Исследование уровня и селективности накопления липосомальной формы фотосенсибилизатора тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия на опухолевых моделях мышей при разных способах перевивки Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Оригинальные статьи

ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ И СЕЛЕКТИВНОСТИ НАКОПЛЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНОй ФОРМЫ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА ТЕТРА-3-ФЕНИЛТИОФТАЛОЦИАНИНА ГИДРОКСИАЛЮМИНИЯ НА ОПУХОЛЕВЫХ МОДЕЛЯХ МЫШЕЙ ПРИ РАЗНЫХ СПОСОБАХ ПЕРЕВИВКИ

Г.А. Меерович1, 2, Л.М. Борисова3, А.П. Будько3, М.П. Киселева2, Л.Л. Николаева2, 5, И.Г. Меерович4, A.B. Ланцова3, С.В. Чернова5, Н.А. Оборотова3, 5

1ФГБУН«Институт общей физики им. А.М. Прохорова» РАН; Россия, 119991 Москва, ул. Вавилова, 38; 2Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ»; Россия, 115409 Москва, Каширское ш., 31; 3ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское ш., 24; 4ФИЦбиотехнологии РАН; Россия, 119071 Москва, Ленинский проспект, 33, стр. 2; 5ФГАОУВО «Первый МГМУим. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)» Минздрава России; Россия, 119991 Москва, ул. Трубецкая, 8, стр. 2

Введение. Настоящая работа посвящена исследованию уровня и селективности накопления в опухоли инфракрасного фотосенсибилизатора (ФС) тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия в липосомальной лекарственной форме по отношению к нормальным тканям.

Цель исследования — изучение уровня и селективности накопления ФС на опухолевых моделях мышей при внутримышечной и подкожной перевивке с целью выбора оптимального способа перевивки и сроков начала проведения фотодинамической терапии. Материалы и методы. В работе использовали перевиваемые опухоли мышей: солидные варианты карциномы Эрлиха (ELD) и саркомы S-37, эпидермоидную карциному легкого Льюис (Lewis lung carcinoma, LLC) и аденокарциному толстой кишки (АКАТОЛ). Исследование провели на половозрелых иммунокомпетентных мышах-гибридах (СВА х C57Bl/6)F1, (C57BI/6 х DBA/2)F1 и мышах линий С57В1/6 и BALB/c. Для оценки уровня липосомальной лекарственной формы ФС в тканях применяли спектрально-флуоресцентный метод. Результаты. Карциному Эрлиха (ELD) для обеспечения высокого накопления ФС целесообразно перевивать внутримышечно. Через 5 ч после введения концентрация ФС в опухоли составляет более 7мг/кг, индекс селективности накопления в опухоли, по сравнению с нормальной тканью, равен 3. На саркоме S-37при подкожной перевивке высокая концентрация ФС в ткани опухоли наблюдается через 5ч после введения и составляет 5,4мг/кг, индекс селективности накопления достигает 4,3. LLC целесообразно перевивать внутримышечно. Через 5 ч после введения концентрация ФС в опухоли составляет более 7,5мг/кг, индекс селективности накопления превышает 4. На АКАТОЛ при внутримышечной перевивке через 7 ч после введения концентрация ФС в опухоли составляет 6,8 мг/кг, индекс селективности накопления — около 2.

Выводы. Липосомальная лекарственная форма ФС при внутривенном введении селективно накапливается в ткани опухоли. Полученные экспериментальные данные позволяют рекомендовать способ перевивки представленных опухолевых моделей мышей при исследованиях ФС.

Ключевые слова: фотосенсибилизатор, опухоль, накопление, селективность

DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-4-74-79

STUDY OF LEVEL AND SELECTIVITY OF LIPOSOMAL FORM OF PHOTOSENSITISER HYDROXYALUMINIUM TETRA-3-PHENYLTHIOPHTHALOCYANINE ACCUMULATION ON TRANSPLANTABLE MICE TUMOR MODELS

AT DIFFERENT WAYS OF TRANSPLANTATION

G.A. Meerovich1,2, L. M. Borisova3, A. P. Bud'ko3, M. P. Kiseleva2, L. L. Nikolaeva2,5, I. G. Meerovich4, A. V Lantsova3, S. V Chernova5, N.A. Oborotova3, 5

1Prokhorov General Physics Institute, RAS; 38 Vavilova St., Moscow 119991, Russia;

2National Research Nuclear University "MEPhl", 31 Kashirskoe Sh., Moscow 15409, Russia;

3N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology; 24 Kashirskoe Sh., Moscow 115478, Russia;

4Research Center of Biotechnology RAS; 33 Bldg. 2 Leninskiy Ave, Moscow 119071, Russia;

5I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Ministry of Health of Russia; 8Bldg. 2 Trubetskaya St., 119991 Moscow, Russia

Контакты: Геннадий Александрович Меерович [email protected]

Оригинальные статьи

75

Background. Current work is devoted to the study in vivo of concentration and selectivity of accumulation of infrared photosensiti-zer (PS) hydroxyaluminium tetra-3-phenylthiophthalocyanine in liposomal form in intramuscularly and subcutaneously transplanted mice tumor models in comparison to normal tissues.

Objective: to study the level and selectivity of accumulation of hydroxyaluminium tetra-3-phenylthiophthalocyanine liposomal form on mice tumor models in order to optimize the transplantation approach and the starting of photodynamic treatment. Materials and methods. A range of transplantable mice tumors was used in the study: solid carcinoma Ehrlich (ELD) and solid sarcoma S-37, epidermoid Lewis lung carcinoma (LLC) and colon adenocarcinoma (AKATOL). For the assessment of concentration of PS in tissues was evaluated by fluorescence spectroscopy in vivo.

Results. The optimum transplantation approaches were shown to be as follows. Solid carcinoma Ehrlich (ELD) provided the highest accumulation of PS when transplanted intramuscularly. Five hours after administration concentration of PS in tumor achieves more than 7 mg/kg, with selectivity in comparison to normal tissue 3 : 1. The maximum concentration of PS in sarcoma S-37 was observed with subcutaneous transplantation, achieving at 5 h after administration the value of 5.4 mg/kg with selectivity of accumulation 4.3: 1. Both LLC and AKATOL showed optimum results with intramuscular transplantation. Maximum concentration of PS in LLC was observed 5 h after administration, achieving 7.5 mg/kg with selectivity exceeding 4. Concentration of photosensitizer in AKATOL 7h post administration achieved 6.8 mg/kg with selectivity about 2.

Conclusions. Liposomal form of PS with intravenous administration selectively accumulates in tumors. The obtained experimental data allows to recommend the method of listed tumors models transplantation for the studies of PS.

Key words: photosensitizer, tumor, accumulation, selectivity

Введение

Липосомальные лекарственные формы (ЛЛФ) фотосенсибилизаторов (ФС) позволяют использовать новые эффективные гидрофобные и гидрофильные субстанции, повысить селективность накопления ФС в опухоли и эффективность фотодинамической терапии (ФДТ), уменьшить побочные эффекты (фототоксичность) за счет понижения терапевтической дозы [1].

Объектом настоящей работы является ЛЛФ ФС на основе тетра-3-фенилтиофталоцианина гидрок-сиалюминия со спектральным максимумом поглощения при длине волны 717 нм [2].

Избирательность противоопухолевого действия при ФДТ обусловлена селективностью накопления ФС в опухоли по сравнению с окружающими тканями и направленным лазерным облучением патологической зоны. ФДТ характеризуется многофакторным влиянием на компартменты опухоли. Фотодинамическое воздействие на опухоль является комплексным вследствие интеграции множественных противоопухолевых ответов. В ряде исследований [3—5] показано, что фотодинамическое воздействие может оказывать как прямое (непосредственное) воздействие на клетки опухоли, вызывая их некроз и апоптоз, так и опосредованное, приводя к нарушению кровотока в сосудах и капиллярах опухоли и вызывая их тромбоз или приводя к геморрагиям. Доминирование того или иного механизма действия связано со свойствами ФС и в значительной мере зависит от режима облучения и временного интервала между внутривенным (в/в) введением ФС и началом облучения. Продолжительность временного интервала между введением ФС и облучением при ФДТ влияет на целый ряд процессов накопления ФС в патологическом очаге, влияние

которых разнонаправленно связано с эффективностью ФДТ. Значительная часть ФС при увеличении этого интервала захватывается органами, богатыми клетками системы мононуклеарных фагоцитов, и/или выводится из организма. С другой стороны, посредством экстравазации через дефектные сосуды происходит накопление в опухоли загруженного в ли-посомы ФС, длительно циркулирующего в крови. Таким образом, продолжительность временного интервала между введением ФС и началом проведения облучения влияет на проникновение липосом с ФС в клетки опухоли за счет эндоцитоза и, соответственно, на эффективность ФДТ. Это делает актуальным научно обоснованный выбор оптимального интервала времени между введением ФС и началом облучения, при котором терапевтическая эффективность ФДТ будет максимальной.

Цель настоящего исследования — изучение на перевиваемых опухолях мышей динамики и селективности накопления ЛЛФ ФС в опухоли по отношению к нормальным тканям для оптимального выбора способа перевивки и сроков начала проведения ФДТ.

Материалы и методы

Лиофилизат ЛЛФ ФС, содержащий 1,5 мг тет-ра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия во флаконе, редиспергировали водой для инъекций в объеме 5,8 мл на флакон, при этом концентрация ФС в дисперсии составила 0,25 мг/мл. После реги-дратации лиофилизата образовалась дисперсия ли-посом с размером частиц около 180 нм [6, 7], которую вводили мышам однократно струйно в хвостовую вену в дозе 6 мг/кг массы тела мышей на 6-е сутки после перевивки опухолей.

76 Оригинальные статьи

Исследование проводили на половозрелых им- Оценку уровня и селективности накопления мунокомпетентных мышах-гибридах (СВА х ФС в опухоли по сравнению с нормальной тка-C57Bl/6)F1, (C57B1/ 6 х DBA/2)F1 и мышах линий нью осуществляли спектрально-флуоресцентным С57В1/6 и BALB/c с массой тела 20—22 г из разве- методом с использованием спектроанализатора дения ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» ЛЭСА-01-Биоспек («Биоспек», Россия). Перед Минздрава России. Животных содержали на брике- исследованием у всех животных был удален шерст-тированном корме, с постоянным доступом к воде. ный покров с кожи над опухолью и, соответствен-Все эксперименты осуществляли согласно этиче- но, с контралатерального опухоли участка нор-ским аспектам проведения исследований на биомо- мальной ткани. Флуоресценцию тканей вызывали делях и лабораторных животных, принятым в ФГБУ с помощью лазерного излучения с длиной волны «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава 632,8 нм и регистрировали в спектральном диапа-России [8]. зоне волн 700—760 нм. С целью достижения досто-Для исследования использовали перевиваемые верных результатов при регистрации флуоресцен-опухоли мышей: солидные варианты карциномы ции проводили по 3—6 точечных измерений Эрлиха (ELD) и саркомы S-37, эпидермоидную кар- на опухоли и нормальной ткани. Полученную циному легкого Льюис (Lewis lung carcinoma, LLC) спектральную информацию обрабатывали с ис-и аденокарциному толстой кишки (АКАТОЛ). пользованием программного обеспечения UnoMo-В связи с тем, что выбранные эксперименталь- mento («Биоспек», Россия) и вычисляли индекс ные опухолевые модели в соответствии с их морфо- флуоресценции — величину, полученную при деле-логическим происхождением различаются по специ- нии (нормировке) интегральной интенсивности фике роста и степени васкуляризации, для каждой флуоресцентной полосы (спектральный диапазон модели использовали 2 способа перевивки: подкож- интегрирования 700—760 нм) на мощность возбуж-но (п/к) и внутримышечно (в/м). дающего флуоресценцию лазерного излучения. Карциному Эрлиха (ELD) и саркому S-37 переви- Для количественной оценки концентрации ФС вали мышам в правую голень в/м по 0,1 мл и п/к в тканях проводили калибровку спектроанализатора по 0,05 мл асцитной жидкости, содержащей 106 опухо- с использованием моделирующих фантомов — вод-левых клеток при разведении в среде 199. Исследова- ных дисперсий с разными концентрациями ЛЛФ ние и поддержание штамма проводили на самках ФС, содержащих 1,5 % масс Липофундина мышей-гибридов (СВА х С57В1/6^1 и (C57B1/6 х МСТ /ЛСТ (Lipofundin MCT / LCT). Оптические DBA/2)F1 соответственно. Штаммы поддерживали свойства таких дисперсий достаточно близки к оп-внутрибрюшинной перевивкой асцитной жидкости тическим свойствам биоткани, что позволяет повы-по 0,3 мл в разведении 1 : 10 средой 199. сить точность калибровки [10]. LLC для исследования перевивали самцам мы- Селективность накопления ФС оценивали по со-шей-гибридов (C57B1/6 х DBA/2)F1. Штамм поддер- отношению между концентрацией ФС в опухоли живали в/м перевивкой опухолевого материала в бе- и в нормальной ткани [11]. дро на мышах-самцах линии С57В1/6. АКАТОЛ перевивали в область голени самкам Результаты и обсуждение мышей линии BALB/c. Штамм поддерживали путем Анализ зависимости индекса флуоресценции п/к перевивки опухолевого материала в бок мы- ЛЛФ ФС от концентрации ФС показывает, что эта шам-самкам этой же линии. зависимость линейна до значения 0,01 мг/мл. Полу-Для перевивки LLC и АКАТОЛ опухолевую ткань ченные данные позволяют для фиксированных усло-измельчали ножницами до гомогенной консистен- вий исследования (геометрии опыта и настройки ции, добавляли среду 199 до необходимого соотно- аппаратуры) оценить среднюю концентрацию ФС шения и перевивали мышам по 0,05 и 0,1 мл полу- в биотканях по индексу флуоресценции (приняв ченной суспензии, что составляет 15 мг опухолевой плотность биоткани равной плотности воды 1 кг/л) массы, п/к и в/м соответственно [9]. и рассчитать его по формуле Исследования по накоплению ФС в опухолях С = 0,7 х I для каждой модели проводили одновременно на 2 где С — средняя концентрация ФС в биотканях отдельных группах с перевивкой п/к и в/м. Результа- (мг/кг), I — индекс флуоресценции ФС. ты усредняли и анализировали по группам. Исследо- карцинома Эрлиха (ELD) вание динамики накопления и селективности ФС ЛЛФ ФС селективно накапливается в опухоли при 2 способах перевивки позволит сравнить их и вы- как при в/м, так и при п/к перевивке. Через 5 ч после брать оптимальный для дальнейших исследований. введения обеспечивается высокое накопление ФС: В опытах использовали 3-ю генерацию каждой среднее значение концентрации ФС во в/м переви-из опухолей. В опытные группы включали по 5 животных. тых опухолях превышает 7 мг/кг, что в 1,6 раза выше

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 4'2017 том 16 | vol. 16

Оригинальные статьи 77

8 -| 7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 -0 -

10

S 9 -

u О 8 -

I m 7 -

s 6 -

Ф

Ф I 5 -

Ф u о 4 ■

u 3 -

2 -

T

1

0

1

10

100

1

10

Время после введения, ч

100

Время после введения, ч

Рис. 1. Концентрация (а) и индекс селективности накопления (б) ЛЛФ ФС в карциноме Эрлиха (ELD) при в/м (1) и п/к (2) перевивке

среднего значения концентрации в п/к перевитых опухолях (рис. 1). Индекс селективности накопления в опухоли, по сравнению с нормальной тканью, близок к 3 как при в/м, так и при п/к перевивке. Таким образом, для исследований ФДТ целесообразно использовать в/м перевитую солидную карциному Эрлиха (ELD), начиная облучение через 5 ч после в/в введения ЛЛФ ФС. Результаты исследования показывают, что концентрация ФС в опухоли при в/м перевивке быстро снижается, через 10 ч после введения уменьшаясь в 2 раза по сравнению с максимальным значением. В п/к перевитых опухолях концентрация ФС снижается медленнее: через 24 ч только на 15 %. Поскольку концентрация ФС в нормальной ткани уменьшается быстрее, значение индекса селективности к этому моменту превышает 6.

Саркома S-37

ЛЛФ ФС селективно накапливается в опухоли как при в/м, так и при п/к перевивке. При п/к перевивке через 5 ч после введения ФС среднее значение его концентрации в п/к перевитых опухолях достигает 5,3 мг/кг, в 1,8 раза превышая среднее значение концентрации, достигаемое во в/м перевитых опухолях через 7 ч после введения (рис. 2). Индекс селективности накопления в опухоли, по сравнению с нормальной тканью, при п/к перевивке составляет 4,4, при в/м перевивке — не более 2. Таким образом, для исследований ФДТ целесообразно использовать

п/к перевитую саркому S-37, начиная облучение через 5 ч после в/в введения ЛЛФ ФС.

Эпидермоидная карцинома легкого Льюис (LLC)

ЛЛФ ФС селективно накапливается в опухоли как при в/м, так и при п/к перевивке. При в/м перевивке через 7 ч после введения средняя концентрация ФС во в/м перевитых опухолях составляет 5,3 мг/кг, что в 1,5 раза больше максимального значения средней концентрации, достигаемого в п/к перевитых опухолях (рис. 3). Индекс селективности накопления в опухоли, по сравнению с нормальной тканью, близок к 4 как при в/м, так и при п/к перевивке. Результаты исследования также показывают, что концентрация ФС в опухоли при в/м перевивке уменьшается в 3—4 раза по сравнению с максимальным значением уже через 24 ч после введения ЛЛФ ФС.

Аденокарцинома толстой кишки (АКАТОЛ)

ЛЛФ ФС селективно накапливается в опухоли как при в/м, так и при п/к перевивке. Через 7 ч после введения ФС средняя концентрация ФС во в/м перевитых опухолях составляет 6,8 мг/кг, при п/к перевивке значение концентрации ФС в опухоли в 1,5 раза меньше (рис. 4). Индекс селективности накопления в опухоли по отношению к нормальной ткани в обоих случаях близок к 2. Через 24 ч после введения концентрация ФС во в/м перевитой опухоли составляет 5 мг/кг, в п/к перевитой — около 6 мг/кг, значения индекса селективности накопления — 5,2

б

6 1 5 -4 -3 -2 -1 -0 -

10

Время после введения, ч

5

4 -

I г зн

2 -1 -0

100

10

Время после введения, ч

100

Рис. 2. Концентрация (а) и индекс селективности накопления (б) ЛЛФ ФС в саркоме S-37 при в/м (1) и п/к (2) перевивке

б

а

2

а

78 Оригинальные статьи

7 и

I— 6 -

S 5-

I 4

H 3-

I-

H 2-

I

о i . ^ 1

0 -

7 -, 6 -

5 -4 -

3 -

2 -

1 -0 -

10

Время после введения, ч

100

10

Время после введения, ч

100

Рис. 3. Концентрация (а) и индекс селективности накопления (а) ЛЛФ ФС в LLC при в/м (1) и п/к (2) перевивке

8

7 -

i—

< 6 -

>

к 5 -

^

4 -

(1

т 3 -

ш

2 -

о

1

0

б

7 -|

ш

о 6 -

1- и 5 -

о

I m 4 -

s

^ ш 3 -

U

ш и 2 -

и

ш 1

а

I 0

S

10

Время после введения, ч

100

10

Время после введения, ч

100

Рис. 4. Концентрация (а) и индекс селективности накопления (б) ЛЛФ ФС в АКАТОЛ при в/м (1) и п/к (2) перевивке

и 5,8 соответственно. Через 72 ч после введения концентрация ФС уменьшается более чем в 4 раза.

Выводы

Спектрально-флуоресцентные исследования на опухолевых моделях мышей показывают, что изучаемый ФС в ЛЛФ при в/в введении селективно накапливается в опухоли.

Сравнение результатов исследований по группам показывает, что:

♦ солидную карциному Эрлиха (ELD) для обеспечения высокого накопления ФС целесообразно перевивать в/м — в этом случае через 5 ч после введения концентрация ЛЛФ ФС в опухоли составляет >7 мг/кг, в 1,6 раза превышая соответствующее значение при п/к перевивке, а индекс селективности накопления в опухоли, по сравнению с нормальной тканью, равен 3;

♦ в саркоме S-37 наиболее высокая концентрация ЛЛФ ФС при п/к перевивке достигается через 5 ч после введения и составляет 5,3 мг/кг, более чем в 1,7 раза превышая соответствующее значение при в/м перевивке, а индекс

селективности накопления в опухоли, по сравнению с нормальной тканью, достигает 4,3;

♦ LLC целесообразно перевивать в /м. При этом обеспечивается высокое накопление ЛЛФ ФС: через 7 ч после введения средняя концентрация ФС во в/м перевитых опухолях составляет 5,3 мг/кг, в 1,5 раза превышая соответствующее значение при п/к перевивке, а индекс селективности близок к 4;

♦ в АКАТОЛ при в/м перевивке средняя концентрация ЛЛФ ФС в опухоли через 7 ч после введения составляет 6,8 мг/кг, при п/к перевивке — в 1,5 раза меньше. Индекс селективности накопления в обоих случаях близок к 2. Через 24 ч после введения концентрация ФС во в/м перевитой опухоли составляет около 5 мг/кг, в п/к перевитой — около 6 мг/кг, при этом индекс селективности накопления равен 5,2 и 5,8 соответственно.

Полученные результаты позволяют выбрать оптимальный способ перевивки опухоли для экспериментальных исследований ФС на опухолевых моделях мышей и определить сроки начала проведения ФДТ.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (государственный контракт № 14.N08.12.0074).

б

а

2

2

а

Оригинальные статьи 79

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Санарова Е.В., Ланцова А.В., Оборо-това Н.А. Липосомальные системы доставки лекарственных веществ: свойства и технологические особенности получения. Биофармацевтический журнал 2014;6(4):3—13.

2. Барышников А.Ю., Борисова Л.М., Ворожцов Г.Н. и др. Фотосенсибилизатор, липосомальная форма фотосенсибилизатора и способ проведения фотодинамической терапии. Патент РФ № 2257898 от 10.08.2005.

3. Kogan EA., Meerovich GA, Torshina N.L. et al. Systemic estimation of the effect of photodynamic therapy of cancer. Proc SPIE 1997;3191. DOI: 10.1117/12.297803.

4. Meerovich G.A., Stratonnikov A.A., Loschenov V.B. et al. Different pathways of tumor damage due to PDT: the influence of parameters of laser irradiation. Proc SPIE 2001;4156. DOI: 10.1117/12.413726.

5. Meerovich G.A., Stratonnikov A.A., Loschenov V.B. et al. Influence

of parameters of laser irradiation on the mechanisms of tumor damage due to PDT. Proc SPIE 2001;4248. DOI: 10.1117/12.424441.

6. Санарова Е.В., Ланцова А.В., Полоз-кова А.П. и др. Эффективность липо-сомальной системы доставки гидрофобного противоопухолевого фотосенсибилизатора Тиосенса. Российские нанотехнологии 2015;10(5—6): 136-43. DOI: 10.1134/ S1995078015030143.

7. Sanarova E., Meerovich I., Lantsova A. et al. Thiosens liposomal dosage form technology development and photodynamic efficiency assessment.

J Drug Deliv Sci Tech 2014;24(4):315-9. DOI: 10.1016/S1773-2247(14)50068-8.

8. Большаков О.П., Незнанов Н.Г., Ба-баханян Р.В. Дидактические и эти-

ческие аспекты проведения исследований на биомоделях и лабораторных животных. Качественная клиническая практика 2002:1:58-61.

9. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. Под ред. З.П. Софьиной, А.Б. Сыркина, А. Голдина, А. Кляйна. М.: Медицина, 1980. С. 71-112.

10. Savel'eva T.A., Ryabova A.V., Andreeva I.V. et al. Combined spectroscopic method for determining the fluorophore concentration in highly scattering media. Bulletin of the Lebedev Physics Institute 2011;38(11):334-8. DOI: 10.3103/ S1068335611110042.

11. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть I. Под ред.

А.Н. Миронова. М.: Гриф и Ко, 2012. 664 с.