые — после него). Все полученные кривые поглощения имеют типичную параболическую форму и при 260 нм характеризуете более ъькокой экстиикщ\ей, нежели при 280 нм. В спектрах экстрактов, подвергнутых кислотному гидролизу, отметили повышение экстинкции при 260 и 280 нм. Повышение экстинкции при 260 нм объясняется тем, что сумма экстинкции нуклеиновых компонентов
была большей, нежели экстинкция полинуклеотида. В свою очередь, повышение поглощения белками ультрафиолета при 280 нм: связано с тем, что в результате гидролиза нуклеиновых кислот были открыты тирозино-вые и триптофановые остатки, вызывающие в; белке поглощение ультрафиолетовых лучей.
Примененные условия гидролиза могли также вызывать разложение глюкозидных связей с освобождением восстанавливающих сахаров, предрасположенных к реакции Мейяра. Однако следовые количества аминосоедине-ний не повышали значительно поглощения при 260 нм, являющегося показателем присутствия нуклеотидов, образовавшихся в результате гидролиза нуклеиновых кислот.
Для определения вида связен, имеющихся в экстрактах клеток дрожжей БассИ. саг15Ье^епз1з, провели их характеристику в ИК-спектре (рис. 2). Исследуемые экстракты являются сложными системами, в состав которых входят прежде всего такие соединения, как белки, нуклеиновые кислоты, жиры и сахариды. Эти соединения характеризуются подобными диапазонами поглощения в ИК. Различия в количественном и качественном составе исследуемых экстрактов проявляются в расположении отдельных полос и их интенсивности [8].
Первая полоса поглощения характерна как для белков, так и для нуклеиновых кислот, сахаридов и липидов. V большинства белков полоса валентных колебаний групп ЫН является максимальной в пределах 3310— 3280 см-1. Валентные колебания ]\1Н в пеп-тидной группе без водородной связи харак-
OS-i
04’;
0Л ч i \
оа\ \
! V ш ч у
250 300 3&} 400 450 500 пт 250 300 550 400 450 500 пт
«И 32
»■ \ ОБ-GC :
08
0.5 i № 0.2
| \
1.0 - \
350 400
А
450 500 пт 250 30С 350 4QC 450 500 мн
/2 1
( ч-
«н
08 -
I
05 ; 04*
С2 J
250 300 350 -400 450 500 пт 2 50 300 350 400 450 500««
PîICi, 1
лГСС
Ю0
90
S0 -70 50 50 40 ' 30 20 и -I
л
.Î
ео-1
70“ йС-г .
50 4
40
30
201
Ю-J
'.*1L.
< /СОсгг
il*
Рис. 2. Спектры поглощения в ИК внутриклеточного экстракта (---------------------•), клеточной стенкн (.
и дрожжевых клеток (.............) Sacch. carlsbergensis АТСС, В2, Di. Mis, SW
теризуются большей частотой (около 3450 см-1), нежели с водородными связями (3300 см-1). В состав I полосы входят также валентные колебания групп NH пуриновых и пиримидиновых оснований, присутствующих в нуклеиновых кислотах, а также валентные колебания групп ОН. Полосу II (2980— 2920 см-1) составляют растягивающие и
асимметрические колебания групп СН. Полоса III для белков — это примерно 1660 см-1. Если группа NH пептидной связи участвует в водородной связи, то частота полосы повышается. В анализируемых ферментных экстрактах полоса III совпадает с полосой колебаний кратных связей СО, CN п СС, характерных для нуклеиновых кислот. Она составляет 1550—1750 см-1. Четвертая полоса поглощения, находящаяся в пределах 1430— 1440 см“1, соответствует первичным амидам. Пятая полоса с частотой около 1240 см-1 и шестая с частотой около 1080 см-1 характерны для нуклеиновых кислот. Наряду с этим, шестая полоса совпадает с колебаниями группы С—ОН, главным образом, сахаридов. Седьмая полоса, находящаяся в пределах 900—950 см-1, связана с колебаниями группы Р—О—Р. Труднее всего определить восьмую полосу, так как ее составляют колебания многих групп. Тем пе менее, 'к ней можно отнести первичные ампны или же ненасыщенную систему С = С. В анализируемых экстрактах возможно присутствие обеих групп соединений, т. е. аминов и соединений с ненасыщенными системами, например, стеринов.
На основании спектров поглощения в ИК авторы [11] определяли эффективность дезинтеграции дрожжевых клеток. Констатировали, что чем больше степень дезинтеграции клеток, тем слабее выражена на спектрограмме характерная для полисахаридов полоса 1180—1000 см-1. На ИК-спектрограмме экстрактов дрожжей расы SW (рис. 2) эта. полоса едва заметна. Подобным образом выглядят ИК-спектры внутриклеточных экстрактов и экстрактов клеточной стенки АТСС, В2 и Di. В свою очередь, на спектрограммах поглощения в ИК экстрактов Ми, полоса 1180—1000 см-1 намного отчетливее, особенно для экстракта клеточной стенки. Сравнивая ширину полосы 1180—1000 см-1 с данными [11], можно сделать вывод, что количество недезиНтегрированных дрожжевых клеток в экстракте клеточной стенки Mis составляло около 1%. В остальных экстрактах не отметили присутствия недезинте-грированных дрожжевых клеток.
Предварительная характеристика структурных свойств лиофилизированных внутриклеточных экстрактов и экстрактов клеточной стенки не выявила различий между этими двумя структурами. Хроматограммы, полученные в результате разделения на сефа-дексе G-75. были одинаковыми для экстрактов одной и той же расы дрожжей. На основании спектров поглощения в ИК во всех исследуемых экстрактах отметили присутствие групп и связей, характерных для белков,
Таблица 2
Полоса поглощения, см-1 I Вид 1 колебаний Происхождение
Б е л к и
3310—3280 Амид А Пептидная связь
2980—2920 Асимметрические Боковые
колебания — СЕЬ аминокислотные
цепи .
1660 Амид. 1 Пептидная связь
1530 Амид: II »
1450—1400 Амид III Амидные группы
1080—1030 Эфирные группы Фосфоамино-
Р—О—С кпслоты
Н у к л е и н о в ые кислоты
3500—3000 Валентные Пуриновые и
МИ и ОН пиримидиновые
основания,
структурная
вода
1750—1550 Растягивающие
колебания крат-
ных связей СО,
СХ и СС Нуклеотиды
1240 и 1080 Анти- м симмет- Эфирные связи
рические Р02~ нуклеотидов
Полисахариды
3550—2800 Растягивающие,
симметрические
—СН, —СН2 и Группы простых
—ОН сахаров
1400—1250 Деформирующие »
колебания —ОН
1200—1000 Колебания 2
полярной группы
—СО
нуклеиновых кислот и полисахаридов (табл. 2).
ИК-спектры таких сложных систем, как клеточная стенка и внутриклеточная фракция, могут доставить лишь сравнительный материал, отражающий структурные изменения, вызванные химическими и физическими факторами, применяемыми в ходе лабораторного производства. По этой причине не проводили их характеристики с точки зрения количественного спектрального анализа.
Полученные результаты совпадают с данными других авторов [12—15], которые доказали, что в состав клеточной стенки дрожжей входят полисахариды (гликаны, маннаны, хитин), а также белки и липиды. Белок связан с полисахаридными компонентами клеточной стенки сложноэфирными связями между карбоксильными группами белка и гидроксильными группами полисахаридов. Приведенные данные и результаты более ранних наших работ [3, 5] свидетельствуют о том, что при изолировании ферментного белка из экстрактов дрожжей Sacch. carlsbergensis могут возникать трудности.
Выводы
1. Ни один из применяемых методов оценки физико-химических свойств экстрактов ¡арожжей Saccharomyces carlsbergensis. hq выявил существенных различий, между внутри-
fi nocof ;
Я ГГ- I
аХН'-:?
t : :яи-
I :_':i it * Г
г II I' ' .г. I.
1.1-
1 N
п'ч'п
il S
pUkL.I-l, lr;. : I-.-
inn,
([ i KTI ]-
г;-Р'1пто i.. :r . :. .¡:v : -
■- ?.xh -i- _i-: >rii -
ÏWfcÎL^eÎÏ :_l ILU I_]ih :.'k
Lk. -■ IL'? :!4.: ¡I I II :i I.
I. : pdJ[ il I'I. : " I-1 .:J
Ln мп-
ii OL'.- I фДД! 'U I;!; üLa F.IV.pi.
клеточными экстрактами и эксирактами клеточной стенки.
2. Во всех исследованных экстрактах отмечено присутствие групп и связей, характерных для белков, нуклеиновых кислот и полисахаридов.
3. В связи со сложным строением можно ожидать трудностей при изолировании ферментного белка из дрожжей Saccharomyces
carlsbergensis
ЛИТЕРАТУРА
1. Лазуркин С. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот. — М.: Наука, 1967.
2. Twardowski J. Badania bialek meto-dami spektroskopii ramanowskiej i absorp-cvjnej w zakresie podczerwieni /Post. Bio-chem. — 1978. — 24. — 373.
-3. С i с h о s z G., Rymasze w s k i J., Po z-nanski S., G r a b s k a J. über die enzymatische Aktivität von Extrakten aus der Hefe Saccharomyces carlsbergensis in Abhängigkeit von der Zuzamenzetzung des Nährbodens und der Methode der Zellen-Desintegration //Monatsschrift für Brauerei.— 1980. — 3,— 100.
4. С i с h о s z G., R у rn aszewski J.. Po z-nanski S., Kornacki I\. Wplyw wa-runkow hodowli na aktywnosc fermentacyj-na i dekarboksylacyjna ekstraktow enzy-matycznych otrzymywanych z drozdzy Saccharomyces carlsbergensis // Zesz. Nauk. ART Olszt., Techn. Zvwn. — 1982. — 17.— 113.
5. С i с h о s z G., Rymaszewski J., Poznanski S., Grabs ka J. Über die Gärungsaktivität von Extrakten aus Kulturen ausgewählter Rassen der Hefe Saccharomy-
ces carlsbergensis // Monatsschrift für Brauerei. — 1980. — 6. — 221.
6. Cowman R. A., Speck M. L. Proteinase enzyme system of lactic streptococci //Appl. Microbiol. — 1967. — 15. — 851.
7. Sephadex. Gel filtration in theorv and practice. — 1970.
8. Lowry O. H., Rosenbrought N. J., Farr À. L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent //J. Biol. Chem. — 1951. — 193. — 265.
9. L e g g e t B a i 1 e y J. Techniques in protein chemistry. — Amsterdam: Elsevier, 1967.
10. Nowak J. System proteolityczny drozdzy Saccharomyces cerevisiae. Aktualny stan wiedzy oraz badania wlasne //Zesz. Nauk. w Olsztynie. — 1979. — 28. •— 2.
11. R e h a c e k J., B e r a n Iv, B i c i k V. Disin-
tegration of microorganisms and preparation of yeast cell walls in news type of désintégration //App!. Microbiol. 1969. —
17. — 462.
12. I z d e b s k a - S z y m o n a K. Sciana kom6r-kowa drozdzv //Post. Mikrob. — 1968. — 7,—335.
13. Jamroz J. Erzymatyczna hydroliza scian ko-môrek drozdzv // Przem. Spoz. — 1978. —■ —7.—245.
14. Mendoza C. G., Villanczewa J. R. Preparation of cell wells of veast //Can J. Microbiol. — 1963. — 2. — Î 41.
15. Nurminen T., Our a E., Suoma laine n H. The enzymic composition of the isolated cell wall and plasma membrane of baker’s veust //Biochem. J. — 1970,—116.— 61.
Поступила 12.06.90
663.81.002.237.
СОСТАВ И СВОЙСТВА БИОСОРБЕНТА, ПРИМЕНЯЕМОГО ДЛЯ ДЕТОКСИКАЦИИ ПИЩЕВЫХ СРЕД
Н. М. АГЕЕВА, Т. И. ГУГУЧКИНА
Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства
Установлено, что сорбционные, адгезионные и прочие свойства сорбентов различной природы обусловливаются спецификой их химического состава, наличием активных центров на поверхности, пористостью и т. п. [1]. Комплексом этих показателей объясняется реакционная или сорбционная способность сорбента.
В связи с этим представляет интерес исследование химического состава дрожжевого биосорбента, выработанного нами по различным технологиям. Производство биосорбента осуществляли по следующим схемам:
1, Дрожжи ЗасЬагошусеэ \пш отмывали
водой трехкратно, отделяли от жидкой фракции центрифугированием и подвергали термической мацерации;
2. Отмытые водой дрожжи Sach, vini ферментировали препаратами пектпротеоли-тического (пектофоетидин П10Х) и целлюло-литического (целловиридин П10Х) действия, а затем подвергали сублимационной сушке;
3. Биосорбент получали по схеме 1, но в производственных условиях;
4. Препарат, приготовленный по схеме 1, активировали путем поочередной водно-кислотной, водно-спиртовой и водной обработок и сушили;
