CC BY
68
УДК 612.014.44:577.352.2:616-006
D.G. Gurevich1'2,1.G. Meerovich1, G.A. Meerovich3, S.I. Vorobyov4, V.G. Pevgov5, Z.S. Smirnova1, N.A. Oborotova1, E.A. Lukyanets6, A.Yu. Baryshnikov1
INFLUENCE OF VESICLE SIZE DISTRIBUTION ON LEVEL AND SELECTIVITY OF ACCUMULATION OF LIPOSOMAL PHOTOSENSITIZER TIOSENS IN TUMOR
IN.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Moscow 2I.M. Sechenov Moscow Medical Academy, Moscow 3A.M. Prokhorov General Physics Institute of RAS, Moscow 4M.V. Lomonosov Moscow State Academy of Fine Chemical Technology, Moscow 5M.V. Khrunichev State Scientific&Production Space Center, Moscow 6State Research Center «NIOPIK», Moscow
ABSTRACT
. Current work was performed to estimate the influence of liposomal size distribution on the level and selectivity of accumulation of long-wavelength photosensitizer Tiosens (liposomal form of aluminium hydroxide phenyl-thiophthalocyanine) in tumor. Tiosens liposome dispersions were prepared using classic Bangham procedure. Particle size was reduced and unified using Avanti Mini-Extruder equipped with Nucleopore membranes and high-pressure homogenizer «Donor-1». Liposomal size distribution was determined by means of laser correlation spectroscopy. Dynamics and selectivity of Tiosens accumulation in Erlich tumor were measured in vivo using fluorescence spectroscopy. It was shown that level and selectivity of accumulation of liposome-encapsulated drug is determined mostly by content of small-sized fractions, while fractions of larger size are quickly cleared from blood by RES and not contribute in photosensitizer accumulation.
Key words: selectivity of accumulation, photosensitizer, liposomes, tumor neovascularization.
Д.Г. Гуревич1'2, И.Г. Меерович1, Г.А. Меерович3, С.И. Воробьев4, В.Г. Певгов5^ З.С.Смирнова , Н.А. Оборотова , Е.А. Лукьянец , А.Ю. Барышников
ВЛИЯНИЕ РАЗМЕРОВ ЛИПОСОМ НА УРОВЕНЬ И СЕЛЕКТИВНОСТЬ НАКОПЛЕНИЯ ТИОСЕНСА В ОПУХОЛИ
1 НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН,
2 ММА им. И.М. Сеченова, 3 ЦЕНИ ИОФ им. А.М. Прохорова РАН, 4 МИТХТ им. М.В. Ломоносова,
5 ГКНПЦ им. М.В.Хруничева, 6 ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»
РЕЗЮМЕ
В настоящей работе исследовалось влияние размеров липосом на уровень и селективность накопления в опухоли длинноволнового фотосенсибилизатора тиосенс (липосомальной формы фенилтиофталоцианина алюминия гидроксида). Липосомальную дисперсию тиосенса готовили методом Бенгема. Уменьшение размеров липосом проводили на ручном экструдере Avanti Mini-Extruder и на экструдере высокого давления «Донор-1». Размеры липосом определяли методом лазерной корреляционной спектроскопии. Уровень и селективность накопления тиосенса в опухоли Эрлиха оценивали in vivo лазерно-флюоресцентным методом. В результате эксперимента показано, что накопление липосомального препарата определяется в основном фракциями с более мелкими липосомами. Крупные липосомы быстрее выводятся из плазмы крови за счет поглощения ретикулоэндотелиальной системой и не вносят существенного вклада в накопление фотосенсибилизатора.
Ключевые слова: селективность накопления, фотосенсибилизатор, липосомы, неоваскуляризация опухолей.
ВВЕДЕНИЕ
Одними из основных факторов, определяющих эффективность фотодинамической терапии (ФДТ) и флюоресцентной диагностики, являются уровень и селективность накопления фотосенсибилизаторов (ФС) в опухоли [3]. Эти характеристики также определяют вероятность поражения здоровых тканей и органов, прилегающих к патологическому очагу, и кожную фототоксичность ФС. С другой стороны, они в значительной мере влияют на выбор дозы вводимого препарата и лазерного облучения.
В последние годы существенно возрос интерес к наноструктурным системам доставки препаратов [8]. При разработках ФС наиболее активно проводятся работы по созданию липосомальных и мицеллярных лекарственных форм ФС.
В литературе подробно обсуждаются механизмы селективного накопления наноструктурных ФС в опухоли. Одним из возможных механизмов их накопления считают проникновение нанопрепаратов через дефекты новообразованных сосудов опухолей [6; 7; 9; 10]. Эти дефекты имеют размеры от сотен нанометров до нескольких микрон. Например, для карциномы молочной железы мышей МСа-1У характерно наличие дефектов диаметром 1200-2000 нм, для опухоли молочной железы SЫonogi - 200-380 нм, для карциномы толстой кишки LS 174Т - 400-600 нм [6]. На рис. 1 приведена микрофотография дефектов сосудов карциномы толстой кишки LS 174Т1.
Экспериментальное подтверждение механизма проникновения липосом в опухолевую ткань было получено в работе О. Ishida е! а1. [7]. На рис. 2 представлена микрофотография, полученная методом растровой электронной микроскопии, где отчетливо наблюдается повышенное накопление липосом вблизи дефекта в сосуде опухоли.
Естественно ожидать, что уровень и селективность накопления ФС в опухоли будет зависеть от диаметра наночастиц в препарате и его соотношения с размерами дефектов сосудов. В ряде работ изучалось влияние размеров липосом на уровень накопления препарата в опухолях [4; 5; 7]. В этих работах было показано, что наиболее высокий уровень накопления препаратов характерен для наночастиц размером от 90 [4] до 160-220 нм [5]. Кроме того, уровень накопления зависит и от других факторов, в частности, от типа опухоли и характерных для ее сосудов дефектов. В связи с этим для оптимизации методических и технологических подходов при изучении новых наноструктурных противоопухолевых препаратов, в частности, липосомальных ФС, представляется важным экспериментально оценить на выбранных моделях опухолей влияние размеров липосом на уровень и селективность накопления ФС.
Цель настоящей работы - исследовать влияние размеров липосом на уровень и селективность накопления в опухоли длинноволнового фотосенсибилизатора тиосенс [1] (липосомальной формы фенилтиоф-талоцианина алюминия гидроксида [(PhS)4PcA1OH]).
Рис. 1. Дефекты выстилающего слоя сосудов человеческой карциномы толстой кишки LS 174^:
Поры в стенке сосуда обозначены стрелкам. Микрофотография с растрового электронного микроскопа, увеличение в 360 раз [6].
Рис. 2. Проникновение липосом через пору в сосуде опухоли:
Черными стрелками обозначен дефект в стенке сосуда, белыми - скопление липосом. Микрофотография с растрового электронного микроскопа, увеличение в 14 000 раз [7].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Липосомы на основе лецитина E PC S (Lipoid, Германия), холестерина (Sigma, Япония), mPEG-2000-фосфатидилэтаноламина (Lipoid, Германия) и субстанции [(PhS)4PcAlOH] (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК») готовили методом Бенгема. Субстанцию ФС вводили в липидный бислой. Молярное соотношение липидов
составило 17:4:1, соотношение «общий ли-
пид:фталоцианин» - 265:1.
Уменьшение размеров липосом обеспечивалось экструзионным методом: на экструдере высокого давления «Донор-1» c твердосплавной фильерой в течение 30 мин при давлении 500 атмосфер и методом ручной экструзии через мембраны Nucleopore (Whatman, США) с диаметром пор 0,2 мкм на экструдере Avanti Mini-Extruder (Avanti Lipids, США).
Размеры липосом определяли методом лазерной корреляционной спектроскопии.
Уровень и селективность накопления тиосенса в опухоли оценивали in vivo лазерно-флюоресцентным методом с использованием волоконного спектроанализатора «ЛЭСА-01-Биоспек» («Биоспек», Россия). Уровень накопления ФС выражался в условных единицах (усл. ед.) и оценивался по интегральной интенсивности его флюоресценции путем сравнения ее с интенсивностью флюоресценции фталоцианин-содержащего полимерного образца с известной концентрацией фтало-цианина, сопоставимой с терапевтической концентрацией, и оптическими характеристиками рассеивания, близкими к свойствам человеческих тканей. Селективность накопления тиосенса рассчитывалась как отношение интенсивности флюоресценции препарата в опухоли и в здоровой ткани и выражалась в виде индекса селективности [2]. Исследования проводились на мышах Fi [С57В1/6хСВА] с опухолью Эрлиха, перевитой внутримышечно в голень правой задней лапы. Ли-посомальную дисперсию вводили в хвостовую вену в дозах 4 мг/кг и 6 мг/кг массы тела животных на 6-й день после перевивки опухоли.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В работе сравнивались уровни накопления липо-сомальной дисперсии тиосенса с липосомами различных размеров.
После измельчения липосомальной дисперсии на экструдере «Avanti» получили 2 образца с размером липосом 425±25 нм и 105±5 нм. Препарат вводили внутривенно в дозе 4 мг/кг массы тела животного, измерения проводились через 3 ч после введения. Как видно из рис. 3, липосомы небольшого размера (105±5 нм) обеспечивают значительные уровень (2,15 усл. ед.) и селективность накопления (2,4) тиосенса в опухоли. При больших размерах липосом (425±25 нм) селективного накопления фотосенсибилизатора в опухоли не происходит: уровень накопления ФС в нормальной ткани (1 усл. ед.) превышает уровень накопления в опухоли (0,8 усл. ед.)
Для другого опыта приготовили 2 липосомаль-ные дисперсии. В дисперсии № 1, измельченной на промышленном экструдере «Донор-1», основной размер липосом составил 76 нм. В дисперсии № 2, полученной при помощи ручного экструдера «Avanti», размер липосом составил 446 нм и 183 нм (соотношение 1:3). Обе липосомальные дисперсии тиосенса вводили животным внутривенно в дозе
6 мг/кг массы тела мышей.
| ШЯ ГТЯ
и ------ ------------
■4яи»ич ИЩ-ИОИ»
ГлННПЛ ШГ1[Н'[рМ
Рис. 3. Уровень накопления тиосенса в опухоли Эрлиха (1) и нормальной ткани (2) через 3 ч после внутривенного введения его липосомальной формы в дозе 4 мг/кг веса
На рис. 4, А и Б, показан уровень накопления тио-сенса в опухоли (1) и нормальной ткани (2) для мелких (дисперсия № 1) и крупных (дисперсия № 2) ли-посом соответственно.
Как видно из рис. 4, А, уровень накопления тио-сенса при введении дисперсии № 1 растет в течение 3 ч после введения, интенсивность флюоресценции достигает максимального значения 3,2 усл. ед. Далее интенсивность флюоресценции постепенно снижается и к 168-му часу составляет 1,4 усл. ед. Уровень накопления тиосенса в нормальной ткани через 3 ч составляет 0,9 усл. ед., через 168 ч - 0,3 усл. ед.
Уровень накопления тиосенса при введении липосо-мальной дисперсии № 2 (рис. 4, Б) также растет в течение
3 ч. В опухоли через 3 ч после введения уровень накопления составил 1,1 усл. ед., через 168 ч - 0,7 усл. ед., в нормальной ткани - 0,4 усл. ед. через 3 ч после введения и 0,1 усл. ед. через 168 ч после введения (см. таблицу).
Таким образом, уровень накопления тиосенса при введении дисперсии № 1 через 3 ч оказывается почти в 3 раза выше, чем при введении дисперсии № 2. Это позволяет сделать предварительный вывод о том, что при введении липосомальных дисперсий, содержащих липосомы разных размеров, накопление липосомаль-ного препарата определяется в основном фракциями с более мелкими липосомами.
На рис. 5 представлен индекс селективности тио-сенса при введении липосомальных дисперсий № 1 (А) и № 2 (Б).
Селективность накопления тиосенса через 3 ч после введения дисперсии № 1 составляет 3,5, а дисперсии № 2 - 2,7. Через 96 ч селективность накопления обеих дисперсий примерно равна 6,5.
ВЫВОДЫ
Полученные результаты показывают, что высокий уровень и селективность накопления липосомальной дисперсии тиосенса определяются в основном количественным содержанием мелких липосом. По нашим оценкам, оптимальный размер составляет около 100 нм. Более крупные липосомы менее эффективно проникают
Уровень накопления липосомальных дисперсий тиосенса
Дисперсия Уровень накопления, усл. ед.
Через 3 ч после введения Через 168 ч после введения
Опухоль Нормальная ткань Опухоль Нормальная ткань
№1 3,2 0,9 1,4 0,3
№2 1,1 0,4 0,7 0,1
1 № 100 1000 і ю 100 (ООО
Рис. 4. Уровень накопления тиосенса при введении липосомальных дисперсий из расчета 6 мг/кг массы тела:
А - дисперсия № 1, основной размер липосом 76 нм;
Б - дисперсия № 2, липосомы размером 446 и 183 нм в соотношении 1:3.
ї
і
• <'
1 ]« КО) 1 16 1(1) 1000
ЯГН'Ш.ЧЛГ-Ц Р'Г МИ, Ч 1,1 н
Рис. 5. Индекс селективности тиосенса при введении липосомальных дисперсий из расчета 6 мг/кг массы тела:
А - дисперсия № 1, основной размер липосом 76 нм;
Б - дисперсия № 2, липосомы размером 446 и 183 нм в соотношении 1:3.
через дефекты сосудов опухолей, а также быстрее выводятся из плазмы крови за счет поглощения ретикулоэн-дотелиальной системой и не вносят существенного вклада в накопление фотосенсибилизатора.
В дальнейшем планируется продолжить исследования накопления и эффективности ФДТ с использованием гомогенных липосомальных дисперсий тио-сенса, отличающихся размером липосом, что позволит уточнить оптимальный диапазон их размеров и надлежащим образом выбрать технологию промышленной экструзии этого фотосенсибилизатора.
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства г. Москвы в рамках научнотехнической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний».
Работа канд. биол. наук И.Г. Мееровича поддержана грантом Президента Российской Федерации для молодых ученых МК-6258.2006.4.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барышников А.Ю., Борисова Л.М., Ворожцов Г.Н. и др. Фотосенсибилизатор, липосомальная форма фотосенсибилизатора и способ проведения фотодина-мической терапии // Патент РФ №2257898 от 10 августа 2005 г. с приоритетом от 22 марта 2004 г.
2. Смирнова З.С., Меерович И.Г., Лукьянец Е.А. и др. Фенилтиозамещенные фталоцианины - новые фотосенсибилизаторы ближнего инфракрасного диапазона // РБЖ. - 2004. - Т. 3, № 1. - Р. 54-60.
3. Awasthi V.D., Garcia D., Goins B.A., Phillips W.T. Circulation and biodistribution profiles of long-circulating PEG-liposomes of various sizes in rabbits // International Journal of Pharmaceutics. - 2003. -253. - Р. 121-32.
4. Boerman O.C., Oyen W.J.G., van Bloois L. et al. Optimization of Technetium-99m-Labeled PEG Liposomes to Image Focal Infection: Effects of Particle Size and Circulation Time // J. Nucl. Med. - 1997. - № 38. - Р. 489-93.
5. Dougherty T.J., Gomer J.C., Henderson B.W. et al. Photodynamic therapy // J. Natl. Cancer Inst. - 1998. -Vol. 90, № 12. - P. 889-905.
6. Hashizume H., Baluk P., Morikawa Sh. et al. Openings between Defective Endothelial Cells Explain
Tumor Vessel Leakiness // American Journal of Pathology. - 2000. - Vol. 156, № 4. - P. 1363-80.
7. Ishida O., Maruyama K., Sasaki K., Iwatsuru M. Size-dependent extravasation and interstitial localization of polyethyleneglycol liposomes in solid tumor-bearing mice // International Journal ofPharmaceutics. - 1999 -№ 190 - Р. 49-56.
8. Nishiyama N., Arnida, Jang W.D. et al. Photochemical enhancement of transgene expression by polymeric micelles incorporating plasmid DNA and den-drimer-based photosensitizer // J. Drug Target. - 2006. -Vol. 14, № 6. - P. 413-24.
9. Schmitt-Sody M., Strieth S., Krasnici S. et al. Ne-ovascular Targeting Therapy: Paclitaxel Encapsulated in Cationic Liposomes Improves Antitumoral Efficacy // Clinical Cancer Research. - 2003. - P. 2335-41.
10. Wu N.Z., Da D., Rudoll T.L. et al. Increased Microvascular Permeability Contributes to Preferential Accumulation of Stealth Liposomes in Tumor Tissue // Cancer Research. - 1993. - № 53. - P. 3765-70.
Поступила 23.11.2006.
