CC BY
38
© Коллектив авторов, 2023
Фролова Л.В.1, Земский П.Ю.1, Митрофанов С.И.1, Мухин В.Е.1, Шпакова Т.А.1, Казакова П.Г.1, Ахмерова Ю.Н.1, Буланова Н.В.1, Голубникова Л.А.1, Грамматикати К.С.1, Жданова А.С.1, Мкртчян А.А.1, Сергеев А.П.1, Снигирь Е.А.1, Фелиз Н.В.1, Макаров В.В.1, Юдин В.С.1, Кескинов А.А.1, Краевой С.А.1, Юдин С.М.1, Скворцова В.И.2
Методика оценки уровня IgG-антител к различным белкам SARS-CoV-2 с помощью мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» Федерального медико-биологического агентства, 119121, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное медико-биологическое агентство, 123182, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Определение серологического статуса пациентов в отношении SARS-CoV-2 необходимо для оценки клинического течения COVID-19 и эпидемиологической обстановки в целом, а также для выработки стратегии ревакцинации населения. Хотя существует большое количество тест-систем для определения антител к SARS-CoV-2, их точность, чувствительность и специфичность сильно варьируют. Тест-системы различаются в зависимости от используемой платформы и набора антигенов, что затрудняет интерпретацию и сопоставление результатов.
Цель - определить диагностические характеристики тест-системы MILLIPLEX® SARS-CoV-2 Antigen Panel 1 IgG для мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа (МИФА) уровня антител к SARS-CoV-2 на приборе FlexMap 3D (Luminex, США) в биообразцах сыворотки крови людей, как перенесших COVID-19, так и вакцинированных против COVID-19.
Материал и методы. В исследование включены 3 группы участников: лица с COVID-19 в анамнезе; лица, не имевшие COVID-19 в анамнезе и невакцинирован-ные; вакцинированные лица. Для всех биообразцов выполнено определение уровня IgG-антител к SARS-CoV-2 с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), МИФА, а также определение уровня вирус-нейтрализующих антител.
Результаты. В рамках исследования определено пороговое значение для подтверждения наличия IgG-антител к S1-субъединице S-белка (белка шипа) SARS-CoV-2 методом МИФА - 3267 MFI, а также оценены чувствительность и специфичность данного метода, которые равны 0,78 и 0,92 соответственно. Разработана линейная регрессионная модель для пересчета значений MFI в BAU/мл. Определен серопротективный уровень антител к S1-субъединице S-белка SARS-CoV-2 - 5192 MFI.
Заключение. Определение уровня IgG-антител с помощью МИФА обладает высокой диагностической чувствительностью и специфичностью. Данный метод позволяет оценивать серопротективность по уровню антител к S1-субъединице S-белка SARS-CoV-2. Кроме того, полученные результаты могут быть сопоставлены с международными единицами измерения BAU/мл по формуле:
m - 492,770 + 31,320 х b ^ b = - 15,733 + 0,032 х щ,
где b - величина в BAU/мл, m - величина в MFI.
Ключевые слова: мультиплексный иммунофлуоресцентный анализ; иммуноферментный анализ; SARS-CoV-2; COVID-19; гуморальный иммунитет; IgG
Статья получена 08.11.22. Принята в печать 16.01.2023.
Для цитирования: Фролова Л.В., Земский П.Ю., Митрофанов С.И., Мухин В.Е., Шпакова Т.А., Казакова П.Г., Ахмерова Ю.Н., Буланова Н.В., Голубникова Л.А., Грамматикати К.С., Жданова А.С., Мкртчян
Для корреспонденции
Фролова Лидия Владимировна -аналитик отдела медицинской геномики ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: LFrolova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-6823-9032
А. А., Сергеев А.П., Снигирь Е.А., Фелиз Н.В., Макаров В.В., Юдин В.С., Кескинов А.А., Краевой С. А., Юдин С.М., Скворцова В.И. Методика оценки уровня IgG-антител к различным белкам SARS-CoV-2 с помощью мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа. Иммунология. 2023; 44 (1): 109-119. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2023-44-1-109-119
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Все авторы внесли равнозначный вклад в исследование и подготовку статьи к публикации.
Frolova L.V.1, Zemsky P.U.1, Mitrofanov S.I.1, Mukhin V.E.1, Shpakova T.A.1, Kazakova P.G.1, Akhmerova Yu.N.1, Bulanova N.V.1, Golubnikova L.A.1, Grammatikati K.S.1, Zhdanova A.S.1, Mkrtchian A.A.1, Sergeev A.P.1, Snigir E.A.1, Feliz N.V.1, Makarov V.V.1, Yudin V.S.1, Keskinov A.A.1, Kraevoy S.A.1, Yudin S.M.1, Skvortsova V.I.2
Methodology for evaluation of the level of IgG antibodies against different SARS-CoV-2 proteins using multiplex immunofluorescence analysis
1 Centre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks of the Federal Medical Biological Agency, 119121, Moscow, Russian Federation
2 Federal Medical Biological Agency, 123182, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. The definition of patients' serological status for SARS-CoV-2 is required for a clinical COVID-19 history evaluation and evaluation of epidemiological situation in general and also for development of population revaccination strategy. Though there are many different test systems for SARS-CoV-2 antibodies identifying, their sensitivity and specificity vary greatly. Test systems differ depending on used platform and antigen kit which make difficulties in the interpretation and comparison of results.
Aim - define diagnostic characteristics of MILLIPLEX® SARS-CoV-2 Antigen Panel 1 IgG test system for multiplex immunofluorescence assay of SARS-CoV-2 antibodies level on FlexMap 3D device (Luminex, USA) in blood serum samples of persons who have recovered from COVID-19 and those who were vaccinated against COVID-19.
Material and methods. The study includes 3 groups of participants: persons with history of COVID-19; persons without history of COVID-19 and unvaccinated; vaccinated ones. Identifying of the level of IgG antibodies against SARS-CoV-2 and virus neutralizing antibodies level was made for all samples using ELISA and multiplex immunofluorescence assay.
Results. In the course of this study a threshold value of IgG antibodies to SARS-CoV-2 S1 subunit of S protein (spike) was determined using multiplex immunofluorescence assay and it was 3267 MFI, also the sensitivity and accuracy of this method were assessed, which are 0.78 and 0.92 respectively. A linear regression model was developed for converting MFI values to BAU/ml values. Seroprotective level of antibodies to S1 subunit of SARS-CoV-2 S protein was determined and it was 5192 MFI.
Conclusion. Identifying of IgG antibodies using multiplex immunofluorescence assay has a high diagnostic sensitivity and specificity. This method allows to evaluate seroprotectiveness by level of antibodies to S1 subunit of SARS-CoV-2 S protein. Besides that, results could be compared to international units BAU/ml using formula:
For correspondence
Lidiya V. Frolova -Analyst of Medical Genetics Dept., CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: LFrolova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-6823-9032
m - 492.770 + 31.320 x b ^ b = - 15.733 + 0.032 x m, where b is a BAU/ml value, m is an MFI value.
Keywords: multiplex immunofluorescence assay; SARS-CoV-2; COVID-19; humoral immunity; IgG
Received 08.11.22. Accepted 16.01.2023.
For citation: Frolova L.V., Zemsky P.U., Mitrofanov S.I., Mukhin V.E., Shpakova T.A., Kazakova P.G., Akhme-rova Yu.N., Bulanova N.V., Golubnikova L.A., Grammatikati K.S., Zhdanova A.S., Mkrtchian A.A., Sergeev A.P.,
Snigir E.A., Feliz N.V., Makarov V.V., Yudin V.S., Keskinov A.A., Kraevoy S.A., Yudin S.M., Skvortsova V.I. Methodology for evaluation of the level of IgG antibodies against different SARS-CoV-2 proteins using multiplex immunofluorescence analysis. Immunologiya. 2023; 44 (1): 109-19. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-1-109-119 (in Russian)
Funding. The study had no sponsor support.
Conflict of interests. Authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Authors contributed equally.
Введение
Коронавирусы представляют собой разнообразную группу РНК-содержащих вирусов, инфицирующих различных животных, а также вызывающих респираторные инфекции разной степени тяжести у людей [1]. В 2002 и 2012 гг. два высокопатогенных представителя семейства Сотопаутйав зоонозного происхождения - 8ЛЯ8-СоУ и МЕЯ8-СоУ - вызвали вспышки респираторных заболеваний с зафиксированными летальными исходами. В конце 2019 г. новый высококонтагиозный коронави-рус 8ЛЯ8-СоУ-2 вызвал вспышку вирусной пневмонии, которая быстро распространилась по всему миру и превзошла атипичную пневмонию и МЕК8-синдром как по количеству инфицированных людей, так и по пространственному охвату зон со сложной санитарно-эпидемиологической ситуацией [2, 3]. В феврале 2020 г. ВОЗ дала болезни, вызываемой 8ЛЯ8-СоУ-2, название СОУГО-19, а 11 марта 2020 г. объявила о пандемии заболевания [4].
Основными структурными компонентами 8ЛЯ8-СоУ-2 являются белок шипа (8), белок оболочки (Е), мембранный белок (М) и нуклеокапсидный белок (Ы). В структуре 8-белка можно выделить 81-субъединицу (14-685 аминокислотных остатков) и 82-субъединицу (686-1273 аминокислотных остатков) [3]. 81-субъе-диница 8-белка содержит рецептор-связывающий домен (КВБ), который взаимодействует с ангиотензин-превращающим ферментом (ЛСЕ2), экспрессирован-ным на клетках разных тканей [3, 5, 6].
8ЛЯ8-СоУ-2 стимулирует гуморальный и клеточный иммунный ответ в организме инфицированного человека. Гуморальный иммунный ответ характеризуется выработкой 1^Л-, ]^М- и ^в-антител, которые способны специфически распознавать и связывать чужеродные белки. ]^М-антитела против Ы-белка вируса выявляются у пациентов уже на 7-е сутки заболевания, ^в-антитела - после 7-х суток. Ы-белок обладает высокими иммуногенными свойствами и является высоко-экспрессируемым во время инфекции [3, 6, 7]. Антитела к 8-белку, который является основной мишенью вакци-нопрофилактики, в частности для «Гам-КОВИД-Вак» -первой в мире официально зарегистрированной вакцины против СОУШ-19, обладают наибольшей нейтрализующей активностью [3, 8-13]. Антитела, которые связывается с поверхностными эпитопами вирусных частиц, блокируя проникновение вируса в клетки хозяина, определяются как вирус-нейтрализующие. Уровни нейтрализующих антител у выздоравливающих пациентов могут быть выше, чем после вакцинации [13-15].
Пандемия COVID-19 потребовала быстрого увеличения масштабов диагностики in vitro, чтобы обеспечить массовый скрининг и тестирование групп высокого риска, а также получение надежных данных о воздействии SARS-CoV-2 на индивидуальном и попу-ляционном уровне. Вероятность заболевания человека при прочих равных условиях зависит от титра антител: чем выше титр антител, тем меньше вероятность заболевания [16-18]. Для оценки гуморального иммунитета к SARS-CoV-2 необходимо применение диагностических тест-систем для выявления IgA-, IgM-, IgG-антител к данному вирусу. Как правило, в основе этих тест-систем лежат методы иммуноферментного анализа (ИФА) и иммунохроматографии либо их аналоги. Существующие серологические тесты, используемые для диагностики COVID-19 и оценки иммунного ответа, позволяют выявить IgG-антитела к белкам SARS-Cov-2, образующиеся в определяемых количествах примерно через 2 нед после появления первых симптомов заболевания [3, 9, 18-21]. Для определения уровня IgG-антител к различным субъединицам S-белка и N-белку SARS-CoV-2 мы использовали технологию xMAP. Метод мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа (МИФА) с высокой пропускной способностью предназначен для быстрого, чувствительного и специфичного определения большого количества аналитов в одном биологическом образце [22].
В настоящее время в России зарегистрировано более 130 тест-систем различных производителей для выявления антигена и антител к коронавирусу. Диагностические тест-системы имеют разные показатели чувствительности и специфичности, уровни воспроизводимости между постановками и ограничения по минимальному и максимальному показателю уровня антител [3, 17].
Использование различных тест-систем с нестандар-тизованными единицами измерения усложняет процесс интерпретации и отслеживания динамики напряженности гуморального иммунитета. В декабре 2020 г. ВОЗ утвердила международный стандарт и международную единицу измерения уровня антител к SARS-CoV-2 -BAU/мл (binding antibody units - единицы связывающих антител; NIBSC code: 20/136). На данный момент не существует методики сравнения уровня антител, полученных с помощью разных тест-систем, поэтому в рамках данного исследования мы поставили перед собой задачу построить шкалу перевода данных, полученных при использовании технологии xMAP, в международные единицы измерения BAU/мл.
Материал и методы
Обследуемые группы. Данное наблюдательное исследование проведено в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием человека в качестве субъекта» от 1964 г. с последующими изменениями и дополнениями. До начала исследования 28.12.2020 было получено письменное одобрение локального этического комитета ФГБУ «ЦСП» ФМБА России на проведение исследования. Обязательным условием включения в исследование и сбора биоматериала являлось подписание добровольного информированного согласия. У участников без COVID-19 в анамнезе отсутствовали IgG- или IgM-антитела к SARS-CoV-2 на момент включения в исследование. У участников с COVID-19 в анамнезе было зафиксировано начало COVID-19 в течение предыдущих 7 дней, подтвержденное лабораторными методами (ПЦР-тест на РНК SARS-CoV-2 и/или качественный/количественный анализ IgG- или IgM-антител к SARS-CoV-2), а также был положительный ПЦР-тест на РНК SARS-CoV-2 в течение последних 7 дней до исследования. В группе вакцинированных от COVID-19 для вакцинации применялся препарат «Гам-КОВИД-Вак» не позднее чем за полгода до начала исследования. Основными критериями невключения в исследование являлись: любые острые заболевания, если с момента полного выздоровления до скрининга не прошло 4 нед; хронические заболевания в стадии обострения и стадии декомпенсации; алкоголизм, наркомания, токсикомания в анамнезе; наличие онкологического заболевания в течение 3 лет до включения в исследование; химиотерапия или радиотерапия в предшествующие 3 года; иммунодефицитное состояние; наличие в анамнезе системных воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний; ВИЧ инфекция, гепатиты В и С, сифилис; беременность и период кормления грудью.
Для исследования были сформированы 3 выборки биообразцов:
• для определения порога MFI (median fluorescence intensity - медианное значение интенсивности флуоресценции), свидетельствующего о наличии антител (399 биообразцов: 93 от участников с COVID-19 в анамнезе и 306 от участников без COVID-19 в анамнезе; средний возраст участников - 50 ± 9 лет, соотношение биообразцов от женщин/мужчин: 196/203);
• для перевода единиц измерения MFI в международную величину BAU/мл (88 биообразцов: 25 от участников, перенесших COVID-19; 35 от участников, вакцинированных от COVID-19; 28 от участников, которые не болели и не вакцинировались; средний возраст участников 45 ± 11 лет, соотношение биообразцов от женщин/мужчин: 49/39);
• для определения серопротективного уровня антител (120 биообразцов: 48 от участников, вакцинированные от COVID-19; 9 от участников
с COVID-19 в анамнезе; 63 от участников, которые не болели и не вакцинировались; средний возраст участников 47 ± 10 лет, соотношение биообразцов от женщин/мужчин: 54/69).
Сбор биоматериала и метаданных. Метаданные, полученные от каждого участника исследования, содержали пол, возраст, регион проживания и другие характеристики. Забор биоматериала осуществлялся в соответствии с ГОСТ Р53079.4-2008.
Все биообразцы, попавшие в финальную выборку исследования, прошли проверку на отсутствие признаков гемолиза и хилеза. Транспортировка биообразцов осуществлялась при постоянном контроле температурного режима. Биообразцы подвергались заморозке не более одного раза. Всего собрано и обработано 583 биообразца сыворотки крови от 471 участника исследования.
Мультиплексный иммунофлуоресцентный анализ. Для анализа биообразцов сыворотки применялся мультиплексный анализатор FlexMap 3D Luminex с использованием набора реагентов MILLIPLEX SARS-CoV-2 Antigen Panel 1 IgG (Merck Millipore, Германия). Для выполнения МИФА уровня антител сыворотку разводили в соотношении 1 : 100 буфером для разведения образцов Assay Buffer, затем в каждую лунку 96-лу-ночного планшета к исследуемым образцам добавляли буфер для разведения образцов Assay Buffer, а также полистироловые сферы с иммобилизованными на их поверхности специфическими вирусными антигенами S1, S2, RBD, N. Планшет с полученной смесью заклеивали пленкой и инкубировали при непрерывном перемешивании на шейкере с интенсивностью перемешивания 800 об/мин в течение 2 ч при комнатной температуре (20-25 °C). Затем планшет трижды отмывали промывочным буфером на магнитном штативе и инкубировали с конъюгатом PE-anti-Human IgG Conjugate (Merck Millipore, Германия) при комнатной температуре. После 90 мин инкубации планшет повторно отмывали промывочным буфером с использованием магнитного штатива и добавляли проточную жидкость Sheath Fluid, после чего ресуспендировали 10 мин на шейкере при комнатной температуре и загружали для детекции в мультиплексный анализатор FlexMap 3D (Luminex, США) с программным обеспечением xPONENT (Luminex, США). В процессе детекции идентифицировалась каждая отдельная микросфера и оценивался количественный результат флуоресцентных сигналов. Полученные данные об MFI в формате csv-файла обрабатывали с использованием программного обеспечения MILLIPLEX® Analyst 5.1 (Merck Millipore, Германия).
Количественный ИФА выполняли с применением набора SARS-CoV-2-IgG количественный ИФА-БЕСТ («Вектор-Бест», Россия; кат. № D-5505). Исследуемые образцы сыворотки разбавляли в 10 раз раствором для предварительного разведения сывороток, после чего в лунки планшета вносили по 10 мкл полученных разбавленных сывороток и по 90 мкл раствора для разведения сывороток и тщательно перемешивали. Во время каждой постановки в пустые лунки планшета вно-
сили по 100 мкл калибровочных образцов (0, 10, 125, 500 BAU/мл), положительного и отрицательного контроля. Затем заклеивали планшет пленкой и инкубировали в течение 30 мин в термостатируемом шейкере при температуре 37 °С с интенсивностью перемешивания 700 об/мин.
По окончании инкубации планшет промывали 5 раз промывочным раствором, вносили по 100 мкл конъю-гата и инкубировали в течение 30 мин в термостатируемом шейкере при температуре 37 °С с интенсивностью перемешивания 700 об/мин. По окончании второй инкубации планшет промывали 5 раз промывочным раствором, вносили по 100 мкл субстрата и инкубировали в защищенном от прямых солнечных лучей месте в течение 25 мин при комнатной температуре. Затем вносили во все лунки планшета по 100 мкл стоп-реагента и измеряли оптическую плотность в двухволновом режиме спектрофотометра Infinite 200 PRO (Tecan, Швейцария); основная длина волны - 405 нм, длина волны сравнения - 620 нм. Значения оптической плотности образцов переводили в BAU/мл по калибровочной кривой, иллюстрирующей зависимость значений оптической плотности от концентрации IgG в калибровочных образцах.
Определение уровня вирус-нейтрализующих антител. Оценку уровня вирус-нейтрализующих антител выполняли с помощью суррогатного нейтрализацион-ного теста SARS-CoV-2 Surrogate Virus Neutralization Test (sVNT) Kit (Proteogenix, Франция). Данный тест основан на конкурентном связывании нейтрализующих антител и человеческого рекомбинантного ангиотензин-связывающего фермента 2, конъюгированного с перок-сидазой хрена (hACE2-HRP), с RBD-доменом S-белка SARS-CoV-2. В качестве положительного контроля использовали раствор моноклональных антител S309 и CR3022, для которых ранее была показана высокая нейтрализующая способность в отношении SARS-CoV-2. В качестве отрицательного контроля использовали раствор поликлональных антител к S2-субъединице S-белка вируса SARS-CoV-2.
Биообразцы сывороток, а также положительные и отрицательные контроли вносили в 96-луночный планшет с иммобилизованным RBD-доменом S-белка SARS-CoV-2 и инкубировали в течение 60 мин при 37 °С. Затем планшет трижды отмывали промывочным буфером и вносили субстрат. После 10 мин инкубации реакцию останавливали внесением стоп-реагента и определяли абсорбцию при 450 нм.
Нейтрализующую способность рассчитывали по формуле:
0,9-
% нейтрализации =
1 - ОП образца ОП отриц. контроль
X 100%, (1)
где ОП - оптическая плотность при 450 нм.
Биообразцы с уровнем нейтрализации < 20 % расценивали как ненейтрализирующие.
Анализ и визуализация данных. Расчеты, построение графиков и диаграмм осуществлялось с помощью
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
-------
_______
0-88
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Специфичность
0,8 0,9 1
Рис. 1. ЯОС-кривая, построенная на основе значений МП для Б1-субъединицы Б-белка 8ЛК8-СоУ-2, у двух групп (с СОУГО-19 в анамнезе и без СОУ1Б-19 в анамнезе) По оси абсцисс отложена разность единицы и значений специфичности, по оси ординат - значения чувствительности. Площадь под КОС-кривой составила 0,88.
языка R в среде разработки RStudio с использованием библиотеки pROC (SIB, Швейцария) [23], а также программы GraphPad Prism 9.3.1 (GraphPad Software Inc, США).
Результаты
Определение пороговых значений MFI на приборе FlexMap 3D
Для определения оптимального порога значений MFI для S1-субъединицы S-белка вируса SARS-CoV-2, свидетельствующего о достоверном наличии антител, проанализирована выборка из 399 биообразцов: 93 биообразца от участников с COVID-19 в анамнезе и 306 биообразцов от участников без COVID-19 в анамнезе (средний возраст участников - 50 ± 9 лет, соотношение биообразцов от женщин/мужчин: 196/203).
Для значений MFI от 0 до 39 404 (максимальное значение, полученное для данной выборки) были рассчитаны чувствительность и специфичность. На ROC-кривой на рис. 1 показатель AUC (Area Under Curve, площадь под ROC-кривой) составляет 0,88, что говорит о возможности использования этой модели, основанной на количественном определении уровня IgG-антител к S1-субъединице S-белка SARS-CoV-2 на приборе FlexMap, для качественного определения серопозитив-ности к SARS-CoV-2.
Для определения порога, позволяющего достоверно различить участников с COVID-19 в анамнезе и невак-цинированных участников без COVID-19 в анамнезе при достижении оптимума чувствительности и специфичности для каждого значения была рассчитана Fj-мера по следующей формуле:
„ _TP
F = -
1 TP + 1/2(FP + FN)
(2)
где ТР - истинно положительные результаты, ЕР - лож-ноположительные результаты; ЕЫ - ложноотрицатель-ные результаты. ТР - истинно положительные образцы
0
82
1000 -
800 -
600 -
-
и
| 400
8
200 -
0 -
г = 0,95
^-уа1ие = 4,82е-45
1000 -
800 -
• У
600 -
Л.
-
г §
и
| 400
¡33
• /•
200 -
0 -
г = 0,64 ^-уа1ие = 2,77е-11 • • * |
• в ✓ У
• и
•.
* • • • • • • •
00 0 0 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0
00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00
5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0
2 МБ! 2 т т 4 2 МБ! 2 т т 4
81
1000
800
600
400
200
г = 0,96 />-уа1ие = 1,71е-50 • ✓ У У ' ■
• • •. .-у у'
\ у" • .. .
V' У-
✓ • .
МБ!
0
Рис. 2. Диаграммы распределения количественных показателей уровня ¡яО-антител к вирусу 8ЛК8-СоУ-2 методами МИФА и ИФА
от пациентов с СОУГО-19, в анамнезе определенные как положительные по наличию антител, а также образцы от пациентов без СОУГО-19 в анамнезе, определенные как отрицательные по наличию антител; ЕР - ложно-положительные образцы от пациентов без СОУГО-19 в анамнезе и с антителами, определенные как положительные по наличию антител; ЕЫ - ложноотрицатель-ные образцы от пациентов с СОУГО-19 в анамнезе и без антител, определенные как отрицательные по наличию антител.
Максимальное значение достигается при значении МИ = 3267, при этом = 0,85, значение чувствительности составило 0,78, а специфичности - 0,92.
Перевод единиц измерения МШ в БЛИ/мл
Для формирования выборки для перевода единиц измерения МИ, получаемых на приборе Б1ехМар 3Б, в международную величину ВЛи/мл отобрано 88 образцов с известным анамнезом: из них 39 мужчин, 49 женщин, средний возраст участников 45 ± 11 лет, из них 25 участников перенесли СОУГО-19, 35 участников были вакцинированы от СОУГО-19, 28 участников не болели и не вакцинировались.
Для перевода значений МИ, получаемых на мультиплексном анализаторе, в международную величину ВЛи/мл выполнено дополнительное исследование с использованием набора реагентов для иммуноферментного количественного определения ¡Яв-антител к 8-белку 8ЛЯ8-СоУ-2 (8ЛЯ8-СоУ-2-1яО количественный-ИФА-БЕСТ, АО «Вектор-Бест»). На основе полученных данных построены диаграммы распределения количественных показателей уровня ¡яв-антител к вирусу 8ЛЯ8-СоУ-2 (рис. 2).
Для анализа корреляции был определен коэффициент корреляции Пирсона (г). Из полученных данных видно, что наибольшая корреляция выявлена между показателями ИФА и МИФА для ¡яв к 81-субъединице 8-белка 8ЛЯ8-СоУ-2 (г = 0,96) и рецептор-связывающему домену 8-белка вируса 8ЛЯ8-СоУ-2 (г = 0,95), а корреляция между показателями по 82-субъединице 8-белка 8ЛЯ8-СоУ-2 наблюдается в меньшей степени (г = 0,64). В результате для 81-субъединицы 8-белка 8ЛЯ8-СоУ-2 разработана линейная регрессионная модель следующего вида:
т = 492,770 + 31,320*6 ^ Ь = -15,733 + 0,032*т, (3) где Ь - величина в ВЛИ/мл, т - значение МН
Шкала перевода значений MFI в BAU/мл (для БЬсубъединицы S-белка)
Мультиплексный анализатор, MFI 806 3000 3267 5000 5192 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000
ИФА, BAU/мл 10 80 89 144 150 304 463 623 782 942 1102 1261
Тест Шапиро-Уилка, выполненный для отклонений точек реальных данных от линии регрессии, дал значение критерия W = 0,98 при p = 0,33, что позволяет принять нулевую гипотезу (Hg) о нормальности распределения остатков (разница между наблюдаемыми значениями и прогнозируемыми значениями в регрессионном анализе).
Коэффициент детерминации (доля дисперсии зависимой переменной, объясняемая рассматриваемой моделью) R2 составляет 0,9255. Область применения модели находится в диапазоне значений MFI от 0 до 35000.
В табл. приведены результаты перевода значений MFI в BAU/мл для S1-субъединицы S-белка.
Разработанная модель ограничивается переводом MFI в BAU/мл для S1-субъединицы S-белка SARS-CoV-2. Поскольку большинство зарегистрированных вакцин против COVID-19 нацелено на выработку антител к S-белку SARS-CoV-2, количественное определение уровня IgG-антител к этому белку может быть информативным методом оценки динамики напряженности иммунного ответа на вакцинацию препаратами «Спутник V» («Гам-КОВИД-Вак») и «Спутник Лайт», а также цельновирионными инактивированными вакцинами или вакцинами на основе мРНК S-белка.
Определение уровня вирус-нейтрализующей активности антител
Для определения серопротективного уровня антител оценивали нейтрализующую активность сывороток с известным уровнем IgG к S1-субъединице S-белка SARS-CoV-2.
Для этого были отобраны 120 биообразцов сывороток крови (54 женщины, 69 мужчин, средний возраст участников 47 ± 10) из разных групп (вакцинированные от COVID-19 - 48 участников; с COVID-19 в анамнезе -9 участников; не болели и не вакцинировались - 63 участника) с различным уровнем IgG к S1-субъединице S-белка (MFI = 11, MFI = -36 655), после чего была
v min ^ max
проанализирована их вирус-нейтрализующая активность с помощью суррогатного нейтрализационного теста (sVNT) (рис. 3). Проведенный анализ выявил высокую корреляцию между нейтрализующей активностью антител и MFI (r = 0,90).
В качестве серопротективного уровня антител выбрано значение уровня IgG к S1-субъединице S-белка в биообразце сыворотки, при котором вирус-ней-трализующая активность была > 20 % как минимум в 99 % образцов. Таким образом, серопротективный уровень антител достигается при значениях MFI по IgG к S1-субъединице S-белка > 3181 (86 BAU/мл), при этом все такие биообразцы имеют вирус-ней-
трализующую активность > 20 %, а при значениях МБ1 > 16 121 (500 ВЛи/мл) 94,4 % образцов имеют вирус-нейтрализующую активность > 50 % (рис. 3).
Обсуждение
МИФА обладает рядом преимуществ по сравнению с классическими методами детекции и определения концентрации аналитов в биоматериале: единовременное определение большого числа аналитов в одной лунке планшета, высокая чувствительность, широкий диапазон концентраций, минимальные затраты биоматериала и пр. В связи с этим данная технология подходит для исследования уровня антител к различным белкам 8ЛЯБ-СоУ-2 в масштабных эпидемиологических исследованиях.
На текущий момент в литературе не представлена методика перевода значений уровня в МИ в международные единицы измерения ВЛи/мл, а также не определен порог значений, получаемый на мультиплексном анализаторе, свидетельствующий о серопозитивности биообразца сыворотки по уровню к Б-белку БЛЯБ-СоУ-2, что затрудняло использование данной технологии для оценки динамики напряженности гуморального иммунитета к 8ЛЯБ-СоУ-2.
В проведенном нами исследовании продемонстрирована возможность перевода значений уровня к Б1-субъединице Б-белка БАЯБ-СоУ^ из МБ1 в ВЛИ/мл. Кроме того, определено пороговое значение уровня к Б1-субъединице Б-белка 8ЛЯ5-СоУ-2, которое дости-
S1
а.
н us <v
К
100 -90 -80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 -0 -
г = 0 ,9 1 V Г • ¥ • /
• • * в • • • ' у- ••
MFI
Рис. 3. Взаимосвязь нейтрализующей активности сывороток и уровня антител к БЬсубъединице Б-белка белка 8ЛЯБ-СоУ-2
гается при значении MFI 3267 и позволяет достоверно различить участников с COVID-19 в анамнезе от участников без COVID-19 в анамнезе.
Коэффициент корреляции между значениями, полученными методами МИФА и количественного ИФА для 82-субъединицы S-белка SARS-CoV-2, свидетельствует о невозможности создания однозначной шкалы перевода значений MFI в BAU/мл для этой антител к этой
■ Литература
1. Cui J., Li F., Shi Z.-L. Origin and evolution of pathogenic corona-viruses: 3. Nat. Rev. Microbiol. Nature Publishing Group. 2019; 17 (3): 181-92. DOI: https://www.doi.org/10.1038/s41579-018-0118-9
2. Wu J.T., Leung K., Leung G.M. Nowcasting and forecasting the potential domestic and international spread of the 2019-nCoV outbreak originating in Wuhan, China: a modelling study. Lancet Lond. Engl. 2020; 395 (10225): 689-97. DOI: https://www.doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30260-9
3. Хаитов Р.М., Скворцова В.И., Хаитов М.Р. Биомедицинская безопасность: иммуногенетика и коронавирусная инфекция. Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2022. 352 с. ISBN: 978-5-9704-7382-5.
4. Кармишин А.М., Борисевич И.В., Скворцова В.И., Горяев А. А., Юдин С.М. Вероятность возникновения инфекционного заболевания человека при эпидемии. Медицина экстремальных ситуаций. 2021; 23 (1): 5-11. DOI: https://www.doi.org/10.47183/mes.2021.007
5. Xia S., Zhu Y., Liu M., Lan Q., Xu W., Wu Y., Ying T., Liu S., Shi Z., Jiang S., Lu L. Fusion mechanism of 2019-nCoV and fusion inhibitors targeting HR1 domain in spike protein. Cell Mol Immunol. 2020; 17 (7): 765-7. DOI: https://www.doi.org/10.1038/s41423-020-0374-2
6. Bohn M.K., Loh T.P., Wang C.-B., Mueller R., Koch D., Sethi S., Rawlinson W. D., Clementi M., Erasmus R., Leportier M., Grimmler M., Yuen K. Y., Mancini N., Kwon G. C., Menezes M. E., Patru M.-M., Grameg-na M., Singh K., Najjar O., Ferrari M., Horvath A. R., Lippi G., Adeli K. and the IFCC Taskforce on COVID-19 Preprints 2020; 2020050413, DOI: https://www.doi.org/10.20944/preprints202005.0413.v1
7. Пащенков М.В., Хаитов М.Р. Иммунный ответ против эпидемических коронавирусов. Иммунология. 2020; 41 (1): 5-18. DOI: https:// www.doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-1-5-18
8. Bohn M.K. et al. IFCC Interim guidelines on serological testing of antibodies against SARS-CoV-2. Clin. Chem. Lab. Med. CCLM. De Gruyter, 2020; 58 (12): 2001-8. DOI: https://www.doi.org/10.1515/cclm-2020-1413
9. Гудима Г.О., Хаитов Р.М., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Молекуляр-но-иммунологические аспекты диагностики, профилактики и лечения коронавирусной инфекции. Иммунология. 2021; 42 (3): 198-210. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-198-210
10. Byazrova M., Yusubalieva G., Spiridonova A., Efimov G., Ma-zurov D., Baranov K., Baklaushev V., Filatov A. Pattern of circulating SARS-CoV-2-specific antibody-secreting and memory B-cell generation in patients with acute COVID-19. Clin Transl Immunology. 2021; 10 (2): e1245. DOI: https://www.doi.org/10.1002/cti2.1245
11. Byazrova M.G., Kulemzin S.V., Astakhova E.A., Belovezhets T.N., Efimov G.A., Chikaev A.N., Kolotygin I.O., Gorchakov A.A., Taranin A.V., Filatov A.V. Memory B cells induced by Sputnik V vaccination produce SARS-CoV-2 neutralizing antibodies upon ex vivo restimulation. Front Immunol. 2022; 13: 840707. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fim-mu.2022.840707
12. Byazrova M.G., Astakhova E.A., Minnegalieva A.R., Prili-pov A.G., Gorchakov A.A., Filatov A.V. Anti-Ad26 humoral immunity does not compromise neutralizing antibody responses following Ad26-based booster vaccination with Gam-COVID-Vac. Res. Square. 2022. DOI: https://www.doi.org/10.21203/rs.3.rs-1649181/v1
13. Astakhova E.A., Byazrova M.G., Yusubalieva G.M., Kulem-zin S.V., Kruglova N.A., Prilipov A.G., Baklaushev V.P., Gorchakov A.A., Taranin A.V., Filatov A.V. Functional profiling of in vitro reactivated memory B cells following natural SARS-CoV-2 infection and Gam-COVID-Vac vaccination. Cells. 2022; 11 (13): 1991. DOI: https://www. doi.org/10.3390/cells11131991
субъединице, что относится к ограничениям проведенного исследования.
В работе использовался набор для определения антител к полному 8-белку вируса 8ЛЯ8-СоУ-2. В рамках развития данной темы может быть проведена отдельная серия экспериментов с набором ИФА для определения ¡яв именно против 82-субъединицы 8-белка 8ЛЯ8-СоУ-2.
14. Sastre P., Rueda P., Vela C. Comparative study of seroneutra-lization and antibody response against the N-Protein of SARS-CoV-2. 2020.
15. Lapa D., Grousova D.M., Matusali G., Meschi S., Colavita F., Bettini A., Gramigna G., Francalancia M., Garbuglia A.R., Girardi E., Puro V., Antinori A., Kovyrshina A.V., Dolzhikova I.V., Shcheblyakov D.V., Tukh-vatulin A.I., Zubkova O.V., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Vaia F., Gints-burg A.L. Retention of neutralizing response against SARS-CoV-2 omicron variant in Sputnik V vaccinated individuals.Vaccines. 2022; 10 (5): 817. DOI: https://doi.org/10.3390/vaccines10050817
16. La Marca A., Capuzzo M., Paglia T., Roli L., Trenti T., Nelson S.M. Testing for SARS-CoV-2 (COVID-19): a systematic review and clinical guide to molecular and serological in-vitro diagnostic assays. Re-prod. Biomed. Online. 2020; 41 (3): 483-99. DOI: https://www.doi. org/10.1016/j.rbmo.2020.06.001
17. Скворцова В.И. Изучение молекулярно-генетических механизмов влияния вируса SARS-CoV-2 на человека для разработки средств диагностики и защиты. Доклад на Общем собрании РАН, 14-15 декабря 2021 года, г. Москва. URL: https://fmba.gov.ru/upload/ medialibrary/90f/2ylt93hxqqz2yn4ai0ud8fopk2owj24a/Prezentatsiya-V.I.-Skvortsovoy.pdf
18. Кармишин А.М., Носов Н.Ю., Поступайло В.Б., Жигар-ловский Б.А., Круглов А.А., Петухов А.Н. Метод количественной оценки напряженности и длительности иммунитета к SARS-COV-2 и динамики изменения титров антител. Медицина экстремальных ситуаций. 2021; 23 (2): 5-12. DOI: https://www.doi.org/10.47183/mes. 2021.019
19. Андреев И.В., Нечай К.О., Андреев А.И., Зубарева А.П., Есаулова Д.Р., Аленова А.М., Николаева И.А., Чернявская О.П., Ломоносов К.С., Шульженко А.Е., Курбачева О.М., Латышева Е.А., Шартанова Н.В., Назарова Е.В., Романова Л.В., Черченко Н.Г., Смирнов В.В., Аверков О.В., Мартынов А.И., Вечорко В.И., Гудима Г.О., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р., Хаитов Р.М. Поствакцинальный и постинфекционный гуморальный иммунный ответ на инфекцию SARS-CoV-2. Иммунология. 2022; 43 (1): 18-32. DOI: https://www.doi. org/10.33029/0206-4952-2022-43-1-18-32
20. Андреев А.И., Андреев И.В., Нечай К.О., Есаулова Д.Р., Бакла-кова О.С., Вечорко В.И., Шиловский И.П., Кофиади И.А., Гудима Г.О., Мартынов А.И., Смирнов В.В., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Взаимосвязь между возрастом и напряженностью поствакцинального гуморального иммунного ответа у лиц, ранее переболевших COVID-19. Иммунология. 2022; 43 (5): 583-92. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-583-592
21. Астахова Е.А., Бязрова М.Г., Миляев С.М., Сухова М.М., Михайлов А.А., Морозов А.А., Прилипов А.Г., Филатов А.В. Анализ методом проточной цитометрии антител против шиповидного белка SARS-CoV-2 в сыворотке вакцинированных добровольцев. Иммунология. 2022; 43 (4): 447-57. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-447-457
22. Reslova N., Michna V., Kasny M., Mikel P., Kralik P. xMAP Technology: Applications in Detection of Pathogens. Front Microbiol. 2017; 8: 55. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fmicb.2017.00055
23. Robin X., Turck N., Hainard A., Tiberti N., Lisacek F., Sanchez J.-C., Müller M. pROC: an open-source package for R and S+ to analyze and compare ROC curves. BMC Bioinformatics. 2011; 12: 77. DOI: https:// www.doi.org/10.1186/1471-2105-12-77
■ References
1. Cui J., Li F., Shi Z.-L. Origin and evolution of pathogenic coro-naviruses: 3. Nat Rev Microbiol Nature Publishing Group. 2019; 17 (3): 181-92. DOI: https://www.doi.org/10.1038/s41579-018-0118-9
2. Wu J.T., Leung K., Leung G.M. Nowcasting and forecasting the potential domestic and international spread of the 2019-nCoV outbreak originating in Wuhan, China: a modelling study. Lancet Lond Engl. 2020; 395 (10225): 689-97. DOI: https://www.doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30260-9
3. Khaitov R.M., Skvortsova V.I., Khaitov M.R. Biomedical safety: immunogenetics and coronavirus infection. Moscow: GEOTAR-Media, 2022. 352 p. ISBN: 978-5-9704-7382-5. (in Russian)
4. Karmishin A.M., Borisevich I.V., Skvortsova V.I., Goryaev A.A., Yudin S.M. Probability of infectious disease in humans during epidemic. Medicine of extreme situations. 2021; 23 (1): 5-11. DOI: https://www.doi. org/10.47183/mes.2021.007 (in Russian)
5. Xia S., Zhu Y., Liu M., Lan Q., Xu W., Wu Y., Ying T., Liu S., Shi Z., Jiang S., Lu L. Fusion mechanism of 2019-nCoV and fusion inhibitors targeting HR1 domain in spike protein. Cell Mol Immunol. 2020; 17 (7): 765-7. DOI: https://www.doi.org/10.1038/s41423-020-0374-2
6. Bohn M.K., Loh T.P., Wang C.-B., Mueller R., Koch D., Sethi S., Rawlinson W. D., Clementi M., Erasmus R., Leportier M., Grimmler M., Yuen K. Y., Mancini N., Kwon G. C., Menezes M. E., Patru M.-M., Grameg-na M., Singh K., Najjar O., Ferrari M., Horvath A. R., Lippi G., Adeli K. and the IFCC Taskforce on COVID-19 Preprints 2020; 2020050413. DOI: https://www.doi.org/10.20944/preprints202005.0413.v1
7. Pashenkov M.V., Khaitov M.R. Immune response against epidemic coronaviruses. Immunologiya. 2020; 41 (1): 5-18. DOI: https://www.doi. org/10.33029/0206-4952-2020-41-1-5-18 (in Russian)
8. Bohn M.K., et al. IFCC Interim guidelines on serological testing of antibodies against SARS-CoV-2. Clin Chem Lab Med CCLM. De Gruyter. 2020; 58 (12): 2001-8. DOI: https://www.doi.org/10.1515/cclm-2020-1413
9. Gudima G.O., Khaitov R.M., Kudlay D.A., Khaitov M.R. Molecular immunological aspects of diagnostics, prevention and treatment of coronavirus infection. Immunologiya. 2021; 42 (3): 198-210. DOI: https:// www.doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-198-210 (in Russian)
10. Byazrova M., Yusubalieva G., Spiridonova A., Efimov G., Ma-zurov D., Baranov K., Baklaushev V., Filatov A. Pattern of circulating SARS-CoV-2-specific antibody-secreting and memory B-cell generation in patients with acute COVID-19. Clin Transl Immunology. 2021; 10 (2): e1245. DOI: https://www.doi.org/10.1002/cti2.1245
11. Byazrova M.G., Kulemzin S.V., Astakhova E.A., Belovezhets T.N., Efimov G.A., Chikaev A.N., Kolotygin I.O., Gorchakov A.A., Taranin A.V., Filatov A.V. Memory B cells induced by Sputnik V vaccination produce SARS-CoV-2 neutralizing antibodies upon ex vivo restimulation. Front Immunol. 2022; 13: 840707. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fimmu.2022.840707
12. Byazrova M.G., Astakhova E.A., Minnegalieva A.R., Prilipov A.G., Gorchakov A.A., Filatov A.V. Anti-Ad26 humoral immunity does not compromise neutralizing antibody responses following Ad26-based booster vaccination with Gam-COVID-Vac. Res Square. 2022. DOI: https://www. doi.org/10.21203/rs.3.rs-1649181/v1
13. Astakhova E.A., Byazrova M.G., Yusubalieva G.M., Kulemzin S.V., Kruglova N. A., Prilipo vA. G., Baklaushev V. P., Gorchakov A. A., Taranin A.V., Filatov A.V. Functional profiling of in vitro reactivated memory B cells following natural SARS-CoV-2 infection and Gam-COVID-Vac vac-
Сведения об авторах
Фролова Лидия Владимировна - аналитик отд. медицинской геномики ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: LFrolova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-6823-9032
Земский Павел Юрьевич - аналитик отд. медицинской геномики ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: PZemskiy@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-8709-4991
cination. Cells. 2022; 11 (13): 1991. DOI: https://www.doi.org/10.3390/ cells11131991
14. Sastre P., Rueda P., Vela C. Comparative study of seroneutraliza-tion and antibody response against the N-Protein of SARS-CoV-2. 2020.
15. Lapa D., Grousova D.M., Matusali G., Meschi S., Colavita F., Bettini A., Gramigna G., Francalancia M., Garbuglia A.R., Girardi E., Puro V., Antinori A., Kovyrshina A.V., Dolzhikova I.V., Shcheblya-kov D.V., Tukhvatulin A.I., Zubkova O.V., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Vaia F., Gintsburg A.L. Retention of neutralizing response against SARS-CoV-2 omicron variant in Sputnik V vaccinated individuals. Vaccines. 2022; 10 (5): 817. DOI: https://doi.org/10.3390/vaccines10050817
16. La Marca A., Capuzzo M., Paglia T., Roli L., Trenti T., Nelson S. M. Testing for SARS-CoV-2 (COVID-19): a systematic review and clinical guide to molecular and serological in-vitro diagnostic assays. Reprod Biomed Online. 2020; 41 (3): 483-99. DOI: https://www.doi.org/10.1016Zj. rbmo.2020.06.001
17. Skvortsova V.I. Study of molecular and genetic mechanisms of the SARS-CoV-2 virus effect on humans for the development of diagnostic and protection tools. Report at the General Meeting of the Russian Academy of Sciences, December 14-15, 2021, Moscow. URL: https://fmba. gov.ru/upload/medialibrary/90f/2ylt93hxqqz2yn4ai0ud8fopk2owj24a/ Prezentatsiya-V.I.-Skvortsovoy.pdf
18. Karmishin A.M., Nosov N.Yu., Postupailo V.B., Zhigarlovsky B.A., Kruglov A.A., Petukhov A.N. A method for quantifying the intensity and duration of immunity to SARS-COV-2 and the dynamics of changes in antibody titers. Medicine of extreme situations. 2021; 23 (2): 5-12. DOI: https://www.doi.org/10.47183/mes.2021.019 (in Russian)
19. Andreev I.V., Nechay K.O., Andreev A.I., Zubaryova A.P., Esau-lova D.R., Alenova A.M., Nikolaeva I.A., Chernyavskaya O.P., Lomono-sov K.S., Shulzhenko A.E., Kurbacheva O.M., Latysheva E.A., Sharta-nova N.V., Nazarova E.V., Romanova L.V., Cherchenko N.G., Smir-nov V.V., Averkov O.V., Martynov A.I., Vechorko V.I., Gudima G.O., Kud-lay D.A., Khaitov M.R., Khaitov R.M. Post-vaccination and post-infection humoral immune response to the SARS-CoV-2 infection. Immunologiya. 2022; 43 (1): 18-32. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-1-18-32 (in Russian)
20. Andreev A.I., Andreev I.V., Nechay K.O., Esaulova D.R., Bakla-kova O.S., Vechorko V.I., Shilovskiy I.P., Kofiadi I.A, Gudima G.O., Martynov A.I., Smirnov V. V., Kudlay D.A., Khaitov M.R. Correlation between age and the intensity of the post-vaccination humoral immune response in individuals passed COVID-19. Immunologiya. 2022; 43 (5): 583-92. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-583-592 (in Russian)
21. Astakhova E.A., Byazrova M.G., Milyaev S.M., Sukhova M.M., Mikhailov A.A., Morozov A.A., Prilipov A.G., Filatov A.V. Flow cytometric assay for the detection of anti-SARS-CoV-2 Spike antibodies in serum of vaccinated volunteers. Immunologiya. 2022; 43 (4): 447-57. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-447-457 (in Russian)
22. Reslova N., Michna V., Kasny M., Mikel P., Kralik P. xMAP technology: applications in detection of pathogens. Front Microbiol. 2017; 8: 55. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fmicb.2017.00055
23. Robin X., Turck N., Hainard A., Tiberti N., Lisacek F., Sanchez J.-C., Müller M. pROC: an open-source package for R and S+ to analyze and compare ROC curves. BMC Bioinformatics. 2011; 12: 77. DOI: https:// www.doi.org/10.1186/1471-2105-12-77
Authors' information
Lidiya V. Frolova - Analyst, Medical Genomics Dept., CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: LFrolova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-6823-9032
Pavel Yu. Zemsky - Analyst, Medical Genomics Dept., CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: PZemskiy@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-8709-4991
Митрофанов Сергей Игоревич - вед. аналитик отд. медицинской геномики ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: Mitrofanov@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0003-0358-0568
Мухин Владимир Евгеньевич - канд. мед. наук, зам. начальника отд. анализа и прогнозирования медико-биологических рисков здоровью ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: VMukhin@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-8973-7890
Шпакова Татьяна Андреевна - аналитик отд. медицинской геномики ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: Maslova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0003-1450-929X
Казакова Полина Геннадьевна - аналитик 2-й категории отд. медицинской геномики ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: PKazakova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0002-8966-4158
Ахмерова Юлия Николаевна - аналитик отд. медицинской геномики ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: YUAhmerova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0002-8805-7073
Буланова Наталья Владимировна - аналитик отд. медицинской геномики ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: NBulanova@cspfmba.ru https://orcid.org/ 0000-0002-6778-970X
Голубникова Лилия Андреевна - аналитик отд. медицинской геномики ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: Golubnikova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-6187-1887
Грамматикати Константин Сергеевич - аналитик 1-й категории отд. медицинской геномики ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: grammatikati@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-9745-214X
Жданова Анастасия Сергеевна - аналитик отд. анализа и прогнозирования медико-биологических рисков здоровью ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: AJdanova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-8613-1738
Мкртчян Анастасия Алексеевна - аналитик отд. медицинской геномики ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: AVasileva@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-5910-5868
Sergey I. Mitrofanov - Lead analyst, Medical Genomics Dept., CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: Mitrofanov@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0003-0358-0568
Vladimir E. Mukhin - PhD, Deputy Head of the Dept. of Analysis and Forecasting of Biomedical Health Risks, CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: VMukhin@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-8973-7890
Tatyana А. Shpakova - Analyst, Medical Genomics Dept., CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: Maslova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0003-1450-929X
Polina G. Kazakova - The 2nd Category Analyst, Medical Genomics Dept., CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: PKazakova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0002-8966-4158
Yuliya N. Akhmerova - Analyst, Medical Genomics Dept., CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: YUAhmerova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0002-8805-7073
Natalya V. Bulanova - Analyst, Medical Genomics Dept., CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: NBulanova@cspfmba.ru https://orcid.org/ 0000-0002-6778-970X
Liliya A. Golubnikova - Analyst, Medical Genomics Dept., CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: Golubnikova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-6187-1887
Konstantin S. Grammatikati - The 1st Category Analyst, Medical Genomics Dept., CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: grammatikati@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-9745-214X
Anastasia S. Zhdanova - Analyst, Dept. of Analysis and Forecasting of Biomedical Health Risks, CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: AJdanova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-8613-1738
Anastasia A. Mkrtchian - Analyst, Medical Genomics Dept., CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: AVasileva@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-5910-5868
Сергеев Андрей Павлович - аналитик 1-й категории отд. медицинской геномики ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ASergeev@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0003-4005-9018
Снигирь Екатерина Андреевна - канд. биол. наук, ведущий аналитик отд. медицинской геномики ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ESnigir@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0003-1245-7764
Фелиз Надежда Владимировна - аналитик 2-й категории отд. медицинской геномики ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: NSmirnova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-6620-2770
Макаров Валентин Владимирович - канд. биол. наук, начальник отд. анализа и прогнозирования медико-биологических рисков здоровью ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: Makarov@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-9495-0266
Юдин Владимир Сергеевич - канд. биол. наук, начальник отд. медицинской геномики ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: VYudin@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0002-9199-6258
Кескинов Антон Артурович - канд. мед. наук, канд. экон. наук, начальник управления организации проведения научных исследований ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: Keskinov@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-7378-983X
Краевой Сергей Александрович - д-р мед. наук, первый зам. генерального директора ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: SKraevoy@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0003-1775-9235
Юдин Сергей Михайлович - д-р мед. наук, генеральный директор ФГБУ ЦСП ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: yudin@cspmz.ru https://orcid.org/0000-0002-7942-8004
Скворцова Вероника Игоревна - член-корр. РАН, д-р мед. наук, проф., руководитель ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: Skvortsova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0003-2815-280X
Andrey P. Sergeev - The 1st Category Analyst, Medical Genomics Dept., CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: ASergeev@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0003-4005-9018
Ekaterina A. Snigir - PhD, Lead analyst, Medical Genomics Dept., CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: ESnigir@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0003-1245-7764
Nadezhda V. Feliz - The 2nd Category Analyst, Medical Genomics Dept., CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: NSmirnova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-6620-2770
Valentin V. Makarov - PhD, Head of the Dept. of Analysis and Forecasting of Biomedical Health Risks, CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: Makarov@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-9495-0266
Vladimir S. Yudin - PhD, Head of the Medical Genomics Dept., CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: VYudin@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0002-9199-6258
Anton A. Keskinov - PhD, Head of the Dept. of Organization of Scientific Research, CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: Keskinov@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0001-7378-983X
Sergey A. Kraevoy - MD, 1st Deputy General director, CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: SKraevoy@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0003-1775-9235
Sergey M. Yudin - MD, General director, CSP of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: yudin@cspmz.ru https://orcid.org/0000-0002-7942-8004
Veronika I. Skvortsova - Corr. Member of RAS, MD, PhD, Professor, Head of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: Skvortsova@cspfmba.ru https://orcid.org/0000-0003-2815-280X
