CC BY
34
664.8.037.
ПОДВИЖНОСТЬ ВОДЫ В РАСТВОРАХ БИОМАКРОМОЛЕКУЛ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ МЕТОДОМ ПМР
Т. Д. ПИЛИПЕНКО, В. В. МАНК, М. Ю. КОРНИЛОВ, Ю. Л. ЖЕРЕБИН, Т. М. ЛИТВИНА
Одесский технологический институт пищевой промышленности им. М. В. Ломоносова Киевский государственный университет
Исследование методом протонного магнитного резонанса биомакромолекул растительного и животного происхождения, таких как полисахариды, белки, полифенолы, представляет интерес в технологических целях, так как позволяет полнее изучить процессы, происходящие в клетках при различных внешних воздействиях.
Исследования проводили на спектрометрах ядер-ного магнитного резонанса ЯМР для протонов фирмы «Леа1» и «Вгикег».
Образец в стеклянной ампуле помещали между полюсами электромагнита спектрометра. Спектр записывали при постепенном понижении температуры с помощью паров жидкого азота, подаваемых к ампуле с образцом. Перед каждым измерением образец выдерживали до стабилизации температуры во всем его объеме.
Количество невымороженной или подвижной воды рассчитывали методом нормировки по площадям кривых поглощения ПМР, так как известно, что площади сигналов ПМР соответствуют числу резонирующих протонов.
Для изучения молекулярной подвижности в рас' ворах полисахаридов были использованы модельнь системы на основе агар-агара и пектина с доба! ками сахарозы, а также в одном случае яблочно! в другом — лимонной кислот. Состав модельны систем соответствовал содержанию компонентов природных объектах.
Количество воды в образцах модельных раствс ров соответствовало среднему количеству связа} ной воды, определенной по стандартному метол высушивания до постоянной массы.
На рис. 1 представлены спектры ПМР модельны растворов на основе агар-агара, записанные пр разных температурах в одинаковых условиях, спектрах наблюдаются две полосы поглощения. И] тенсивный узкий сигнал соответствует протонам В( ды. Мы предположили, что небольшой сигнал в о< ласти более сильного поля по отношению к сигна/ протонов воды соответствует протонам сахарозы.
Для раствора № 1 этот сигнал имеет химически сдвиг при +30° С — 0,98 м. д., а при +2° С -1,26 м. д. в сторону более сильного поля относител! но сигнала свободной воды. При положительнс температуре протоны гидроксильных групп сахароз и яблочной кислоты представляют собой сигнал с разной степенью наложения друг на друга. Сигна, соответствующий протонам гидроксильных груг яблочной кислоты, находится в еще более сильно поле. Его химический сдвиг для раствора № 2 соста] ляет 0,53 и 0,98 м. д. относительно сигнала воды.
" При понижении температуры химические СДВИ1 сигналов от протонов воды, сахаров и яблочнс кислоты смещаются в слабое поле, но с разной сю ростью, причем сигнал от протонов воды смещ; ется с большей скоростью благодаря наличию в во/ большого числа относительно слабосвязанных гидр| ксильных групп. В результате расстояние межд пиками увеличивается. При температуре ни* —10° С молекулярное движение уменьшается н; столько, что сигналы уширяются и сливаются в оди широкий сигнал. При этом линия поглощения уцп ряется на несколько порядков и становится I наблюдаемой в спектрах ЯМР высокого разрешени:
Содержание невымороженной, или подвижнс при данной температуре воды рассчитывали к обще массе воды в образце, и по этим данным были ш строены температурные зависимости (рис. 2 а, б, в
В образцах № 1 и 3 при понижении температур до —4° С происходит вымерзание 85% всей влап При дальнейшем понижении температуры от —8 д —12° С количество подвижной воды возрастает, затем снова падает.
В образце № 2 содержание подвижной воды н; чинает возрастать при понижении температуры р 0° С, затем 30% воды вымерзает при понижени температуры до —2° С.
Все три образца имеют Б-образную форму криво; характерную для растворов с полимолекулярны
юем, аналогично полученной Лингом для сорбции эдяных паров на коллагене [1].
Немонотонный характер вымерзания влаги в кол-оидной системе агара дает возможность предпо-ожить также многослойную адсорбцию воды на акромолекулах полисахаридов. При понижении гмпературы ниже —2...—4° С происходит пере-риентация различным образом ориентированных поев воды на поверхности коллоидных частиц агара. Этот процесс аналогичен фазовым переходам эды из жидкого состояния в твердое и обратно, [редлагаемый нами согласно экспериментальным анным механизм вымерзания влаги в модельной ястеме агар — вода — сахароза соответствует сов-еменным представлениям многих авторов [2, 3], читающих, что на поверхности биомакромолекул уществует несколько поляризационно-ориентиро-анных слоев воды. Ранее проведенными исследо-аниями установлено, что содержание моно- и диса-аридов в плодах влияет на характер вымерзания лаги в них [4, 5].
Логично предположить, что содержание пекти-овых веществ также оказывает влияние на про-есс вымерзания воды в тканях растений.
Для изучения такого влияния была выбрана мо-ельная система пектин — сахароза — лимонная ислота в соотношениях, близких к натуральным
продуктам. Методика приготовления студней и обоснование выбора компонентов и их концентраций описаны в работе [6].
Температурная зависимость количества невыморо-женной воды в образцах пектиновых студней оказалась аналогичной такой же зависимости для студней из агара (рис. 3 а, б, в), что подтверждает общий характер предлагаемого механизма вымерзания влаги в коллоидных системах на основе полисахаридов.
В образцах № 2 и 3 с более высоким содержанием сухих веществ при понижении температуры от +20 до +4° С происходит увеличение подвижности молекул воды. В этих образцах, начиная с +7 до +4° С, а в образце № 1 — начиная с +10° С резко падает подвижность молекул воды. В интервале температур от 0 до —1° С (№ 2 и 3) и от 0 до —3° С (№ 1) происходит вымораживание основной части влаги студня. Вслед за этим в образцах № 2 до —6° С, а № 3 до —8° С вымораживается наиболее подвижная часть адсорбированной ца макромолекулах влаги.
Для образца № 1, содержащего наименьший процент сухой массы, этот участок на кривой отсутствует. При дальнейшем понижении температуры ниже —3° С проявляется резкое увеличение, а затем уменьшение подвижности молекул слабо и прочносвязанной воды, выражающееся на кривых температурных зависимостей появлением седлообразных участков. То же наблюдается для образца № 2 ниже —6° С (рис. 3 б, в).
Рис. 3
Заказ 0266
Таким образом, чем выше концентрация пектина и сахарозы, тем при более низкой температуре начинается вымерзание связанной влаги.
Характер вымерзания влаги в образце № 3, имеющем наибольшее содержание сухих веществ, несколько отличается от двух других. До —8° С здесь происходит (рис. 3 в) вымерзание свободной влаги образца, а ниже —8° С подвижность воды резко возрастает. Интересно также отметить, что фазовые изменения в модельных образцах с пектином № 2 и 3 начинаются еще в области положительных температур. При дальнейшем понижении температуры после вымерзания основной,части влаги происходит значительное увеличение подвижности воды. Это говорит о том, что вся вода в образце находится в связанном и ориентированном состоянии.
Учитывая немонотонный характер вымерзания влаги для всех образцов пектиновых студней, можно сделать вывод, что поведение невымерзшей воды в процессе понижения температуры, так же как в студнях агара, определяется наличием полимолеку-лярных слоев воды, адсорбированных вокруг агрегатов из макромолекул пектина. Эти слои поляризованы и ориентированы в пространстве. В процессе изменения температуры и стабилизации ее во всем объеме образца и под действием магнитного поля электромагнитов спектрометра происходит переориентация различным образом ориентированных слоев воды на поверхности коллоидных частиц агара и пектина, представляющих собой мицеллы, из которых состоит сетка пектинового и агарового студней.
Многослойность адсорбированных поляризованных слоев воды может определяться также спиральным строением молекул полисахаридов и наоборот — за счет этих слоев может осуществляться конформационная устойчивость макромолекул полисахаридов. Эти представления согласуются с представлением о строении объемной воды [7, 8].
Во многом аналогичным поведением характеризуется вода, адсорбированная на молекулах белка, ДНК и поверхности биологических мембран [3, 8, 9, 10]. По-видимому, общим во всех случаях является образование коллоидной системы из мицелл биомакромолекул.
Известно, что при понижении температуры и увеличении концентрации способность к мицеллооб-разованию увеличивается. Маловероятно, чтобы мицелла разрушалась (вымерзала) сразу. Более вероятно, что процессы как разрушения, так и образования мицелл, учитывая их слоистое строение, идут в несколько стадий, в течение достаточно длительного времени.
Коллаген, или желатин — один из наиболее доступных для изучения белков животного происхождения. Способность желатина к набуханию обусловлена гидратацией функциональных групп и пептидных связей белка за счет образования водородных связей.
Спектры ПМР образцов нативного коллагена записывали по методике, аналогичной для агара и пектина (рис. 4).
Температурная зависимость количества подвижной воды для набухшего нативного коллагена является немонотонной. В процессе снижения температуры происходит изменение подвижности молекул воды, аналогичное изменению подвижности в агаровых и пектиновых студнях. Отличие состоит в том, что здесь не наблюдается увеличения подвижности в области положительных температур от -+-20 до +6° С. В интервале температур от +6 до —15° С постепенно вымерзает основная масса влаги образца (свыше 80%).
Седлообразные участки расположены равномер! на кривой температурной зависимости подвижнс воды, что говорит о регулярном строении студ! из желатина и отсутствии свободной воды в не Практически вся вода оказывается связанной и пр являет при понижении температуры анизотропнь свойства.
Таким образом, из вышеприведенных даннь можно сделать вывод, что увеличение содержаш белков и полисахаридов в живых тканях способе вует понижению температуры вымерзания вод] а следовательно, сопротивляемости тканей возде ствию отрицательных температур.
Одним из компонентов, входящих в состав к; растительных, так и животных тканей, являютс меланиновые пигменты. Однако они значителы менее изучены, чем белки и полисахариды.
Макромолекулы меланиновых пигментов ассоци; рованы за счет ван-дер-ваальсовых сил, водоро, ных и донорно-акцепторных связей. Их считан сополимерами хинона, гидрохинона и семихинон Представления о сополимерной природе пигмет и участии функциональных групп в образовани ассоциатов доказаны рентгеноструктурными иссл дованиями[11].
Спектры ПМР воды в растворе меланина пол чили в процессе понижения температуры в инте вале +20...—48° С (рис. 5). Температурная зав симость подвижной воды показывает, что при пон жении температуры до 0° С вымерзает основн. часть воды образца. Вертикальные участки крив! замораживания имеют наклон к вертикали, что св детельствует об отсутствии одновременно кристалл зации воды во всем объеме образца.
Ниже 0° С в растворе образуется мицеллярн; коллоидная система. Гидратная оболочка мицел образованных ассоциатами меланинов, вымерза постепенно, слоями.
Верхний слой (или слабосвязанная влага) В1
ерзает до —8° С, следующий слой, или более проч-освязанная влага, вымерзает в интервале от —8 о —38° С. При этой температуре образуется лио-ропная мезофаза; вода, входящая в эту фазу, роявляет анизотропные свойства, однако они выра-сены гораздо слабее, чем в студнях полипептидов полисахаридов, возможно, за счет более прочных вязей с функциональными группами макромолекул еланина. В этом интервале температур образуйся более крупные агрегаты из ассоциатов мела-ина, общая поверхность дисперсных частиц умень-]ается, слой воды вокруг них утолщается, однако этих условиях молекулы воды теряют ориента-ионные свойства за счет разупорядочивания внутри лоя. Кроме процессов агрегации при понижении емпературы могут частично проходить процессы изкотемпературной полимеризации. Происходит ближение молекул и их частей между собой, при том возникают различные внутри- и межмолеку-ярные взаимодействия.
Известно, что замороженные растворы неоднород-ы в структурном и фазовом отношении. Они пред-гавляют собой сложную двухфазную систему, □стоящую из твердой матрицы с находящимися ней микровключениями, в которых сохраняется ысокая молекулярная подвижность до затверде-ания всей системы в целом [12].
Растворенные вещества практически полностью онцентрируются в микровключениях, а матрица редставляет собой твердый растворитель. Суммар-ый объем воды, входящей в состав микровключе-ий, в нашем случае довольно значительный —28,8%. 1вторами [12], использующими метод парамагнит-ого зонда, была обнаружена методом ЭПР ано-[ально высокая подвижность азотно-кислого ради-ала-метки в замороженных растворах вода — иоксан и вода — нафталин. Возможно, в нашем лучае высокая подвижность воды, адсорбирован-ой на поверхности ассоциатов и агрегатов мела-ина, обусловлена вращательной подвижностью >ункциональных групп и обладающих парамагнит-ыми свойствами радикалов его молекул.
Поскольку метод ЭПР не позволяет получить ин-юрмацию о количественном содержании компонен-
тов жидкой микрофазы, мы использовали метод ПМР, который дает более полную информацию о фазовом состоянии замороженных растворов и состоянии молекулярной подвижности в микрофазах.
По нашим представлениям, ниже —38° С в жидкой микрофазе образуются молекулярные (гидрат-ные) комплексы, образующие гель-систему, не вымерзшую ниже —45° С.
Таким образом, в процессе замораживания на спектрометре в магнитном поле при 0° С вымерзает около 70% всей воды, затем вымерзает около 3% слабосвязанной и 17% прочносвязанной воды; ниже —38° С остается невымороженной 13,4% влаги, которая может представлять собой, как уже выше сказано, гидратно связанную влагу.
Из приведенных данных можно сделать вывод, что при замораживании растворов полисахаридов, полипептидов и полифенольных соединений обнаружены общие закономерности поведения воды и состояния дисперсности системы. Метод исследования в динамических условиях с помощью спектров ПМР дает возможность определить количество свободной, слабосвязанной, прочносвязанной и гидрат-ной или особопрочносвязанной воды.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ling G. N. A. Physical Theory of the Living State, Ginn (Blaisdell), Boston (Mass.), 1962.
2. H a r v e y J. M., S у m a n s M. C. R., Nafta-I i n R. J. Proton magnetic resonance study of the hydration of glucose.//Nature.—1976.—261, № 5559.— P. 435—436.
3. Magnetic Resonance in Colloid and Interface./Ablett S., Lil 1 ford P. I., Baghadi S., Derbishire W.//Science, A. C. S. Symposium series 34.—1976.—29.— P. 344.
4. Кротов E. Г., Загибалова Т. Д. Влияние отрицательных температур на содержание растворимых углеводов в перце, моркови и баклажанах//Хо-лод. обработки и хранение пищевых продуктов.— Л., 1978,—С. 8—И.
5. Загибалова Т. Д. Изменение содержания растворимых углеводов при холодильном консервировании яблок и слив//Биохим. и биофиз. исследования пищевых прод. при холод, консервировании.— Л., 1981.— С. 13—19.
6. Гапоненко Т. К., Проценко 3. И. Определение пектиновых веществ в яблоках//Консерв. и овоще-суш. пром-сть— 1963,—№ 1,— С. 29—30.
7. С а м о й л о в О. Я. Структура водных растворов электролитов и гидратация ионов.— М.: Изд-во АН СССР, 1957,—151 с.
8. Scheraga-H. A. Effect of Hydrophobic Bonding on Protein reactions.//J. Phys. Chem.—1961.—65.— P. 1071 — 1072.
9. Есипова H. Г., Чиргадзе Ю. H. О роли воды в структуре фибриллярных белков и полипептидов/Со-стояние и роль воды в биологических объектах.— М.: Наука, 1967,—С. 60—71.
10. Браейнт Р. Ширли У. Взаимодействие воды с белками/Вода в полимерах/Под ред. С. Роуленда.— М.: Мир, 1984,—С. 149—159.
II- Thathac'hari Y. Т. Physical Studies on Mela-nins.//J. Sei, Ind. Res.—1971,—30, № 10,—P. 529—537 12. Сергеев Г. Б., Батюк В. А. К р и о х и м и я.— М.: Химия, 1978.—295 с.
Кафедра аналитической химии Лаборатория физики и химии воды
Лаборатория ЯМР Поступила 30.06.89
