ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ШИПОВИДНОГО БЕЛКА SARS-COV-2 В СЫВОРОТКЕ ВАКЦИНИРОВАННЫХ ДОБРОВОЛЬЦЕВ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© Коллектив авторов, 2022

Астахова Е.А.1' 2, Бязрова М.Г.1-3, Миляев С.М.1, Сухова М.М.1,2,

Михайлов А. А.1, 2, Морозов А. А.1, 2, Прилипов А.Г.1, 4, Филатов А.В.1, 2

Определение антител против шиповидного белка SARS-CoV-2 в сыворотке вакцинированных добровольцев методом проточной цитометрии

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация

2 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Медицинский научно-образовательный центр Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова», 119192, г. Москва, Российская Федерация

3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 117198, г. Москва, Российская Федерация

4 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 123098, г. Москва, Российская Федерация

Резюме

Введение. Определение антител против шиповидного (Spike, S) белка нового корона-вируса SARS-CoV-2 широко используется для подтверждения текущей или перенесенной инфекции SARS-CoV-2, а также в качестве показателя эффективности вакцинации против COVID-19. Наиболее распространенным методом определения анти^-антител является иммуноферментный анализ (ELISA), в котором используется рекомбинантный S-белок. Метод иммунофлуоресценции с последующей проточной цитометрией предоставляет альтернативную возможность для определения анти^-антител, где в качестве S-антигена используется белок в нативной трансмембранной конформации.

Цель исследования - отработка метода определения анти^-антител с помощью проточной цитометрии, а также подбор наиболее адекватного метода обработки экспериментальных данных.

Материал и методы. В исследовании приняли участие 22 добровольца (7 мужчин и 15 женщин от 25 до 70 лет, медиана - 48 лет). Все добровольцы с января по февраль 2021 г. были вакцинированы двумя дозами вакцины «Спутник V». Образцы сывороток доноров были собраны до вакцинации «Спутником V» и через 3 мес после вакцинации. 5 добровольцев к моменту вакцинации уже переболели COVID-19 в легкой форме. Остальные 17 добровольцев до вакцинации не встречались с антигеном SARS-CoV-2. Антитела против S-белка определяли методом иммунофлуоресценции с регистрацией на проточном цитометре. В качестве мишеней использовали клетки HEK293, временно трансфецированные плазмидой, кодирующей S-белок дикого типа. Трансфекцию проводили кальций-фосфатным методом. Клетки обрабатывали последовательно разведенными сыворотками, а затем окрашивали вторичными антителами анти-^О-РЕ и анти-IgM-FITC. Уровень флуоресценции измеряли с помощью проточного цитоме-тра. В качестве результата измерения использовали среднее значение флуоресценции (mean fluorescence intensity, MFI), полученное при разведении сыворотки в 18 раз, или площадь под кривой титрования (area under curve, AUC). Анти-RBD-антитела определяли с помощью иммуноферментного анализа, а вирус-нейтрализующую активность -с помощью псевдотипированного или суррогатного вирус-нейтрализационного анализа (pVNA и sVNA).

Результаты. С помощью отработанного метода было показано образование анти-S-антител изотипов IgG и IgM через 3 мес после иммунизации вакциной «Спутник V». В упрощенном варианте метода относительную концентрацию антител определяли при единственном разведении тестируемой сыворотки путем измерения средней интенсивности флуоресценции (MFI) клеток-мишеней. Более надежные результаты были получены при регистрации кривой титрования и подсчета площади под кривой (AUC). Полученные таким образом результаты хорошо коррелировали с определением анти-RBD-антител методом ELISA, а также с данными вирус-нейтрализации в псевдотипиро-ванном и суррогатном вариантах.

Для корреспонденции

Филатов Александр Васильевич -доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427

Заключение. Проточная цитометрия - это удобный метод для одновременного определения в сыворотке человека анти-8-антител изотипов и ^М. К преимуществам метода относится то, что 8-белок представляется в нативной трансмембранной конфор-мации. После незначительной модификации отработанный метод можно использовать для определения уровня анти-8-антител против мутантных вариантов 8ЛЯ8-СоУ-2.

Ключевые слова: коронавирусная инфекция; 8ЛЯ8-СоУ-2; СОУГО-19; антитела; проточная цитометрия

Статья получена 26.05.2022. Принята в печать 27.06.2022.

Для цитирования: Астахова Е.А., Бязрова М.Г., Миляев С.М., Сухова М.М., Михайлов А. А., Морозов А.А., Прилипов А.Г., Филатов А.В. Анализ методом проточной цитометрии антител против шиповидного белка 8ЛЯ8-СоУ-2 в сыворотке вакцинированных добровольцев. Иммунология. 2022; 43 (4): 447-457. БО1: Шр§:// doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-447-457

Финансирование. Работа поддержана грантом РНФ № 21-15-00286. Работа Бязровой М.Г. выполнена при поддержке Программы стратегического академического лидерства ФГАОУ ВО РУДН Минобрнауки России.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Сбор и обработка материала - Миляев С.М., Бязрова М.Г, Сухова М.М., Михайлов А.А., Морозов А.А.; написание текста, редактирование - Астахова Е.А., Филатов А.В.; окончательный вариант и целостность текста - Прилипов А.Г., Филатов А.В.

Astakhova E.A.1' 2, Byazrova M.G.1-3, Milyaev S.M.1, Sukhova M.M.1 2, Mikhailov A.A.1 2, Morozov A.A.1 2, Prilipov A.G.1 4, Filatov A.V.1 2

Flow cytometric assay for the detection of anti-SARS-CoV-2 Spike protein antibodies in serum of vaccinated volunteers

1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation

2 M.V. Lomonosov Moscow State University, 119234, Moscow, Russian Federation

3 Peoples' Friendship University of Russia of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, 117198, Moscow, Russian Federation

4 Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya, Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russian Federation

Abstract

Introduction. The determination of antibodies against the Spike (S) protein of the novel coronavirus is widely used to confirm current or past infection with SARS-CoV-2, and as an indicator of the effectiveness of vaccination against COVID-19. The most common method for detecting anti-S-antibodies is enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which uses a recombinant S-protein. Immunofluorescence followed by flow cytometry provides an alternative approach to detect anti-S-antibodies, where a protein in the native transmembrane conformation is used as the S-antigen.

The aim of the study was to develop a method for determining anti-S-antibodies using flow cytometry, and to select the most appropriate method for processing experimental data.

Material and methods. The study involved 22 volunteers (7 men and 15 women aged 25 to 70 years, median 48). All volunteers were vaccinated with two doses of the «Sputnik V» vaccine between January and February 2021. Donor sera samples were collected before vaccination with «Sputnik V» and 3 months after vaccination. 5 volunteers had already had a mild form of COVID-19 before the time of vaccination. The remaining 17 volunteers did not encounter the SARS-CoV-2. Antibodies against S-protein were determined by immunofluorescence with registration on a flow cytometer. HEK293 cells were transiently transfected with a plasmid encoding the wild type S-protein which was used as target. Transfection was performed by the calcium phosphate method. Cells were incubated with serially diluted sera and then stained with anti-IgG-PE and anti-IgM-FITC secondary antibodies. The fluorescence level was measured using a flow cytometer. As a measurement result, the mean fluorescence intensity (MFI) obtained at 1:18 serum dilution, or the area under the titration curve (area under curve, AUC) was used. Anti-RBD-antibodies were determined using enzyme immunoassay, and virus-neutralizing activity using pseudotyped or surrogate virus-neutralization analysis (pVNA and sVNA).

For correspondence

Alexander V. Filatov -Dr.Sci., PhD, Prof., Head of the Immunochemistry Laboratory of NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427

Results. Using the developed method, the formation of anti-S antibodies of the IgG and IgM isotypes was shown 3 months after immunization with the «Sputnik V» vaccine. In a simplified version of the method, the relative concentration of antibodies was determined at a single dilution of the test serum by measuring the mean fluorescence intensity (MFI) of the target cells. More reliable results were obtained by construction the titration curve and calculating the area under the curve (AUC). The results thus obtained correlated well with the detection of anti-RBD antibodies by ELISA, as well as with virus neutralization data in pseudotyped and surrogate assays.

Conclusion. Flow cytometry is a convenient method for the simultaneous determination of anti-S antibodies of IgG and IgM isotypes in human serum. The advantages of the method include the fact that the S-protein is presented in a native transmembrane conformation. After minor modification, the established method can be used to determine the level of anti-S-anti-bodies against mutant variants of SARS-CoV-2.

Keywords: coronavirus infection; SARS-CoV-2; COVID-19; antibodies; flow cytometry

Received 26.05.2022. Accepted 27.06.2022.

For citation: Astakhova E.A., Byazrova M.G., Milyaev S.M., Sukhova M.M., Mikhailov A.A., Morozov A.A., Prilipov A.G., Filatov A.V. Flow cytometric assay for the detection of anti-SARS-CoV-2 Spike antibodies in serum of vaccinated volunteers. Immunologiya. 2022; 43 (4): 447-57. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-447-457 (in Russian)

Funding. The study was supported by the grant of Russian Science Foundation (RSF) No. 21-15-00286. Byazrova M.G. was supported by the Strategic Academic Leadership Program from RUDN University of Minobrnauki.

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.

Authors' contribution. Collection and processing of material - Milyaev S.M., Byazrova M.G., Sukhova M.M., Mikhailov A.A., Morozov A.A.; text writing, editing - Astakhova E.A., Filatov A.V.; the final version of the text -Prilipov A.G., Filatov A.V.

Введение

В эпоху глобального распространения нового коро-навируса, который вызывает тяжелый острый респираторный синдром (SARS-CoV-2), большое значение приобрели методы диагностики вызываемой им инфекции. Тестирование с помощью обратной транскрипции, амплификации и последующей полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) позволяет обнаруживать коронавирус на самых ранних стадиях инфекции, однако этот метод плохо применим к более поздним периодам заболевания [1]. Тест на антитела против антигенов SARS-CoV-2 является дополнительным по отношению к ОТ-ПЦР-РВ, при этом он обладает некоторыми преимуществами, поскольку может являться показателем не только текущей инфекции, но и свидетельствовать о недавно перенесенном заболевании. Было показано, что титры антител против SARS-CoV-2 коррелируют с тяжестью заболевания, отражая более высокую скорость репликации вируса у пациентов с тяжелым заболеванием и, соответственно, более интенсивный иммунный ответ. Наряду с этим анализ антительного ответа также широко используется в качестве показателя эффективности вакцинации против COVID-19 [2].

К настоящему времени разработан целый ряд методов, позволяющих анализировать вирус-специфические антитела. В первую очередь это различные модификации иммуноферментного анализа с колориметрической (ELISA) и хемилюминесцентной (CLIA) детекцией сиг-

нала [3, 4]. Примерно на тех же принципах основаны методы с использованием чипов [5]. Общая черта этих методов - использование биохимически выделенных антигенов, которые сорбируют на твердую фазу.

В простейшем случае в качестве антигена используют фрагмент шиповидного белка (Spike, S), так называемый рецептор-связывающий домен (receptor binding domain, RBD). Этот антиген наиболее прост в производстве и соответствует наиболее важной в функциональном отношении части S-белка, которая отвечает за связывание с рецептором ACE2. В более передовых версиях иммуноанализа в качестве антигена используют полноразмерный S-белок, а в некоторых случаях - его тримеризованную форму, которая в большей степени соответствует нативной конформации S-белка.

В качестве альтернативного метода для определения анти^-антител было предложено использовать иммунофлуоресцентое окрашивание с последующей регистрацией на проточном цитометре (FC) [6-9]. В качестве мишеней используются клетки, временно или стабильно трансфецированные вектором, кодирующим S-белок.

В этом подходе отсутствует стадия выделения антигена, то есть антиген используется в конформации, в которой он присутствует на поверхности корона-вируса.

В данной работе представлен отработанный нами вариант метода определения анти^-антител в сыворотке вакцинированных добровольцев с помощью им-мунофлуоресцентного окрашивания и последующей

регистрацией на проточном цитометре. Разработанная система детекции поддается стандартизации и может быть использована для мультиплексного обнаружения Ig всех изотипов в одном анализе. Предложенную систему можно легко переформатировать для определения антител против мутантных вариантов коронавируса.

Материал и методы

Характеристика пациентов. В исследование были включены 22 добровольца (7 мужчин и 15 женщин от 25 до 70 лет, медиана - 48 лет). Все добровольцы с января по февраль 2021 г. были вакцинированы двумя дозами вакцины «Спутник V». Образцы сывороток доноров были собраны до вакцинации «Спутником V» (М0) и через 3 мес после вакцинации (М3). 5 из 22 добровольцев к моменту вакцинации уже переболели COVID-19 в легкой форме. Остальные 17 добровольцев до вакцинации не встречались с антигеном SARS-CoV-2, что было подтверждено анализом на сывороточные антитела против нуклеокапсидного белка коронавируса. Исследование выполнено в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека в качестве испытуемого». От каждого участника исследования получено письменное информированное согласие. Протокол исследования рассмотрен и одобрен Этическим комитетом ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (протокол № 12-1, 29 декабря 2020 г.).

Определение анти-8-антител методом FC. На 10-сантиметровую чашку Петри высевали 3,6 млн клеток НЕК293. На следующий день клетки трансфеци-ровали 30 мкг плазмиды pCG1-SARS-S, кодирующей кодон-оптимизированный S-белок дикого типа с де-лецией 19 аминокислотных остатков на С-конце [10]. Трансфекцию проводили кальций-фосфатным методом. Через 6 ч среду меняли на свежую, а через 2 сут клетки НЕК293, экспрессирующие S-белок, собирали и использовали в тесте. Экспрессию S-белка контролировали в каждом опыте путем окрашивания трансфециро-ванных клеток моноклональным анти-RBD-антителом (клон XR15 был любезно предоставлен Ю.С. Лебединым). Эффективность трансфекции варьировала от 80 до 90 %, что считали незначительными отклонениями. Последовательно разведенные образцы сывороток в объеме 20 мкл добавляли к равному объему суспензии из 10 000 клеток HEK293-S в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и инкубировали в течение 30 мин при 4 °С. Для проявления использовали вторичные антитела к иммуноглобулинам человека анти-IgG-PE (клон CH1) и анти-IgM-FITC (клон МА2), ранее полученные в нашей лаборатории. Клетки инкубировали со вторичными антителами в темноте при 4 °С. Между всеми инкуба-циями проводили по 2 отмывки в 200 мкл ФСБ. Уровень флуоресценции измеряли с помощью проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США). На цитограммах не наблюдали четкого расхождения позитивных и негативных клеточных популяций. Для того

чтобы свести к минимуму субъективный фактор при выборе пределов интегрирования, значения MFI определяли для клеточной популяции в целом. В качестве результата измерения использовали среднее значение флуоресценции (mean fluorescence intensity, MFI), полученное при разведении сыворотки в 18 раз, или площадь под кривой титрования (area under curve, AUC). Из полученных значений вычитали MFI от фонового связывания сывороток с нетрансфецированными клетками. Сыворотки добровольцев, которые не болели COVID-19 и не были вакцинированы, использовали в качестве отрицательного контроля.

Определение анти-КЕБ-антител методом ELISA. Уровень RBD-специфических антител в образцах плазмы определяли с помощью набора производства «Хема Медика» (Москва, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. В качестве проявочных антител использовали конъюгат CH1-HRP для определения специфических антител IgG-изотипа или MA2-biotin и авидин-HRP для определения антител IgM-изотипа.

Определение вирус-нейтрализующих антител методом pVNA. Для проведения теста мы использовали вирусоподобные частицы (VLP), на поверхности которых находился S-белок дикого типа [10]. Для каждого образца сыворотки делали последовательные разведения с шагом 4, начиная с разведения 1 : 4. К 20 мкл разведенной сыворотки добавляли 10 мкл VLP, инкубировали 30 мин. После этого смесь добавляли в лунки 96-луночных планшетов, в которые предварительно были посеяны клетки НЕК293, стабильно экспрессирующие АСЕ2 (5000 клеток на лунку). Через 3 сут клетки собирали и с помощью проточного цитометра измеряли процент GFP-позитивных клеток. По полученным кривым титрования находили ID50 - разведение сыворотки, при котором наблюдается 50 % блокирующий эффект.

Определение вирус-нейтрализующих антител методом sVNA. Тест проводили с помощью набора SARS-CoV-2 ВНАФА «Хема Медика» (Россия) (REF К533). Образцы сыворотки разводили в 10 раз буфером для образцов и добавляли к ним конъюгат RBD-HRP в соотношении 1 : 10. Инкубировали 30 мин при 37 °C. Далее 100 мкл реакционной смеси переносили в планшет с сорбированным АСЕ2 и инкубировали еще 30 мин при 37 °C. Отмывали лунки 5 раз раствором для отмывки. Добавляли 100 мкл ТМВ и инкубировали до появления синего окрашивания, а затем останавливали реакцию добавлением 100 мкл стоп-реагента. Оптическую плотность полученного раствора измеряли с помощью фотометра iMark Microplate Absorbance Reader (BioRad, США).

Статистическая обработка данных проведена с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версия 8.4.3 (GraphPad, США). Значимость различий между выборками оценивали с помощью критерия Вилкоксона. Различия сравниваемых параметров считались статистически значимыми при p < 0,05. Данные на гистограммах показывают медиану и межквартильный

О

£ 8000-

о Рч 6000-

о ад 4000-

00 2000-

X т н < 0 -0

§ 12 000-

О Рч 9000-

£ ад 6000-

00 3000-

х т н < 0 -0 Ра

О

£ 8000-

о Рч 6000-

о ад 4000-

00 2000-

X т н < 0 -0

§ 12 000-

О Рч 9000-

£ ад 6000-

00 3000-

х т н 0 --

□ МО оМ3

3

□ МО ОМ3

Разведение сывороток (1о§ю)

□ МО ОМ3

0 12 3 Разведение сывороток (1о§ю)

э

о

Рч

о

ад

00 X

т н

«С

8000

6000

4000-

2ООО

р < 0,0001

О

f

о

Рч

о

н

«с

15 000 -,

10 000 -

5000

М0 М3

р < 0,0001

о >

су

Х>

М0

М3

10 000

8000-

о

Рч

ОО ±

т н

«С

6000

4000-

2000

20 000

15 000 -

О Рч

3 10 000

ад

00 ±

н

«С

5000

р = 0,0233

о

М0

М3

р = 0,0002

М0

М3

Рис. 1. Определение анти-Б-антител в сыворотке вакцинированных добровольцев с помощью метода проточной цитометрии (ЕС) Репрезентативные кривые титрования антител изотипов IgG и IgM до (М0) и через 3 мес после вакцинации (М3). Заштрихованным прямоугольником показано значение MFI (А) и область под кривой (Б); уровни IgG- и IgM-антител определены при учете значений MFI (В) или AUC (Г); заполненными квадратами и кружками показаны доноры, переболевшие COVID-19 до вакцинации «Спутником V».

0

0

0

0

размах. Количественную оценку статистической связи между параметрами проводили, рассчитывая коэффициент ранговой корреляции по Спирмену (г). При расчете площади под кривыми титрования (АиС) каждое разведение в 10 раз принимали за единицу.

Результаты

Для определения уровня Б-специфических антител ^О- и ^М-изотипа в сыворотках добровольцев нами был отработан метод с применением проточной цитометрии (ЕС). В качестве мишеней мы использовали клетки НЕК293Т, временно трансфецированные плаз-мидой, кодирующей коронавирусный Б-белок (293Т-Б). Последовательно разведенные образцы сывороток инкубировали с клетками 293Т-Б. Сывороточные антитела, связавшиеся с Б-белком, проявляли конъюгатами

вторичных антител анти-^О-РЕ и анти-^М-Р1ТС. Одновременная регистрация флуоресценции в оранжевом и зеленом каналах позволяла определять уровни анти-Б-антител ^О- и ^М-изотипа в одном измерении. Интенсивность флуоресценции клеток 293Т-Б, к которым не добавляли сыворотку, принимали за фоновые значения, которые вычитали из опытных показателей.

На рис. 1 приведены репрезентативные кривые титрования, полученные при измерении уровня анти-Б-антител изотипов ^О (рис. 1А, верхняя панель) и ^М (рис. 1А, нижняя панель) в сыворотке одного из доноров. Сыворотка была последовательно разведена в 2, 6, 18, 54, 162, 500, 1500 раз. При разведении сыворотки мы наблюдали падение уровня иммуно-флуоресценции.

Для анализа уровня антител мы использовали два подхода. В первом в качестве меры уровня анти-

Э

о

Рч

о

х

<

10 000

1000

r = 0,7504 p < 0,0001

оо

о°о

со

о о

°«9

О

о

100 1000

Анти-RBD-IgG, ELISA, нг/мл

10 000

Э

О Рч

G,

н Ан

10 000

1000

r = 0,5808 p = 0,0046

О о о

о° о

о

10 100 Анти-RBD-IgМ, ELISA, отн. ед.

э

о

CJ Рч

G, g

н Ан

10 000

1000

r = 0,8216 p < 0,0001

Оо

0°00

О

О 0СР

о о

о оО

100 1000

Анти-RBD-IgG, ELISA, нг/мл

10 000

О

о"

Рч

н Ан

10 000

1000

r = 0,5720 p = 0,0054

О О

ö9Q

10 100 Анти-RBD-IgM, ELISA, отн. ед.

Рис. 2. Корреляционный анализ между уровнями анти-Б-антител, определенных методом проточной цитометрии (FC), и анти-RBD-антител, определенных методом ELISA

Уровни анти-Б-антител изотипов IgG (А, В) и IgM (Б, Г) были определены методом FC при учете значений MFI (А, Б) или AUC (В, Г).

тел использовали значения MFI, полученные при разведении сывороток в 18 раз (рис. 1А, область выделена заштрихованными прямоугольниками). Как правило, это разведение примерно соответствовало 50 % падению иммунофлуоресценции по сравнению с неразведенной сывороткой, приходилось на наиболее крутой и линейный участок кривой титрования и, следовательно, обеспечивало самую высокую чувствительность метода. Согласно другому подходу, для каждого образца рассчитывали площадь под кривой титрования и выражали ее в единицах AUC (area under curve) (рис. 1В, заштрихованная область).

При анализе с учетом значений MFI через 3 мес после вакцинации уровень анти^-антител IgG-изотипа увечился в 8,9 раз (p < 0,0001). У 2 из 5 ранее переболевших COVID-19 доноров (точки закрашены черным цветом) уровень анти^-антител IgG-изотипа существенно превышал медианное значение выборки уже

в точке М0 (MFI = 3300 и 1600 при медианном значении 210). Через 3 мес после вакцинации мы также наблюдали увеличение уровня анти^-антител IgM-изотипа (р = 0,0233), хотя медианные значения увеличились только в 1,2 раза (рис. 1Б). Аналогичные результаты получены при учете значений AUC (рис. 1Г). Через 3 мес после вакцинации уровень анти-8-антител увеличился в 31 раз (p < 0,0001) для IgG-изотипа и в 1,6 раза (p = 0,0002) для IgM-изотипа.

Для сравнения результатов, полученных разработанным методом FC, а также традиционным иммунофер-ментным анализом ELISA, мы провели их корреляционный анализ по Спирмену (рис. 2). При учете значений MFI наблюдалась хорошая корреляция между анти-S-и анти-ИББ-антителами, определенными методами FC и ELISA (r = 0,7504, p < 0,0001; r = 0,5808, p = 0,0046, для IgG- и IgM-антител соответственно). Еще более высокая корреляция между этими параметрами наблюда-

э

о

Рч

о

± <

10 000

1000 -

r = 0,7945 p < 0,0001

ОО

о О

Р о

<8

<0

10 100 Вирус-нейтрализация (sVNA), %

э

о

Рч

о

н

<

10 000

1000-

r = 0,7482 p < 0,0001

о

О о О (9

, « О

ю

Ъ

10 100 1000

Вирус-нейтрализация (pVNA), ID50

э

о о"

Рч

О

н

<

10 000

1000

r = 0,8566 p < 0,0001

О О

ООО

о

в

о

10 100 Вирус-нейтрализация (sVNA), %

О Рч

О

н

<

10 000

1000-

r = 0,7854 p < 0,0001

°nO °

> <9 ©

О О О

© О

<д

о о

10 100 1000

Вирус-нейтрализация (pVNA), ID30

Рис. 3. Корреляционный анализ между уровнями анти^-антител IgG-изотипа, определенных методом проточной цитометрии (FC), и вирус-нейтрализующих антител

Уровни анти-Б-антител IgG-изотипа бъгли определены методом FC при учете значений MFI (А, Б) или AUC (В, Г); вирус-нейтра-лизующая активность бъгла определена с помощью sVNA (А, В) или pVNA (Б, Г).

лась при учете значений AUC (r = 0,8216, p < 0,0001; r = 0,5720, p = 0,0054, для IgG- и IgM-антител соответственно).

Степень защиты от COVID-19 после вакцинации во многом зависит от уровня вирус-нейтрализующих антител в сыворотке донора [11, 12]. Вирус-нейтрализация SARS-CoV-2 в основном происходит за счет специфических антител IgG-изотипа. На следующем этапе исследования мы сравнили анти^-антитела IgG-изотипа, определенные с помощью FC, со способностью сывороток нейтрализовать вирус (рис. 3).

Вирус-нейтрализующую активность мы определяли двумя методами: с помощью псевдотипированного лентивируса, на поверхности которого располагается коронавирусный S-белок (pVNA), а также с помощью суррогатного вирус-нейтрализующего анализа (sVNA), который работает по принципу ELISA, где на подложке сорбируется ACE2, а в качестве лиганда используется

комплекс КВО-ИКР. Результаты корреляционного анализа приведены на рис. 3. При анализе с учетом значений МР1 наблюдалась хорошая корреляция между вирус-связывающей и вирус-нейтрализующей активностями антител (г = 0,7945, р < 0,0001; г = 0,7482, р < 0,0001, для sVNA и pVNA соответственно). При анализе значений ЛиС обнаруживалась более высокая степень корреляции (г = 0,8566, р < 0,0001; г = 0,7854, р < 0,0001, для sVNA и pVNA соответственно).

Обсуждение

Определение антител против коронавирусных антигенов доказало свою значимость в качестве диагностического и прогностического признака SARS-Со^2-инфекции [13]. Определение антител против нуклеокапсидного или шиповидного антигена широко используется для подтверждения текущей или перене-

сенной инфекции SARS-CoV-2. Анализ анти^-антител используется также в качестве показателя эффективности вакцинации против COVID-19. Поддержание уровня анти-SARS-CoV-2-антител в течение продолжительного времени свидетельствует о формировании иммунной памяти и иммунной защиты против реинфекции [14]. Уровень серопревалентности является показателем коллективного иммунитета, его определение необходимо для предсказания динамики пандемии.

Существующие методы определения антител против коронавирусных антигенов различаются между собой как по иммунохимическим принципам, на которых они основываются, так и по способу анализа полученных результатов. Рассмотренный нами метод FC выгодно отличается от наиболее распространенного иммуно-ферментного анализа (ELISA) тем, что S-белок представляется в нативной трансмембранной конформации. В этом методе отсутствует стадия наработки и выделения антигена, что упрощает его подготовку и переформатирование. Это особенно важно при тестировании антител против мутантных вариантов S-белка. Для метода FC достаточно только получить плазмиду, кодирующую соответствующий мутантный белок. Все последующие стадии теста проводятся стандартным образом. Таким образом, метод FC очень гибкий, легко адаптируется под новые варианты коронавируса. Это особенно важно в условиях быстрой смены превалирующих мутантных вариантов коронавируса. В своей работе мы одновременно определяли анти^-антитела двух изотипов -IgG и IgM. При использовании вторичных анти-IgA-антител, меченных спектрально неперекрывающимся красителем, например аллофикоцианином, возможно одновременное определение анти^-антител трех изотипов [15].

Наиболее адекватный метод обработки данных по определению антител - регистрация для каждого образца полной или частичной кривой титрования, которая затем аппроксимируется 4-параметрической сигмоидальной кривой [16]. Для дальнейшего анализа используется один из параметров этой кривой. Например, разведение сыворотки, при котором наблюдается перегиб кривой титрования и который соответствует линейному участку зависимости сигнала от разведения сыворотки. Как правило, эта точка соответствует разведению, при котором наблюдается 50 % падение сигнала по сравнению с неразведенной сывороткой (ID50) [10].

Метод аппроксимации позволяет получать наиболее точные результаты, однако с помощью этого метода плохо определяется ID50 низкотитражных сывороток. Альтернативный вариант - определение конечной точки титрования сыворотки (endpoint titer) [17, 18]. За результат измерения принимается наибольшее разведение сыворотки, которое обеспечивает заданное превышение над уровнем фона. Этот метод прост, позволяет сравнивать между собой высоко- и низкотитражные сыворотки. К недостаткам этого подхода можно отнести то, что с его помощью получаются дискретные результаты,

которые впоследствии затруднительно обрабатывать обычными статистическими методами. Наиболее часто используется подход с измерением сигнала при одном, заранее подобранном разведении и определении коэффициента позитивности, который вычисляется как отношение оптической плотности образца к некоторому граничному значению [3, 19]. Этот метод высокопроизводителен, прост в исполнении и дает количественные результаты. Однако некоторые высоко- или низкотит-ражные сыворотки при определении оптической плотности могут попадать в нелинейную область, а полученные результаты будут находиться в области насыщения или, напротив, ниже уровня детекции [20]. Таким образом, выбор разведения, при котором проводятся все измерения, может быть субъективным. Отмеченных трудностей можно избежать, используя подход, который иногда называют методом суммирования или, в более общем виде, методом определения площади под кривой титрования [21].

При анализе данных, полученных методом FC, мы использовали два подхода: с определением MFI при одном разведении сыворотки, а также с вычислением AUC по кривой титрования. Первый параметр является аналогом коэффициента позитивности, который используется в ELISA. Корреляционный анализ показал, что данные ELISA лучше коррелируют с результатами AUC, чем MFI. Преимуществом результатов AUC стало также то, что они распределялись в более широком динамическом диапазоне, чем MFI. Это делает анализ AUC более достоверным, чем MFI. Аналогично данные тестов вирус-нейтрализации pVNA и sVNA лучше коррелировали с результатами AUC, чем MFI. Более низкая корреляция для MFI, вероятно, связана с тем, что низкотитражные сыворотки при выбранном разведении не попадали на линейный участок кривой титрования, а располагались в самой нижней ее части. Использование значений AUC является более адекватным методом анализа данных, полученных методом FC.

Заключение

Таким образом, проточная цитометрия - удобный метод для одновременного определения в сыворотке человека анти^-антител IgG- и IgM-изотипов. В упрощенном варианте метода относительную концентрацию антител можно определять при единственном разведении тестируемой сыворотки путем измерения средней интенсивности флуоресценции (MFI) клеток-мишеней. Более надежные результаты получаются при регистрации кривой титрования и подсчета площади под кривой (AUC). Полученные таким образом результаты хорошо коррелировали с определением антител методом ELISA, а также с данными вирус-нейтрализации pVNA и sVNA.

Благодарность. Авторы выражают благодарность Коробовой В.В. за помощь в сборе образцов крови добровольцев.

■ Литература

1. Venter M., Richter K. Towards effective diagnostic assays for COVID-19: a review. J. Clin. Pathol. 2020; 73: 370-7. DOI: https://doi. org/10.1136/jclinpath-2020-206685

2. Goel R.R., Apostolidis S.A., Painter M.M., Mathew D., Pattekar A., Kuthuru O., Gouma S., Hicks P., Meng W., Rosenfeld A.M., Dysinger S., Lundgreen K.A., Kuri-Cervantes L., Adamski S., Hicks A., Korte S., Old-ridge D.A., Baxter A.E., Giles J.R., Weirick M.E., McAllister C.M., Dougherty J., Long S., D'Andrea K., Hamilton J.T., Betts M.R., Luning Prak E.T., Bates P., Hensley S.E., Greenplate A.R., Wherry E.J. Distinct antibody and memory B cell responses in SARS-CoV-2 naive and recovered individuals following mRNA vaccination. Sci. Immunol. 2021; 6: 1-19. DOI: https:// doi.org/10.1126/sciimmunol.abi6950

3. Андреев И. В., Нечай К.О., Андреев А.И., Зубарева А.П., Есау-ловаД.Р., АленоваА.М., Николаева И. А., Чернявская О.П., Ломоносов К. С., Шульженко А.Е., Курбачева О.М., Латышева Е.А., Шартанова Е.В., Назарова Е.В., Романова Л.В., Черченко Н.Г., Смирнов В.В., Аверков О.В., Мартынов А.И., Вечорко В.И., Гудима Г.О., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р., Хаитов Р.М. Поствакцинальный и постинфекционный гуморальный иммунный ответ на инфекцию SARS-CoV-2. Иммунология. 2022; 43: 18-32. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-1-18-32

4. Liu B., Su X., Yu G., Yang S., Wang F., Huang T., Zhou L., Hui Z., Liao Y., Qiu Y., Huang J., Gao H., Liu J., Zhong Y. An automated chemilu-minescent immunoassay (CLIA) detects SARS-CoV-2 neutralizing antibody levels in COVID-19 patients and vaccinees. Int. J. Infect. Dis. 2022; 115: 116-25. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijid.2021.12.316

5. Assis R., Jain A., Nakajima R., Jasinskas A., Khan S., Palma A., Parker D.M., Chau A., Specimen Collection Group, Obiero J.M., Tifrea D., Leung A., Grabar C., Muqolli F., Khalil G., Escobar J.C., Ventura J., Davies D.H., Albala B., Boden-Albala B., Schubl S., Felgner P.L. Distinct SARS-CoV-2 antibody reactivity patterns elicited by natural infection and mRNA vaccination. NPJ Vaccines 2021; 6 (1): 1-10. DOI: https://doi. org/10.1038/s41541-021-00396-3

6. Emmerich P., von Possel R., Hemmer C.J., Fritzsche C., Geerdes-Fenge H., Menge B., Messing C., Borchardt-Lohölter V., Deschermeier C., Steinhagen K. Longitudinal detection of SARS-CoV-2-specific antibody responses with different serological methods. J. Med. Virol. 2021; 93: 581624. DOI: https://doi.org/10.1002/jmv.27113

7. Grzelak L., Temmam S., Planchais C., Demeret C., Tondeur L., Huon C., Guivel-Benhassine F., Staropoli I., Chazal M., Dufloo J., Planas D., Buchrieser J., Rajah M.M., Robinot R., Porrot F., Albert M., Chen K.Y., Crescenzo-Chaigne B., Donati F., Anna F., Souque P., Gransagne M., Bel-lalou J., Nowakowski M., Backovic M., Bouadma L., Le Fevre L., Le Hingrat Q., Descamps D., Pourbaix A., Laouenan C., Ghosn J., Yazdanpanah Y., Besombes C., Jolly N., Pellerin-Fernandes S., Cheny O., Ungeheuer M.N., Mellon G., Morel P., Rolland S., Rey F.A., Behillil S., Enouf V., Lemaitre A., Creach M.A., Petres S., Escriou N., Charneau P., FontanetA., Hoen B., Bruel T., Eloit M., Mouquet H., Schwartz O., van der Werf S. A comparison of four serological assays for detecting anti-SARS-CoV-2 antibodies in human serum samples from different populations. Sci. Transl. Med. 2020; 12: 3103. DOI: https://doi.org/10.1126/scitranslmed.abc3103

8. Horndler L., Delgado P., Abia D., Balabanov I., Mart Inez-Fleta P., Cornish G., Llamas M.A., Serrano-Villar S., Anchez-Madrid F.S., Fresno M., van Santen H.M., Alarcon B. Flow cytometry multiplexed method for the detection of neutralizing human antibodies to the native SARS-CoV-2 spike protein. EMBO Mol. Med. 2021; 13: e13549. DOI: https://doi.org/10.15252/ emmm.202013549

9. Lapuente D., Maier C., Irrgang P., Hübner J., Peter A.S., Hoffmann M., Ensser A., Ziegler K., Winkler T.H., Birkholz T., Kremer A.E., Steininger P., Korn K., Neipel F., Überla K., Tenbusch M. Rapid response flow cytometric assay for the detection of antibody responses to SARS-CoV-2. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2020; 40: 751-9. DOI: https:// doi.org/10.1007/s10096-020-04072-7

10. Byazrova M.G., Kulemzin S.V., Astakhova E.A., Belovezhets T.N., Efimov G.A., Chikaev A.N., Kolotygin I.O., Gorchakov A.A., Taranin A.V.,

Filatov A.V. Memory B cells induced by Sputnik V vaccination produce SARS-CoV-2 neutralizing antibodies upon ex vivo restimulation. Front. Immunol. 2022; 13: 840707. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.840707

11. Wheatley A.K., Juno J.A., Wang J.J., Selva K.J., Reynaldi A., Tan H-X., Lee W.S., Wragg K.M., Kelly H.G., Esterbauer R., Davis S.K., Kent H.E., Mordant F.L., Schlub T.E., Gordon D.L., Khoury D.S., Subbarao K., Cromer D., Gordon T.P., Chung A.W., Davenport M.P., Kent S.J. Evolution of immune responses to SARS-CoV-2 in mild-moderate COVID-19. Nat. Commun. 2021; 12: 1162. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-021-21444-5

12. Garcia-Beltran W.F., Lam E.C., Astudillo M.G., Yang D., Miller T.E., Feldman J., Hauser B.M., Caradonna T.M., Clayton K.L., Nitido A.D., Murali M.R., Alter G., Charles R.C., Dighe A., Branda J.A., Lennerz J.K., Lingwood D., Schmidt A.G., Iafrate A.J., Balazs A.B. COVID-19-neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 2021; 184: 476-88.e11. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.015

13. Гудима Г.О., Хаитов Р.М., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Молеку-лярно-иммунологические аспекты диагностики, профилактики и лечения коронавирусной инфекции. Иммунология. 2021; 42: 198-210. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-198-210

14. Пащенков М.В., Хаитов М.Р. Иммунный ответ против эпидемических коронавирусов. Иммунология. 2020; 41: 5-18. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2020-41-1-5-18

15. Ferreira-Gomes M., Kruglov A., Durek P., Heinrich F., Tizian C., Heinz G.A., Pascual-Reguant A., Du W., Mothes R., Fan C., Frischbutter S., Habenicht K., Budzinski L., Ninnemann J., Jani P.K., Guerra G.M., Lehmann K., Matz M., Ostendorf L., Heiberger L., Chang H.D., Bauherr S., Maurer M., Schönrich G., Raftery M., Kallinich T., Mall M.A., Angermair S., Treskatsch S., Dörner T., Corman V.M., Diefenbach A., Volk H.D., Elez-kurtaj S., Winkler T.H., Dong J., Hauser A.E., Radbruch H., Witkowski M., Melchers F., Radbruch A., Mashreghi M.F. SARS-CoV-2 in severe COV-ID-19 induces a TGF-ß-dominated chronic immune response that does not target itself. Nat. Commun. 2021; 12: 1-14. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41467-021-22210-3

16. Karpinski K.F., Hayward S., Tryphonas H. Statistical considerations in the quantitation of serum immunoglobulin levels using the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). J. Immunol. Methods. 1987; 103: 189-94. DOI: https://doi.org/10.1016/0022-1759(87)90289-4

17. Frey A., Di Canzio J., Zurakowski D. A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays. J. Immunol. Methods. 1998; 221: 35-41. DOI: https://doi.org/10.1016/S0022-1759(98)00170-7

18. Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Shcheblyakov D.V., Tukhvatulin A.I., Zubkova O.V., Dzharullaeva A.S., Kovyrshina A.V., Lubenets N.L., Grouso-va D.M., Erokhova A.S., Botikov A.G., Izhaeva F.M., Popova O., Ozharovs-kaya T. A., Esmagambetov I.B., Favorskaya I.A., Zrelkin D.I., Voronina D.V., Shcherbinin D.N., Semikhin A.S., Simakova Y.V., Tokarskaya E.A., Egorova D.A., Shmarov M.M., Nikitenko N.A., Gushchin V.A., Smolyar-chuk E.A., Zyryanov S.K., Borisevich S.V., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Safety and efficacy of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine: an interim analysis of a randomised controlled phase 3 trial in Russia. Lancet. 2021; 397: 671-81. DOI: https://doi. org/10.1016/S0140-6736(21)00234-8

19. Закурская В.Я., Сизякина Л.П., Харитонова М.В., Шлык С.В. Динамика специфического гуморального ответа пациентов, перенесших COVID-19. Иммунология. 2022; 43: 71-7. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2022-43-1-71-77

20. Pattinson D., Jester P., Guan L., Yamayoshi S., Chiba S., Presler R., Rao H., Iwatsuki-Horimoto K., Ikeda N., Hagihara M., Uchida T., Mita-mura K., Halfmann P., Neumann G., Kawaoka Y. A novel method to reduce ELISA serial dilution assay workload applied to SARS-CoV-2 and seasonal HCoVs. Viruses. 2022; 14: 562. DOI: https://doi.org/10.3390/v14030562

21. Hartman H., Wang Y., Schroeder H.W., Cui X. Absorbance summation: A novel approach for analyzing high-throughput ELISA data in the absence of a standard. PLoS One. 2018; 13: e0198528. DOI: https://doi. org/10.1371/journal.pone.0198528

■ References

1. Venter M., Richter K. Towards effective diagnostic assays for COVID-19: a review. J. Clin. Pathol. 2020; 73: 370-7. DOI: https://doi. org/10.1136/jclinpath-2020-206685

2. Goel R.R., Apostolidis S.A., Painter M.M., Mathew D., Pattekar A., Kuthuru O., Gouma S., Hicks P., Meng W., Rosenfeld A.M., Dysinger S., Lundgreen K.A., Kuri-Cervantes L., Adamski S., Hicks A., Korte S.,

Oldridge D.A., Baxter A.E., Giles J.R., Weirick M.E., McAllister C.M., Dougherty J., Long S., D'Andrea K., Hamilton J.T., Betts M.R., Luning Prak E.T., Bates P., Hensley S.E., Greenplate A.R., Wherry E.J. Distinct antibody and memory B cell responses in SARS-CoV-2 naive and recovered individuals following mRNA vaccination. Sci. Immunol. 2021; 6: 1-19. DOI: https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abi6950

3. Andreev I.V., Nechay K.O., Andreev A.I., Zubaryova A.P., Esaulova D.R., Alenova A.M., Nikolaeva I.A., Chernyavskaya O.P., Lo-monosov K.S., Shulzhenko A.E., Kurbacheva O.M., Latysheva E.A., Shartanova N.V., Nazarova E.V., Romanova L.V., Cherchenko N.G., Smir-nov V.V., Averkov O.V., Martynov A.I., Vechorko V.I., Gudima G.O., Kud-lay D.A., Khaitov M.R., Khaitov R.M. Post-vaccination and post-infection humoral immune response to the SARS-CoV-2 infection. Immunologiya. 2022; 43 (1): 18-32. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-1-18-32 (in Russian)

4. Liu B., Su X., Yu G., Yang S., Wang F., Huang T., Zhou L., Hui Z., Liao Y., Qiu Y., Huang J., Gao H., Liu J., Zhong Y. An automated chemi-luminescent immunoassay (CLIA) detects SARS-CoV-2 neutralizing antibody levels in COVID-19 patients and vaccinees. Int. J. Infect. Dis. 2022; 115: 116-25. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijid.2021.12.316

5. Assis R., Jain A., Nakajima R., Jasinskas A., Khan S., Palma A., Parker D.M., Chau A., Specimen Collection Group, Obiero J.M., Tifrea D., Leung A., Grabar C., Muqolli F., Khalil G., Escobar J.C., Ventura J., Da-vies D.H., Albala B., Boden-Albala B., Schubl S., Felgner P.L. Distinct SARS-CoV-2 antibody reactivity patterns elicited by natural infection and mRNA vaccination. NPJ Vaccines 2021; 6 (1): 1-10. DOI: https://doi. org/10.1038/s41541-021-00396-3

6. Emmerich P., von Possel R., Hemmer C.J., Fritzsche C., Geerdes-Fenge H., Menge B., Messing C., Borchardt-Lohölter V., Deschermeier C., Steinhagen K. Longitudinal detection of SARS-CoV-2-specific antibody responses with different serological methods. J. Med. Virol. 2021; 93: 5816-24. DOI: https://doi.org/10.1002/jmv.27113

7. Grzelak L., Temmam S., Planchais C., Demeret C., Tondeur L., Huon C., Guivel-Benhassine F., Staropoli I., Chazal M., Dufloo J., Planas D., Buchrieser J., Rajah M.M., Robinot R., Porrot F., Albert M., Chen K.Y., Crescenzo-Chaigne B., Donati F., Anna F., Souque P., Gransagne M., Bellalou J., Nowakowski M., Backovic M., Bouadma L., Le Fevre L., Le Hingrat Q., Descamps D., Pourbaix A., Laouenan C., Ghosn J., Yaz-danpanah Y., Besombes C., Jolly N., Pellerin-Fernandes S., Cheny O., Ungeheuer M.N., Mellon G., Morel P., Rolland S., Rey F.A., Behillil S., Enouf V., Lemaitre A., Creach M.A., Petres S., Escriou N., Charneau P., Fontanet A., Hoen B., Bruel T., Eloit M., Mouquet H., Schwartz O., van der Werf S. A comparison of four serological assays for detecting anti-SARS-CoV-2 antibodies in human serum samples from different populations. Sci. Transl. Med. 2020; 12: 3103. DOI: https://doi.org/10.1126/ scitranslmed.abc3103

8. Horndler L., Delgado P., Abia D., Balabanov I., Mart Inez-Fleta P., Cornish G., Llamas M.A., Serrano-Villar S.,Anchez-Madrid F.S., Fresno M., van Santen H.M., Alarcon B. Flow cytometry multiplexed method for the detection of neutralizing human antibodies to the native SARS-CoV-2 spike protein. EMBO Mol. Med. 2021; 13: e13549. DOI: https://doi. org/10.15252/emmm.202013549

9. Lapuente D., Maier C., Irrgang P., Hübner J., Peter A.S., Hoffmann M., Ensser A., Ziegler K., Winkler T.H., Birkholz T., Kremer A.E., Steininger P., Korn K., Neipel F., Überla K., Tenbusch M. Rapid response flow cytometric assay for the detection of antibody responses to SARS-CoV-2. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2020; 40: 751-9. DOI: https:// doi.org/10.1007/s10096-020-04072-7

10. Byazrova M.G., Kulemzin S.V., Astakhova E.A., Belovezhets T.N., Efimov G.A., Chikaev A.N., Kolotygin I.O., Gorchakov A.A., Taranin A.V., Filatov A.V. Memory B cells induced by Sputnik V vaccination produce SARS-CoV-2 neutralizing antibodies upon ex vivo restimulation. Front. Immunol. 2022; 13: 840707. DOI: https://doi.org/10.3389/fim-mu.2022.840707

11. Wheatley A.K., Juno J. A., Wang J. J., Selva K.J., Reynaldi A., Tan H-X., Lee W.S., Wragg K.M., Kelly H.G., Esterbauer R., Davis S.K.,

Сведения об авторах

Астахова Екатерина Андреевна - мл. науч. сотр. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии»

Kent H.E., Mordant F.L., Schlub T.E., Gordon D.L., Khoury D.S., Sub-barao K., Cromer D., Gordon T.P., Chung A.W., Davenport M.P., Kent S.J. Evolution of immune responses to SARS-CoV-2 in mild-moderate CO-VID-19. Nat. Commun. 2021; 12: 1162. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41467-021-21444-5

12. Garcia-Beltran W.F., Lam E.C.,Astudillo M.G.,Yang D., MillerT.E., Feldman J., Hauser B.M., Caradonna T.M., Clayton K.L., Nitido A.D., Murali M.R., Alter G., Charles R.C., Dighe A., Branda J.A., Lennerz J.K., Lingwood D., Schmidt A.G., Iafrate A.J., Balazs A.B. Pattinson D., Jester P., Guan L., Yamayoshi S., Chiba S., Presler R., Rao H., Iwatsuki-Horim-oto K., Ikeda N., Hagihara M., Uchida T., Mitamura K., Halfmann P., Neumann G., Kawaoka Y. COVID-19-neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 2021; 184: 476-88.e11. DOI: https://doi. org/10.1016/j.cell.2020.12.015

13. Gudima G.O., Khaitov R.M., Kudlay D.A., Khaitov M.R. Molecular immunological aspects of diagnostics, prevention and treatment of coronavirus infection. Immunologiya. 2021; 42 (3): 198-210. DOI: https:// doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-198-210 (in Russian)

14. Pashchenkov M.V., Khaitov M.R. Immune response against epidemic coronaviruses. Immunologiya. 2020; 41 (1): 5-18. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2020-41-1-5-18 (in Russian)

15. Ferreira-Gomes M., Kruglov A., Durek P., Heinrich F., Tizian C., Heinz G.A., Pascual-Reguant A., Du W., Mothes R., Fan C., Frischbutter S., Habenicht K., Budzinski L., Ninnemann J., Jani P.K., Guerra G.M., Lehmann K., Matz M., Ostendorf L., Heiberger L., Chang H.D., Bauherr S., Maurer M., Schönrich G., Raftery M., Kallinich T., Mall M.A., Angermair S., Treskatsch S., Dörner T., Corman V.M., Diefenbach A., Volk H.D., Elez-kurtaj S., Winkler T.H., Dong J., Hauser A.E., Radbruch H., Witkowski M., Melchers F., Radbruch A., Mashreghi M.F. SARS-CoV-2 in severe COVID-19 induces a TGF-ß-dominated chronic immune response that does not target itself. Nat. Commun. 2021; 12: 1-14. DOI: https://doi. org/10.1038/s41467-021-22210-3

16. Karpinski K.F., Hayward S., Tryphonas H. Statistical considerations in the quantitation of serum immunoglobulin levels using the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). J. Immunol. Methods. 1987; 103: 189-94. DOI: https://doi.org/10.1016/0022-1759(87)9 0289-4

17. Frey A., Di Canzio J., Zurakowski D. A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays. J. Immunol. Methods. 1998; 221: 35-41. DOI: https://doi.org/10.1016/S0022-1759(98)00170-7

18. Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Shcheblyakov D.V., Tukhva-tulin A.I., Zubkova O.V., Dzharullaeva A.S., Kovyrshina A.V., Lubenets N.L., Grousova D.M., Erokhova A.S., Botikov A.G., Izhaeva F.M., Popova O., Ozharovskaya T.A., Esmagambetov I.B., Favorskaya I.A., Zrelkin D.I., Voronina D.V., Shcherbinin D.N., Semikhin A.S., Simakova Y.V., Tokars-kaya E.A., Egorova D.A., Shmarov M.M., Nikitenko N.A., Gushchin V.A., Smolyarchuk E.A., Zyryanov S.K., Borisevich S.V., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Safety and efficacy of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine: an interim analysis of a randomised controlled phase 3 trial in Russia. Lancet. 2021; 397: 671-81. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(21)00234-8

19. Zakurskaya V.Ya., Sizyakina L.P., Kharitonova M.V., Shlyk S.V. Dynamics of specifi c humoral response in COVID-19 patients. Immunologiya. 2022; 43 (1): 71-7. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-1-71-77 (in Russian)

20. Pattinson D., Jester P., Guan L.,Yamayoshi S., Chiba S., Presler R., Rao H., Iwatsuki-Horimoto K., Ikeda N., Hagihara M., Uchida T., Mi-tamura K., Halfmann P., Neumann G., Kawaoka Y. A novel method to reduce ELISA serial dilution assay workload applied to SARS-CoV-2 and seasonal HCoVs. Viruses. 2022; 14: 562. DOI: https://doi.org/10.3390/ v14030562

21. Hartman H., Wang Y., Schroeder H.W., Cui X. Absorbance summation: A novel approach for analyzing high-throughput ELISA data in the absence of a standard. PLoS One. 2018; 13: e0198528. DOI: https://doi. org/10.1371/journal.pone.0198528

Authors' information

Ekaterina A. Astakhova - Junior Researcher of the Im-munochemistry Lab., NRC Institute of Immunology FMBA

ФМБА России; аспирант каф. иммунологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4737-5892

Бязрова Мария Георгиевна - мл. науч. сотр. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; аспирант кафедры иммунологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова; ассистент кафедры иммунологии ФГАОУ ВО РУДН Миноб-рнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9858-7596

Миляев Савелий Михайлович - лаборант лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3148-3346

Сухова Мария Михайловна - лаборант лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; студент кафедры иммунологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация

E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4572-1878

Михайлов Артем Андреевич - лаборант лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; студент кафедры иммунологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация

E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8356-8077

Морозов Алексей Александрович - лаборант лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; студент каф. иммунологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация e-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-1082-1158

Прилипов Алексей Геннадьевич - д-р биол. наук, зав. лаб. молекулярной генетики ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-8755-1419

Филатов Александр Васильевич - д-р биол. наук, проф., зав. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. иммунологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427

of Russia; PhD Student of Immunology Chair of Biology Faculty, M.V. Lomonosov MSU, Moscow, Russian Federation

E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4737-5892

Maria G. Byazrova - Junior Researcher of the Immu-nochemistry Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation; PhD Student of Immunology Chair of Biology Faculty, M.V. Lomono-sov MSU; Assistant of RUDN University, MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9858-7596

Saveliy M. Milyaev - Technician at the Immunochemistry Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3148-3346

Maria M. Sukhova - Technician at the Laboratory of Im-munochemistry, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia; Student Immunology Chair of Biology Faculty, M.V. Lomonosov MSU, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4572-1878

Artem A. Mikhailov - Technician at the Immunochemis-try Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia; Student of Immunology Chair of Biology Faculty, M.V. Lo-monosov MSU, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8356-8077

Aleksei A. Morozov - Technician at the Immunoche-mistry Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia; Student of Immunology Chair of Biology Faculty, M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-1082-1158

Alexei G. Prilipov - Dr.Sci., PhD, Head of the Molecular Genetics Lab., N.F. Gamaleya FRCEM, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-8755-1419

Alexander V. Filatov - Dr.Sci., PhD, Prof., Head of the Im-munochemistry Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia; Prof. of Immunology Chair of Biology Faculty, M.V Lomonosov MSU, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6460-9427