CC BY
102
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТА ТЬИ ЛИПОСОМАЛЬНАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА... 105
УДК 616-006.04-092.4:615.831:577.352.2 Чан Тхи Хай Иен1, В.И. Поздеев2, Г.А. Меерович3, С.Ш. Каршиева2, Л.М. Борисова2,
О.Л. Орлова2, А.П. Полозкова2, Г.В.Раменская1, Н.А. Оборотова2
ЛИПОСОМАЛЬНАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА ФОТОДИТАЗИНА
1ММА им. И.М. Сеченова, Москва
2РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва
3Институт общей физики им. А.М.Прохорова РАН, Москва
Контактная информация:
Чан Тхи Хай Иен, аспирантка кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета
адрес: 119991, Москва, Трубецкая ул., д. 8, стр.2; тел.: +7(965)332-82-57 e-mail: tran [email protected]
Статья поступила: 12.03.2010, принята к печати 01.04.2010.
Резюме
Фотосенсибилизатор второго поколения фотодитазин на основе производного хлорина е6 активно изучается в последнее время для фотодинамической терапии поверхностных и внутриполостных новообразований. Целью данной работы является получение пегилированной липосомальной лекарственной формы фотодитазина. Включение фотодитазина в свежеприготовленные липосомы составило 92,1±0,9%, диаметр везикул - 178±10 нм. Применение фотодитазина в виде полученной липосомальной дисперсии по сравнению с водным раствором позволяет повысить на 15-20% селективность накопления препарата в опухоли по сравнению с нормальной тканью и существенно замедлить рост опухоли Эрлиха.
Ключевые слова: фотодитазин, липосомы, фотодинамическая терапия, опухоль Эрлиха.
Tran Thi Hai Yen1, V.I. Pozdeev2, G.A. Meerovich3, S.Sh. Karshieva2, L.M. Borisova2,
O.L. Orlova2, A.P. Polozkova2, G.V. Ramenskaya1, N.A. Oborotova2
CHLORIN DERIVATIVES IN CANCER PHOTODYNAMIC THERAPY
'I.M. Sechenov Moscow Medical Academy
2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
3A.M. Prokhorov General Physics Institute of RAS, Moscow
Abstract
Photoditazine, the derivative of chlorine e6, belong to second generation of photosensitizers. At present this drug is under active examination to treat superficial and intracavitary malignant tumors. The aim of this study was to prepare pegi-lated liposomal form of photoditazine. The inclusion of photoditazine into fresh prepared liposomes was 92,1±0,9 %, the vesicle diametr was 178±10 nm. Such liposomal dispersion of photoditazine increased the selective accumulation of drug in tumor about 15-20 % in compare to normal tissue and significantly reduced the Ehrlich’s tumor.
Key words: Photoditazine, liposomes, photodynamic therapy, Ehrlich’s tumor.
Введение
Фотосенсибилизатор второго поколения фотодитазин на основе водного раствора ди-Ы-метил-глюкаминовой соли хлорина е6 активно изучается в последнее время для ФДТ поверхностных и внутриполостных новообразований [5]. Фотодитазин быстро [3] накапливается в опухоли (максимум накопления наступает через 2-3 ч) и быстро выводится из организма (98 % препарата - через двое суток [4]). Недостатком фотодитазина является его нестабильность при длительном хранении в водном растворе. В этих условиях наблюдается снижение растворимости препарата, а также частичное химическое разрушение молекул фотодинамически активной субстанции, что сопровождается снижением квантового выхода, а, следовательно, снижением цитотоксического действия.
Одним из возможных путей решения проблемы является создание липосомальной формы препарата (можно лиофилизировать и хранить при пониженной температуре). Однако предложенный Ю.А. Белым и др. [1] способ создания липосомальной формы производных хлорина е6 позволил получить непегилированные липосомы с низким включением
фотодинамически активной субстанции во внутри-липосомальный объем. Из-за необходимости отделения липосом от невключившегося препарата методом колоночной хроматографии была получена сильно разбавленная липосомальная дисперсия, которую нужно было концентрировать перед использованием. Кроме того, липосомы в виде водной дисперсии подвергаются гидролизу и физическим изменениям в процессе хранения, включая частичный выход фотодитазина из внутрилипосомального объема в супернатант, а также изменение размеров в результате агрегации или слияния.
Задача исследования
Получение новой липосомальной лекарственной формы фотодитазина, которая позволила бы обеспечить:
— увеличение селективности накопления препарата в опухолевой ткани по сравнению с нормальной;
— повышение эффективности ФДТ при использовании фотодитазина;
— улучшение стабильности препарата при хранении.
Материалы и методы
Получение липосом с фотодитазином Липосомы с фотодитазином получали методом Bangham [7]. *Растворяли в 20 мл хлороформа в круглодонной колбе вместимостью 2 л. Органический растворитель упаривали на роторном испарителе под вакуумом при 37 °С до образования липидной пленки. Пленку сушили при 37 °С под вакуумом в течение 2 ч.
Далее липидную пленку гидратировали раствором фотодитазина при 37 °С и постоянном перемешивании. Образовавшуюся дисперсию мультила-меллярных везикул экструдировали через поликар-бонатные фильтры Whatman (Великобритания) с размером пор 20о нм с помощью ручного миниэкструдера Avanti Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Inc., США).
К полученным липосомам с фотодитазином прибавляли раствор криопротектора и дополнительные средства, способствующие удержанию препарата во внутрилипосомальном объеме. Для стабилизации липосом с фотодитазином проводили сублимационную сушку [2].
Анализ среднего диаметра везикул проводили с помощью фотонного корреляционного анализатора Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems, США).
Содержание фотодитазина в липосомальной лекарственной форме определяли методом спектро-фотометрии с использованием рабочего стандартного образца (РСО) при X 662 нм.
Изучение селективности накопления липосомальной дисперсии фотодитазина в опухоли Эрлиха мышей Для изучения фармакокинетики фотодитазина in vivo опухоль Эрлиха перевивали взвесью клеток внутримышечно в голень правой задней лапы мышам Fi. Мышей делили на 2 группы (n=3). Фармакокинетические исследования проводили на 4-5 сут после трансплантации опухоли.
Мыши первой группы получала фотодитазин в/в по 5 мг/кг в липосомальной форме, а мыши второй
- в тех же дозе и режиме введения только в водном растворе. Для оценки селективности накопления фотосенсибилизатора применяли спектрально-флуоресцентный метод с использованием волоконного спектроанализатора «ЛЭСА-01-Биоспек» и He-Ne лазера (Биоспек, Россия).
Измерения интенсивности флуоресценции при возбуждении He-Ne лазером проводили в нескольких точках опухоли, полученные данные усредняли.
Аналогично оценивали интенсивность флуоресценции нормальной ткани в контралатеральной зоне левой лапы.
Индекс селективности накопления фотосенсибилизатора оценивали как соотношение средней интенсивности его флуоресценции в опухоли и нормальной ткани (в предположении, что интенсивность флуоресценции фотосенсибилизатора в ткани пропорциональна его содержанию в ней).
Данные по индексу накопления усредняли по каждой группе животных. Проводя такие измерения в различные моменты времени, получили кривую динамики индекса накопления фотодитазина при введении в обеих формах.
Изучение эффективности
ФДТлипосомальной дисперсии
фотодитазина на опухоли Эрлиха мышей
Сравнительные исследования терапевтической эффективности полученной липосомальной дисперсии и водного раствора фотодитазина проводили in vivo на 3 группах мышей Balb/c (n=7), в качестве контроля (группа 3) были использованы интактные мыши. Опухоль Эрлиха (ELD) перевивали внутримышечно в голень правой задней лапы по 0,1 мл взвеси, содержащей 5*105 клеток.
Лечение мышей начинали на 6 сут после трансплантации опухоли, когда средний объем опухолей в группах не превышал 530 мм3.
Мышам первой группы за 4,5 ч до облучения вводили внутривенно липосомальную дисперсию фотодитазина в дозе 5 мг/кг массы тела животного, мышам второй группы - водный раствор фотодитазина в той же дозе. При ФДТ опухоли облучали с помощью лазера «ЛФД-01/670-Биоспек» (Биоспек, Россия) с X 671 нм и плотностью мощности до 260 мВт/см2 в течение 20 мин.
Оценку эффективности ФДТ оценивали по торможению роста опухоли (ТРО %) в разные сроки наблюдения. Торможение роста опухоли рассчитывали по формуле:
(Vk - Vo)
TPO,% = ^—:--------- X100, где
Vk
Ук - средний объем опухоли в контрольной группе (мм3),
Уо - средний объем в опытной группе (мм3).
Полученные данные обрабатывали статистически с помощью доверительного интервала по методу Фишера - Стьюдента. Различия считались статистически достоверными при p<0,05. Результаты приведены в таблице.
Результаты и обсуждение
Включение фотодитазина в свежеприготовленные липосомы составило 92,1±0,9 %, диаметр везикул - 178±10 нм.
После сублимационной сушки липосом и их последующей регидратации деионизированной водой включение фотодитазина незначительно изменилось (86,5±0,8 %), частицы укрупнились до 186±8нм. Такие размеры пегилированных липосом вполне приемлемы для их продолжительной циркуляции в кровотоке [6].
Результаты биологических исследований показывают, что введение фотодитазина в виде полученной липосомальной дисперсии по сравнению с водным раствором позволяет повысить на 15-20 % селективность накопления в опухоли по сравнению с нормальной тканью (рис. 1).
Рост ELD после ФДТ существенно замедляется (рис. 2), что свидетельствует о высокой фото-динамической эффективности этой липосомальной дисперсии. В группе с водным раствором фотоди-тазина значимый эффект достигается только к концу наблюдения, ТРО=57 % (p<0,05), в то время как липосомальный фотодитазин вызывает значимое торможение роста опухоли уже на 8 сут после лечения (ТРО=58 %, p<0,05) и достигает максимальной величины к 23 сут, ТРО=86 % (p<0,05).
*Яичный фосфатидилхолин : холестерин :
1,2-дистеароил-глицеро-3-фосфоэтаноламин-^[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] амонниевая соль (dSPe-PEG-2000) (300:100:10 дмоль)
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТА ТЬИ ЛИПОСОМАЛЬНАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА... 107
Таблица
Эффективность ФДТ с использованием фотодитазина на мышах с ELD____________________________________
ТРО %
Г руппы Доза, путь введения на сутки после облучения
4 8 11 15 18 23
Фотодитазин раствор 5 мг/кг в/в 27 48 39 44 48 57
Фотодитазин липосомальный 5 мг/кг в/в 36 58 61 76 83 86
4
3.5 •
3 •
5 1 2.5 • со Е 9 Z % ВС і ^
0.5 •
4,5 24 время, часы 216
Рис. 1. Индекс накопления фотодитазина в ELD по Рис. 2. Динамика роста ELD после ФДТ при внутри-
сравнению с нормальной тканью при введении в венном введении фотодитазина в дозе 5 мг/кг:
дозе 5 мг/кг массы при внутривенном введении: 1 - в виде полученной липосомальной дисперсии;
1 - в виде полученной липосомальной дисперсии; 2 - в виде водного раствора;
2 - в виде водного раствора. анат алек 3 - контрольная группа.
Лиофилизированная липосомальная форма фотодитазина может храниться при пониженной температуре, сохраняя ее противоопухолевую активность в течение длительного времени. В настоящее время исследования продолжаются, данные о стабильности препарата при хранении будут опубликованы после их завершения.
Выводы
1. Получена липосомальная дисперсия фотодитазина с размером частиц не более 180 нм с включением препарата в везикулы не менее 92 %.
2. Селективность накопления фотодитазина в опухоли по сравнению с нормальной тканью при использовании липосомальной дисперсии повысилась на 15-20 % по сравнению с водным раствором фото-дитазина.
3. Наблюдали высокую эффективность фотодинамической терапии липосомальным фотодитазином на опухоль Эрлиха в терапевтической дозе 5 мг/мл (ТРО = 86 %).
Литература
1. Белый Ю.А., Терещенко А.В., Володин П.Л. и др. Способ фотодинамической терапии и электрохимической деструкции меланомы хориоидеи. Патент РФ № 2303964 от 10 августа 2007 г.
2. Грегориадис Г., Зади Б., Джайасекера П.Н. Способ получения липосом. Патент РФ № 2216316 от 16 июня 1999 г.
3. Загайнова Е.В., Ширманова М.В., Сироткина М.А.и др. Мониторинг накопления фотосенсибилизаторов в опухоли методом диффузионной и флуоресцентной томографии // Российский биотерапев-тический журнал. - 2008. - Т. 7, № 4. - С. 30-5.
4. Пономарев Г.В., Тавровский Л.Д., Зарецкий А.М. и др. Фотосенсибилизатор и способ его получения. -Патент РФ №2276976 от 27 мая 2006 г.
5. Фотодитазин. http://www.fotoditazin.ru (дата обращения: 5.03.2010).
6. Awasthi V.D., Garcia D., Goins B.A., Phillips W.T. Circulation and biodistribution profiles of long-circulating PEG-liposomes of various sizes in rabbits // Int J Pharm. - 2003. - 253(1-2). - P. 121-32.
7. Bangham A.D., Standish M.M., watkins J.C. Diffusion of Univalent Ions across the lamellae of Swollen Phospholipids // J. Mol. Biol. - 1965. - 13. - P. 238-52.
