CC BY
41
УДК 615.011:577.115:615.831.011
Z.S.Smirnova1, I. Yu.Kubasova1, О.A.Makarova1, A.P.Polozkova1, O.L.Orlova1, N.A.Oborotova1,
G. A. Meerovich2, G. K. Gerasimova1, E. A. Lukyanetz3,
S. G. Kuz ’min3, G. N. Vorozhtsov3
PRECLINICAL STUDY OF EFFICIENCY OF THE LIPOSOMAL DRUG FORMULATION OF PHOTOSENS FOR PHOTODYNAMIC THERAPY
1 N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow 2 Natural Sciences Center of A.M. Prokhorov General Physics Institute RAS, Moscow
3 State Research Center «NIOPIK», Moscow
ABSTRACT
This work is devoted to (the) pre-clinical investigation of the photodynamic activity of the liposomal form (LF) of the Russian second generation sensitizer Photosense based on sulphonated aluminium phthalocyanine derivatives. Efficiency of Photosense LF investigated on Ehrlich tumor mice. The therapeutic doze of the liposomal form of PS was 1 mg/kg, which gives efficiency corresponding to 4 mg/kg doze of the 0,2% solution form (tumor growth inhibition was 75-80% and 10-16% respectively). Accumulation of the liposomal form of PS at a therapeutic doze in the skin is decreased comparing to the 0.2% solution of PS at same dose. Also it’s found out that photodynamic efficiency of the lyophilized liposomal form of PS is not less than the photodynamic activity of the liposomal form of PS prepared ex tempore. Selectivity index of the liposomal form PS prepared ex tempore is 1.3-1.5 higher comparing to such of 0,2% solution of PS.
Key words: Photosense, Photodynamic therapy, selectivity accumulation.
3.C.Смирнова1, И.Ю.Кубасова1, О.А.Макарова1, А.П.Полозкова1, О.Л. Орлова1, Н.А.Оборотова1, Г.А.Меерович2, Г.К.Герасимова1 , Е.А.Лукъянец3,
С. Г. Кузьмин3, Г. Н. Ворожцов3
ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ФОТОСЕНСА ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ
1 ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2 ЦЕНИ ИОФ им. А.М. Прохорова РАН, Москва 3 ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», Москва
РЕЗЮМЕ
Данная работа посвящена доклиническому изучению фотодинамической активности отечественного фотосенсибилизатора второго поколения Фотосенса в новой липосомальной лекарственной форме. Эффективность липосомальной лекарственной формы Фотосенса изучали на мышах с опухолью Эрлиха. Установлено, что терапевтическая доза липосомальной лекарственной формы Фотосенса составляет 1 мг/кг (ТРО=75-80 %), которая соответствует по эффективности дозе 4 мг/кг его 0,2 % -ного раствора (ТРО=70-76 %). В терапевтической дозе выявлено снижение уровня накопления Фотосенса в коже при его введении в липосомальной лекарственной форме по сравнению с 0,2 %-ным раствором в той же дозе. Установлено, что лиофилизированная липосомальная лекарственная форма Фотосенса не уступает по фотодинамической активности липосомальной дисперсии, приготовленной ex tempore. Индекс селективности липосомальной лекарственной формы Фотосенса, приготовленной ex tempore, превосходит в 1,3-1,5 раза индекс селективности его 0,2 %-ного раствора.
Ключевые слова: Фотосенс, фотодинамическая терапия, селективное накопление.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время для фотодинамической терапии опухолей (ФДТ) широко применяется отечественный фотосенсибилизатор второго поколения Фотосенс, являющийся смесью натриевых солей сульфированного фта-лоцианина алюминия, синтезированный в ГУЛ «ГНЦ «НИОПИК» [4-6]. Метод ФДТ с Фотосенсом разрешен к применению при раке желудка, кожи, нижней губы, опухолей слизистой оболочки полости рта, языка, при подкожных и внутрикожных метастазах рака молочной железы. Однако при проведении ФДТ высокая терапевтическая эффективность Фотосенса сопровождалась высокой кожной чувствительностью к прямому солнечному свету, обусловленной удерживанием препарата в коже в течение длительного времени. При нарушении светового режима в первые недели после введения Фотосенса в дозе 2-2,5 мг/кг массы тела у больных наблюдались ожоги в 61,7 % случаев и дерматиты различной степени выраженности в 16,7 % случаев [1]. Прием высоких доз антиоксидантов и снижение дозы вводимого Фотосенса до 0,5 мг/кг позволили уменьшить количество кожных осложнений до 34,4 %.
Для снижения кожной токсичности Фотосенса изучали возможность создания более рациональной лекарственной формы. Известно, что распределение лекарственного вещества в организме возможно целенаправленно изменять как на клеточном, так и на тканевом уровне, используя различные системы направленной доставки лекарственных веществ. Основная задача транспортных систем—это изменение пассивного распределения, характерного для лекарственного вещества в организме, с целью концентрации его в опухолевой зоне. В настоящее время липосомы можно рассматривать как перспективную систему доставки гидрофильных и гидрофобных препаратов благодаря своим коллоидным свойствам, контролируемым составом, размером и поверхностным характеристикам, позволяющим моделировать программу распределения и доставки препарата [3].
Сравнительная фармакокинетика липосомального фотосенсибилизатора была изучена на примере гемато-порфирина (Нр), включенного в водное пространство липосом из дипальмитоилфосфатидилхолина (БРРС) [7; 9 ]. У мышей с фибросаркомой МБ-2 определяли уровень накопления Нр в опухоли и некоторых нормальных тканях. Не смотря на то, что липосомальный Нр накапливался в опухоли медленнее, чем свободный препарат, его максимальная концентрация в опухоли была вдвое выше, а концентрация в коже более низкой, чем у Нр. Примечательно, что концентрации в печени были одинаковыми для обеих форм препарата.
Интересные результаты были получены для фта-лоцианина Ъп. (2пРс), включенного в липидную мембрану липосом различного состава на мышах с фибросаркомой МБ-2. Уровень накопления ХпРс в БРРС липосомах в дозе 0,12 мг/кг в опухоли через 24 ч после его введения был в 4 раза выше, чем в окружающих тканях. При введении препарата в липосомах из паль-митоилолеоилфосфатидилхолина и диолеоилфосфати-дилсерина наблюдали увеличение селективности накопления 2пРс. В этом случае через 48 ч после введения концентрация препарата в опухоли была в 10 раз выше, чем в нормальных тканях [10].
На мышах с карциномой Эрлиха, перевитой внутримышечно, а также на мышах с меланомой В16, перевитой подкожно, было изучено распределение липосомального гп(П)-фталоцианина в опухолевой ткани [8]. Методом флюоресцентной микроскопии было показано, что препарат накапливался быстрее в опухоли Эрлиха, чем в меланоме. Это вероятнее всего можно объяснить большей степенью васкуляризации опухоли Эрлиха по сравнению с меланомой.
Таким образом, можно считать липосомальные препараты фотосенсибилизаторов перспективными для повышения эффективности ФДТ.
С учетом вышесказанного были получены липосомы Фотосенса. Целью настоящего исследования явилось доклиническое изучение фотодинамической активности липосомальной лекарственной формы (ЛЛФ) Фотосенса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Липосомы получены путем редиспергирования тонкой липидной пленки, образованной упариванием в вакууме на роторном испарителе спиртового раствора липидов, раствором фотосенса с добавлением криопротекторов (маннит, сахароза, декстран). Средний размер липосом измеряли на приборе Submicron Particle Sizer NICOMP-380. Диаметр визикул в ЛЛФ после экструзии через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 100 нм на приборе Mini-Extruder составлял в среднем 200 нм.
Возбуждение флюоресценции осуществлялось He-Ne лазером с длиной волны 675 нм. Уровень накопления Фотосенса в коже и опухоли определяли спектрально-флюоресцентным методом по интенсивности флюоресценции (у.е.) препарата [2 ]. Селективность накопления Фотосенса при введении его в различных лекарственных формах рассчитывали как соотношение между значениями интенсивности флюоресценции препарата в опухоли и нормальной ткани (коже).
Эффективность ФДТ оценивали на опухоли Эрлиха. Ее перевивали мышам-гибридам первого поколения F1 внутримышечно в область бедра асцитной жидкостью по 0,1 мл, содержащей 500 тыс. опухолевых клеток. На 5-6-й день после перевивки, когда размер опухолевого узла составлял 1000-1500 мм3, ЛЛФ и 0,2 %-ный раствор Фотосенса вводили мышам однократно внутривенно в дозах 4 и 1 мг/кг. Облучение проводили через 24 ч после введения препаратов лазером ЛФТ-630/670-01через кожные покровы в типичных параметрах облучения для работы с Фотосенсом: длина волны 675 нм, доза облучения 90-290 Дж/см2, время облучения 8-15 мин. Оценку эффективности ФДТ проводили по торможению роста опухоли Эрлиха (ТРО, %) в разные сроки наблюдения.
Торможение роста опухоли (ТРО) вычисляли по формуле:
ТРО (%) = (VK - V0)l VK X юо,
где: F — средний объем опухолей в контрольной группе (ммЗ);
Vo — федний объем опухолей в опытной группе (мм3).
Опытные группы формировали из 5-6 мышей, а контрольную группу—из 8-10 особей.
Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу Фишера-Стьюдента. Разницу считали достоверной при р < 0, 05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
На первом этапе доклинического изучения новой ЛЛФ Фотосенса исследовали ее фотодинамическую активность в зависимости от дозы препарата в сравнении с 0,2 %-ным раствором Фотосенса (табл. 1).
Терапевтический эффект ЛЛФ Фотосенса в дозе 4 мг/кг не отличался от противоопухолевого действия
0,2 %-ного раствора препарата в той же дозе (ТРО = 70 % и 76 % соответственно). В то же время фотодина-мическая активность ЛЛФ Фотосенса в дозе 1 мг/кг статистически достоверно превосходила терапевтическую эффективность его 0,2 % -ного раствора в дозе 1 мг/кг (ТРО = 80 % и 59 % соответственно).
Параллельно с целью оценки вероятности кожной токсичности изучали уровень накопления Фотосенса в ЛЛФ и 0,2 %-ном растворе в коже в зависимости от дозы в течение 168 ч (см. рисунок).
Через 20 ч после однократного внутривенного введения ЛЛФ Фотосенса в дозе 4 мг/кг уровень накопле-
ния препарата в коже ниже, чем после введения его 0,2 %-ного раствора. К 7-му дню наблюдения (168 ч) достоверных различий в уровне накопления ФС в коже при введении его в ЛЛФ и 0,2 %-ном растворе в дозе 4 мг/кг не выявлено. В то же время при введении ЛЛФ в дозе 1 мг/кг через 168 ч в коже в 1,6 раза снижен уровень накопления Фотосенса по сравнению с его 0,2 %-ным раствором в той же дозе (р( 0,05).
На втором этапе доклинического изучения фото-динамической активности ЛЛФ Фотосенса исследования были продолжены в плане оценки способа хранения липосомального препарата. Наиболее эффективным является хранение липосом в лиофилизированном виде. Для достижения максимальной стабилизации липосом во время замораживания и лиофильной сушки изучали действие различных криопротекторов, введенных во внутреннюю и внешнюю водные фазы липосом. В качестве криопротекторов были использованы маннит, сахароза и декстран.
Как видно из табл. 2, при изучении фотодинами-ческой эффективности на опухоли Эрлиха не выявлено разницы при использовании ЛЛФ Фотосенса, в состав которой входили маннит или сахароза (максималь-
Таблица 1
Эффективность фотодинамической терапии с использованием ЛЛФ и 0,2 -ного% раствора Фотосенса на опухоли Эрлиха
Доза, мг/кг ТРО, %
Лекарственная форма Дни после проведения ФДТ
13 17 21 24
ЛЛФ 4 52* 62* 67* 70*
1 47* 54* '-
0,2 %-ный раствор 4 50* 59* 70* 76*
1 47 50* 54* 59*
* р < 0,05 по отношению к контролю; ** р < 0,05 по отношению к 0,2 %-ному раствору Фотосенса в дозе 1 мг/кг.
Облучение лазером проводили через 24 ч после введения препаратов; доза облучения 90 Дж/см2, время облучения 10 мин
« 2,5
1 2 & О £Г 1 5
о Рч о 2 1 1
Я 0,5 О СО о £ о
111 I И -
2,5
20
48
■ ■
168
Часы
□ ЛЛФ - 1 мг/кг; ■ ЛЛФ - 4 мг/кг, □ ФС -1 мг/кг; ■ ФС - 4 мг/кг
Динамика изменения уровня накопления ЛЛФ Фотосенса в коже в сравнении с его раствором в течение 168 часов (7 суток) после введения препаратов
Таблица 2
Влияние криопротекторов на эффективность ЛЛФ Фотосенса, опухоль Эрлиха
Лекарственная форма ТРО, %
Криопротектор Дни после проведения ФДТ
15 20 26
ЛЛФ Маннит 68 75 81
И Сахароза 73 87 82
а Декстран 43* 66 69
0,2 %-ный раствор - 67 77 82
* р > 0,05 по отношению к контролю. Для остальных значений ТРО р < 0,05 по отношению к контролю. Облучение лазером проводили через 24 ч после введения препаратов; доза облучения 290 Дж/см2, время облучения 18 мин. ЛЛФ Фотосенса готовили ex tempore. Доза препарата во всех лекарственных формах = 1 мг/кг.
Таблица 3
Влияние криопротектора на селективность накопления ЛЛФ Фотосенса, опухоль Эрлиха
Лекарственная форма Криопр отектор Уровень накопления, у.е. Индекс селективности
опухоль кожа
ЛЛФ Маннит 0,54 0,14 4,1
Сахароза 0,72 0,19 3,8
Декстран 0,74 0,18 4,1
0,2 % раствор - 0,55 0,2 2,8
ное ТРО = 81% и 87%, соответственно) в сравнении с раствором Фотосенса (ТРО = 82%). В то же время ЛЛФ Фотосенса, содержащая декстран, несколько уступала по эффективности другим составам липосом: максимальное ТРО составляло 69 %.
В этом же опыте изучали селективность накопления ЛЛФ Фотосенса сразными криопротекторами (как соотношение интенсивности флюоресценции препарата в опухоли икоже) по сравнению с 0,2%-нымраствором (табл.З).
Показано, что уровень накопления в опухоли ЛЛФ Фотосенса, содержащей сахарозу и декстран, несколько выше, чем уровень накопления в опухоли ЛЛФ,
Таблица 4
Эффективность липосомальной дисперсии Фотосенса, приготовленной ex tempore и ее лиофилизата в дозе 1 мг/кг, опухоль Эрлиха
Препарат ТРО, %
Дни после проведения ФДТ
15 20 26
Дисперсия 64 72 80
Лиофилизат 73 82 87
Все значения ТРО статистически достоверны (р< 0,05). Облучение лазером проводили через 24 ч после введения препаратов; доза облучения 290 Дж/см2, время облучения 18 мин.
В качестве криопротектора в лекарственной форме использовали сахарозу.____________________________
содержащей маннит. Но при этом индекс селективности ЛЛФ Фотосенса всех составов, приготовленной ех tempore, превосходит в 1,3-1,5 раза индекс селективности 0,2 %-ного раствора Фотосенса.
Чтобы оценить влияние процесса лиофилизации на эффективность ЛЛФ Фотосенса, провели сравнительные исследования липосомальной дисперсии, приготовленной ex tempore, и ее лиофилизата.
Как видно из табл. 4, терапевтическая эффективность ЛЛФ Фотосенса после лиофилизации не снизилась, и максимальное ТРО составляет 87 % и 80 % соответственно.
ВЫВОДЫ
1. После однократного внутривенного введения ЛЛФ Фотосенса в дозе 4 мг/кг в течение первых 20 ч уровень накопления препарата в коже ниже, чем после введения его 0,2 %-ного раствора.
2. После однократного внутривенного введения ЛЛФ Фотосенса в дозе 1 мг/кг выявлено снижение уровня накопления препарата в коже через 168 ч (7-е сутки) по сравнению с 0,2 %-ным раствором препарата в той же дозе.
3. Индекс селективности ЛЛФ Фотосенса превосходит в 1,3-1,5 раза индекс селективности его 0,2 %-ного раствора.
4. Фотодинамический эффект ЛЛФ Фотосенса в дозе 1 мг/кг равен терапевтическому действию 0,2%-ного раствора препарата в дозе 4 мг/кг (ТРО = 70-80%).
5. Лиофилизированная ЛЛФ Фотосенса не уступает по фотодинамической активности липосомальной дисперсии препарата, приготовленной ex tempore.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вакуловская Е.Г., Шенталь В.В. Фотодинамическая терапия и флюоресцентная диагностика у больных раком кожи головы и шеи // Материалы VI Российской онкологической конференции, Москва, 26-28 ноября 2002. — С.44-45.
2. Киселев Г.Л., Лощеное В.Б. Распространение лазерного излучения в биологической ткани при фотодинамичес-кой терапии и диагностике // Рос. Хим. журн. — 1998.
— Т. ХШ, № 5. — С. 53-63.
3. Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Липосомальные лекарственные формы в клинической онкологии // Успехи современной биологии. — 2001. — Т. 121, № 5. — С. 464-475.
4. Соколов В.В., Фгтоненко Е.В., Карпова Е. С. и др. II Материалы 2-го Всероссийского симпозиума «Фотодинамическая терапия злокачественных новообразований», Москва, 1997. — С. 24-25.
5. Чиссов В.И., Соколов В.В., Филоненко Е.В. и др. Современные возможности и перспективы эндоскопической хирургии и фотодинамической терапии злокачественных
опухолей // Рос. Онкол. журн. — 1998. — № 4. — С. 4-12.
6. Чиссов В.И., Соколов В.В., Филоненко Е.В. Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей. Краткий очерк развития и опыт клинического применения в России //Рос. Хим. журн. — 1998. — Т. XLII, № 5. — С. 5-9.
7. Jori G., Reddy Е., Cozzani I., Tomio L. Controlled targeting of different subcellular sites by porphyrins in tumour-bearing mice//Br. J. Cancer. —1986. —Vol. 53. —P. 615-621.
8. Love W.G., Duk S. et al. Liposome-mediated delivery of photosensitizers: localization of Zinc(II)-phthalocyanine within implanted tumors after intravenous administration // Photochem. Photobiol. —1996. — Vol. 63, № 5. —P.656-661.
9. Reddi E, Zhou C. et al. Liposome- or LDL-administered Zn(II)-phthalocyanine as a photodynamic agent for tumors. I. Pharmacokinetic properties and phototherapeutic efficiency // Br. J. Cancer. — 1990. — Vol. 61.—P. 407-411.
10. Reddi E., Zhou C., et al. Liposome- or LDL-administered Zn(II)-phthalocyanine as a photodynamic agent for tumors. III. Effect of cholesterol on pharmacokinetic and phototherapeutic properties // Lasers Med. Sci. — 1990.
— Vol. 5,—P. 339-343.
